配列表の参照 本出願は、配列表とともに電子書式で出願されている。M308_PCTSQLST.txtと題される配列表ファイルは、2013年3月9日に作成され、67,238,216バイトの大きさである。この配列表の電子書式での情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
関連出願の相互参照 本出願は、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,742号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Oncology−Related Proteins and Peptides」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,224号、表題「Terminally Optimized Modified RNAs」、2012年12月14日出願の国際出願第PCT/US2012/069610号、表題「Modified Nucleoside,Nucleotide,and Nucleic Acid Compositions」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,862号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Biologics」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,645号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Biologics」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,130号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Biologics」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,866号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,647号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,134号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Antibodies」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,868号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,648号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,135号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Vaccines」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,870号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,649号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,139号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Therapeutic Proteins and Peptides」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,873号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,650号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,147号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,878号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,654号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,152号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Plasma Membrane Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,885号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,658号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,155号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,896号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年7月5日出願の米国仮特許出願第61/668,157号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,661号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,160号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Intracellular Membrane Bound Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,911号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,667号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,168号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,922号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,675号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,174号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,935号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,687号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,184号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,945号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,696号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,191号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,953号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,704号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,203号、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,961号、表題「Dosing Methods for Modified mRNA」、2012年5月17日出願の米国仮特許出願第61/648,286号、表題「Dosing Methods for Modified mRNA」に対する優先権を主張するものであり、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2012年10月3日出願の国際公開第PCT/US2012/58519号、表題「Modified Nucleosides,Nucleotides,and Nucleic Acids,and Uses Thereof」、および2012年12月14日出願の国際公開第PCT/US2012/69610号、表題「Modified Nucleoside,Nucleotide,and Nucleic Acid Compositions」にも関連する。
本出願は、同時係属出願にも関連し、それぞれ、2013年3月9日に本出願と共に同時に出願され、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease」の代理人整理番号M300.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins」の代理人整理番号M304.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins」の代理人整理番号M305.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins」の代理人整理番号M306.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」の代理人整理番号M301.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins」の代理人整理番号M309.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease」の代理人整理番号M310.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides」の代理人整理番号MNC1.20(PCT/US13/XXXXX)、および表題「Modified Polynucleotides for the Production of Oncology−Related Proteins and Peptides」の代理人整理番号MNC2.20(PCT/US13/XXXXX)を有し、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野 本発明は、ポリヌクレオチド、一次構築物、および修飾mRNA分子(mmRNA)の組成、これらの設計、調製、製造、および/または製剤化の方法、プロセス、キット、ならびにデバイスに関する。
タンパク質発現を生じさせる従前の方法には多くの問題がある。例えば、導入されたDNAは、ある頻度で宿主細胞ゲノムDNAに組み込まれて、宿主細胞ゲノムDNAの変性および/または損傷をもたらし得る。あるいは、細胞に導入された異種デオキシリボ核酸(DNA)は、娘細胞(異種DNAが染色体に組み込まれたか否かにかかわらず)に、または子孫に継承され得る。
加えて、適切に送達され、かつ宿主ゲノムの損傷も組み込みもないと仮定して、コードされたタンパク質が作製される前に生じなければならないステップが多く存在する。いったん細胞内に入ると、DNAは、それがRNA転写される核内に輸送されなければならない。その後、DNAから転写されたRNAは、それがタンパク質に翻訳される細胞質に入らなければならない。投与されたDNAからタンパク質までの複数の処理ステップが機能タンパク質の生成前に時間差を生み出すだけでなく、各ステップは、細胞のエラーおよび損傷の機会にもなる。さらに、DNAが頻繁に細胞に入るが、発現されないか、または妥当な速度もしくは濃度で発現されないため、細胞におけるDNA発現を達成することが困難であることが知られている。これは、DNAが一次細胞または修飾細胞株に導入されるときに特に問題になり得る。
1990年代初めに、Bloomおよび同僚は、インビトロで転写されたバソプレシンmRNAを視床下部に注入することによってバソプレシン欠乏ラットの救助に成功した(Science 255:996−998;1992)。しかしながら、低レベルの翻訳および分子の免疫原性が治療薬としてのmRNAの開発を妨害し、それ以来、むしろこれらの落とし穴を利用し得る代替用途、すなわち、癌抗原をコードするmRNAでの免疫化に労力を集中させている。
他者は、目的とするポリペプチドを送達するためのmRNAの使用を研究しており、mRNA分子のある特定の化学修飾、具体的には、シュードウリジンおよび5−メチル−シトシンが免疫刺激作用を低下させたことを示している。
これらの研究は、例えば、Ribostem Limitedの2003年7月9日に出願され、現在は放棄されている英国特許出願第0316089.2号、国際公開第WO2005005622号として公開されている2004年7月9日出願のPCT出願第PCT/GB2004/002981号、米国特許第US20060247195号として公開され、現在は放棄されている2006年6月8日出願の米国特許出願国内段階登録第10/563,897号、および欧州特許EP1646714号として公開され、現在撤回されている2004年7月9日出願の欧州特許出願国内段階登録第EP2004743322号;Novozymes,Inc.の国際公開第WO2008140615号として公開された2007年12月19日出願のPCT出願第PCT/US2007/88060号、米国特許第US20100028943号として公開された2009年7月2日出願の米国特許出願国内段階登録第12/520,072号、および欧州特許第EP2104739号として公開された2009年7月7日出願の欧州特許出願国内段階登録第EP2007874376号;ロチェスター大学の国際公開第WO2007064952号として公開された2006年12月4日出願のPCT出願第PCT/US2006/46120号、および米国特許第US20070141030号として公開された2006年12月1日出願の米国特許出願第11/606,995号;BioNTech AGの2007年12月14日に出願され、現在は放棄されている欧州特許出願第EP2007024312号、国際公開第WO2009077134号として公開された2008年12月12日出願のPCT出願第PCT/EP2008/01059号、欧州特許第EP2240572号として公開された2010年6月2日出願の欧州特許出願国内段階登録第EP2008861423号、米国特許第US20110065103号として公開された2010年11月24日出願の米国特許出願国内段階第12/,735,060号、2005年9月28日出願の独国特許出願第DE 10 2005 046 490号、国際公開第WO2007036366号として公開された2006年9月28日出願のPCT出願第PCT/EP2006/0448号、2012年3月21日出願の国内段階欧州特許第1934345号、および第20100129877号として公開された2009年8月14日出願の国内段階米国特許出願第11/992,638号;Immune Disease Institute Inc.の米国特許第US20120046346号として公開された2011年4月15日出願の米国特許出願第13/088,009号および国際公開第WO20110130624号として公開された2011年4月15日出願のPCT出願第PCT/US2011/32679号;Shire HumanGenetic Therapeuticsの米国特許第US20110244026号として公開された2010年11月20日出願の米国特許出願第12/957,340号;Sequitur Inc.の国際公開第WO1999014346号として公開された1998年9月18日出願のPCT出願第PCT/US1998/019492号;The Scripps Research Instituteの国際公開第WO2010098861号として公開された2010年2月24日出願のPCT出願第PCT/US2010/00567号、および米国特許第US20120053333号として公開された2011年11月3日出願の米国特許出願国内段階登録第13/203,229号;ルートヴィヒ・マクシミリアン大学の国際公開第WO2011012316号として公開された2010年7月30日出願のPCT出願第PCT/EP2010/004681号;Cellscript Inc.の2008年6月30日に出願され、2011年10月18日に許可された米国特許第8,039,214号、米国特許第US20110143436号として公開された2010年12月7日出願の米国特許出願第12/962,498号、米国特許第US20110143397号として公開された2010年12月7日出願の同第12/962,468号、米国特許第US20120009649号として公開された2011年9月20日出願の同第13/237,451号、ならびに国際公開第WO2011071931号として公開された2010年12月7日出願のPCT出願PCT/US2010/59305、および国際公開第WO2011071936号として公開された2010年12月7日出願の同第PCT/US2010/59317号;ペンシルベニア大学理事会の国際公開第WO2007024708号として公開された2006年8月21日出願のPCT出願第PCT/US2006/32372号、および米国特許第US20090286852号として公開された2009年3月27日出願の米国特許出願国内段階第11/990,646号;Curevac GMBHの2001年6月5日出願の独国特許出願第DE10 2001 027 283.9号、2001年12月19日出願の同第DE10 2001 062 480.8号、および2006年10月31日出願の同第DE 20 2006 051 516号(これらすべて放棄されている)、2005年3月30日に許可された欧州特許第EP1392341号、および2008年1月2日に許可された欧州特許第EP1458410号、国際公開第WO2002098443号として公開された2002年6月5日出願のPCT出願第PCT/EP2002/06180号、国際公開第WO2003051401号として公開された2002年12月19日出願の同第PCT/EP2002/14577号、国際公開第WO2008052770号として公開された2007年12月31日出願の同第PCT/EP2007/09469号、国際公開第WO2009127230号として公開された2008年4月16日出願の同第PCT/EP2008/03033号、国際公開第WO2006122828号として公開された2005年5月19日出願の同第PCT/EP2006/004784号、国際公開第WO2008083949号として公開された2007年1月9日出願の同第PCT/EP2008/00081号、ならびに米国特許第US20050032730号として公開された2003年12月5日出願の米国特許出願第10/729,830号、米国特許第US20050059624号として公開された2004年6月18日出願の同第10/870,110号、米国特許第US20080267873号として公開された2008年7月7日出願の同第11/914,945号、米国特許第US2010047261号として公開され、現在は放棄されている2009年10月27日出願の同第12/446,912号、米国特許第US20100189729号として公開された2010年1月4日出願の同第12/522,214号、米国特許第US20110077287号として公開された2010年5月26日出願の同第12/787,566号、米国特許第US20100239608号として公開された2010年5月26日出願の同第12/787,755号、米国特許第US20110269950号として公開された2011年7月18日出願の同第13/185,119号、および米国特許第US20110311472号として公開された2011年5月12日出願の同第13/106,548号に記載されており、これらはすべて、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
シュードウリジンおよび5−メチル−シトシンを含む化学修飾の選択に限定されているこれらの報告書にもかかわらず、細胞内翻訳の効果的な調節およびポリペプチドまたはその断片をコードする核酸の処理を取り巻く無数の障壁に対処する治療法が当技術分野において依然として必要とされている。
この目的を達成するために、本発明者らは、ある特定の修飾mRNA配列が、単に免疫応答を逃れるか、回避するか、または低減させるだけではない利点を有する治療薬としての可能性を有することを示した。そのような研究は、公開された同時係属出願である、2011年8月5日出願の国際出願第PCT/US2011/046861号および2011年10月3日出願の同第PCT/US2011/054636号、2011年10月3日出願の国際出願第PCT/US2011/054617号に詳述されており、これらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、目的とするポリペプチド(例えば、修飾mRNAまたはmmRNA)をコードし、当技術分野における課題のうちの1つ以上を回避する構造的および/または化学的特徴、例えば、構造的および機能的完全性を保持し、発現の閾値を克服し、発現速度、半減期、および/またはタンパク質濃度を改善し、タンパク質局在化を最適化し、かつ免疫応答等の有害な生物応答および/または分解経路を回避しながら、核酸系治療薬の製剤化および送達の最適化に有用な特徴を有する核酸系化合物またはポリヌクレオチドを提供することによって、この必要性に対処する。
修飾mRNA(mmRNA)分子の組成、修飾mRNA(mmRNA)分子の設計、調製、製造、および/または製剤化方法、プロセス、キット、ならびにデバイスが本明細書に記載される。
本発明の様々な実施形態の詳細が、以下の発明を実施するための形態において説明される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、発明を実施するための形態および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
前述および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面に図示されるように、本発明の特定の実施形態の以下の記述から明らかになり、その図面において、同様の参照文字は、異なる図面を通して同一の部分を指す。図面は、必ずしも原寸に比例しておらず、むしろ、本発明の様々な実施形態の原理を例示説明することに重点が置かれている。
本発明の一次構築物の概略図である。
本発明において有用な先行技術における脂質構造を図示する。98N12−5(TETA5−LAP)、DLin−DMA、DLin−K−DMA(2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキソラン)、DLin−KC2−DMA、DLin−MC3−DMA、およびC12−200の構造を示す。
本明細書に教示されるIVT反応において有用な代表的なプラスミドである。このプラスミドは、本発明者らによって設計された挿入物64818を含有する。
PLGAマイクロスフェアにカプセル封入された修飾mRNAのゲルプロファイルである。
第IX因子タンパク質産生PLGA製剤第IX因子修飾mRNAのヒストグラムである。
様々な用量での修飾mRNAのトランスフェクション後のヒトケラチノサイト細胞におけるVEGFタンパク質産生を示すヒストグラムである。図6Aは、天然ヌクレオシドトリホスフェート(NTP)を含む修飾mRNAのトランスフェクション後のタンパク質産生を示す。図6Bは、シュードウリジン(シュードU)および5−メチルシトシン(5mC)で完全に修飾された修飾mRNAのトランスフェクション後のタンパク質産生を示す。
図6Cは、N1−メチル−シュードウリジン(N1−メチル−シュードU)および5−メチルシトシン(5mC)で完全に修飾された修飾mRNAのトランスフェクション後のタンパク質産生を示す。
HEK293細胞におけるVEGFタンパク質産生のヒストグラムである。
末梢血単核球(PBMC)におけるVEGF修飾mRNAのトランスフェクション後のVEGF発現およびIFN−α誘導のヒストグラムである。図8Aは、VEGF発現を示す。図8Bは、IFN−α誘導を示す。
VEGF修飾mRNAからのHeLa細胞におけるVEGFタンパク質産生のヒストグラムである。
マウスにおけるリポプレックス化VEGF修飾mRNAからのVEGFタンパク質産生のヒストグラムである。
G−CSF修飾mRNAからのHeLa細胞におけるG−CSFタンパク質産生のヒストグラムである。
第IX因子修飾mRNAからのHeLa細胞上清における第IX因子タンパク質産生のヒストグラムである。
治療薬、診断、試薬の分野、および生物学的アッセイにおいて、例えば、核酸の細胞内翻訳およびコードされた目的とするポリペプチドの産生を引き起こすために、インビトロ、インビボ、インサイツ、またはエクスビボにかかわらず、細胞内に核酸、例えば、リボ核酸(RNA)を送達することができることは大変興味深いことである。非組み込みポリヌクレオチドの送達および機能が特に重要である。
1個以上の目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの組成物(薬学的組成物を含む)、ならびにその設計、調製、製造、および/または製剤化方法が本明細書に記載される。本明細書に記載の目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを選択、設計、および/または利用するためのシステム、プロセス、デバイス、およびキットも提供される。
本発明に従って、これらのポリヌクレオチドは、好ましくは、当技術分野の他のポリペプチドをコードする分子の欠陥を回避するように修飾される。したがって、これらのポリヌクレオチドは、修飾mRNAまたはmmRNAと称される。
抗体、ウイルス、獣医学における適用の分野、および様々なインビボ環境における修飾ポリヌクレオチドの使用が本発明者らによって研究されており、これらの研究は、例えば、同時係属および共同所有の、mmRNAのインビボ適用を教示する2011年3月31日出願の米国仮特許出願第61/470,451号;抗体ポリペプチドの産生のために操作された核酸を教示する2011年4月26日出願の同第61/517,784号;mmRNA技術の獣医学における適用を教示する2011年5月17日出願の同第61/519,158号;mmRNA技術の抗菌剤における適用を教示する2011年9月12日出願の同第61/533,537号;mmRNA技術のウイルス適用を教示する2011年9月12日出願の同第61/533,554号;mmRNA技術で用いる様々な化学修飾を教示する2011年10月3日出願の同第61/542,533号;mmRNA技術の作製および使用で用いるモバイルデバイスを教示する2011年12月14日出願の同第61/570,690号;救急治療状況下でのmmRNAの使用を教示する2011年12月14日出願の同第61/570,708号;mmRNAの末端修飾構造を教示する2011年12月16日出願の同第61/576,651号;リピドイドを用いたmmRNAの送達方法を教示する2011年12月16日出願の同第61/576,705号;mmRNAを用いて器官または組織の生存率を増加させるための方法を教示する2011年12月21日出願の同第61/578,271号;細胞透過性ペプチドをコードするmmRNAを教示する2011年12月29日出願の同第61/581,322号;mmRNAへの細胞傷害性ヌクレオシドの組み込みを教示する2011年12月29日出願の同第61/581,352号;および血液脳関門を横断するためにmmRNAを用いる方法を教示する2012年1月10日出願の同61/631,729号に開示されており、これらはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
組織における安定性および/もしくは排除、受容体の取り込みおよび/もしくは動態、組成物による細胞到達、翻訳機構との関わり、mRNA半減期、翻訳の効率、免疫回避、タンパク質産生能力、分泌の効率(適用される場合)、血液循環への到達可能性、タンパク質半減期、ならびに/または細胞の状態、機能、および/もしくは活性の調節のうちの1つ以上を改善するように設計された、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAが本明細書の一部分に提供される。
I.本発明の組成物(mmRNA) 本発明は、1個以上の目的とするポリペプチドをコードする核酸分子、具体的には、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAを提供する。「核酸」という用語は、その最も広い意味において、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および/または物質を含む。これらのポリマーは、多くの場合、ポリヌクレオチドと称される。本発明の例示の核酸またはポリヌクレオチドには、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、トレオース核酸(TNA)、グリコール核酸(GNA)、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA、β−D−リボ配置を有するLNA、α−L−リボ配置を有するα−LNA(LNAのジアステレオマー)、2’−アミノ官能化を有する2’−アミノ−LNA、および2’−アミノ官能化を有する2’−アミノ−α−LNAを含む)、またはこれらのハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。
好ましい実施形態において、核酸分子は、メッセンジャーRNA(mRNA)である。本明細書で使用するとき、「メッセンジャーRNA(mRNA)」という用語は、目的とするポリペプチドをコードし、かつ翻訳されてインビトロ、インビボ、インサイツ、またはエクスビボで、コードされた目的とするポリペプチドを産生することができる任意のポリヌクレオチドを指す。
従来、mRNA分子の主要成分には、少なくともコーディング領域、5’UTR、3’UTR、5’キャップ、およびポリA尾部が含まれる。この野生型モジュール構造を基に、本発明は、モジュール組織を維持するが、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドが導入される部分への細胞の自然免疫応答の実質的な誘導の欠如を含む、有用な特性をポリヌクレオチドに付与する1つ以上の構造および/もしくは化学修飾または改変を含むポリヌクレオチドまたは一次RNA構築物を提供することによって従来のmRNA分子の機能の範囲を拡大する。したがって、本発明の修飾mRNA分子は、「mmRNA」と称される。本明細書で使用するとき、「構造的」特徴または修飾は、2個以上の結合ヌクレオチドが、ヌクレオチド自体への著しい化学修飾なく、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAにおいて挿入、欠失、複製、反転、またはランダム化される特徴または修飾である。化学結合が必然的に破壊および再形成されて構造修飾をもたらすため、構造修飾は、化学的性質のものであり、したがって、化学修飾である。しかしながら、構造修飾は、異なるヌクレオチド配列をもたらす。例えば、ポリヌクレオチド「ATCG」は、「AT−5meC−G」に化学修飾され得る。同一のポリヌクレオチドは、「ATCG」から「ATCCCG」に構造修飾され得る。ここで、ジヌクレオチド「CC」が挿入されており、ポリヌクレオチドへの構造修飾をもたらす。
mmRNA構造 本発明のmmRNAは、本明細書で証明されるように核酸系治療薬を用いた効果的なポリペプチド産生の既存の問題の打開に役立つそれらの機能的および/または構造的設計特徴において野生型mRNAと区別される。
図1は、本発明の代表的なポリヌクレオチド一次構築物100を示す。本明細書で使用するとき、「一次構築物」または「一次mRNA構築物」という用語は、1個以上の目的とするポリペプチドをコードし、その中でコードされる目的とするポリペプチドが翻訳されることを可能とするのに十分な構造的および/または化学的特徴を保持する、ポリヌクレオチド転写物を指す。一次構築物は、本発明のポリヌクレオチドであり得る。構造または化学修飾された場合、一次構築物は、mmRNAと称され得る。
図1を参照して、ここで、一次構築物100は、第1の隣接領域104および第2の隣接領域106に隣接する結合ヌクレオチド102の第1の領域を含有する。本明細書で使用するとき、「第1の領域」は、「コーディング領域」もしくは「コード領域」、または単に「第1の領域」と称され得る。この第1の領域は、コードされた目的とするポリペプチドを含み得るが、これに限定されない。目的とするポリペプチドは、その5’末端に、シグナル配列領域103によってコードされた1つ以上のシグナル配列を含み得る。隣接領域104は、1つ以上の完全または不完全な5’UTR配列を含む結合ヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域104は、5’末端キャップ108も含み得る。第2の隣接領域106は、1つ以上の完全または不完全な3’UTRを含む結合ヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域106は、3’尾部配列110も含み得る。
第1の領域102と第1の隣接領域104の5’末端の架橋は、第1の操作領域105である。従来、この操作領域は、開始コドンを含む。あるいは、この操作領域は、開始コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含み得る。
第1の領域102と第2の隣接領域106の3’末端の架橋は、第2の操作領域107である。従来、この操作領域は、終止コドンを含む。あるいは、この操作領域は、終止コドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含み得る。本発明に従って、複数の連続終止コドンも使用され得る。
概して、本発明の一次構築物の第1の領域の最短の長さは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、またはデカペプチドをコードするのに十分な核酸配列の長さであり得る。別の実施形態において、この長さは、2〜30個のアミノ酸、例えば、5〜30、10〜30、2〜25、5〜25、10〜25、または10〜20個のアミノ酸のペプチドをコードするのに十分であり得る。この長さは、少なくとも11、12、13、14、15、17、20、25、もしくは30個のアミノ酸のペプチド、または40個のアミノ酸より長くないペプチド、例えば、35、30、25、20、17、15、14、13、12、11、もしくは10個のアミノ酸より長くないペプチドをコードするのに十分であり得る。ポリヌクレオチド配列がコードし得るジペプチドの例には、カルノシンおよびアンセリンが挙げられるが、それらに限定されない。
概して、本発明の目的とするポリペプチドをコードする第1の領域の長さは、約30ヌクレオチド長を超える(例えば、少なくとも、約35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、および3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、もしくは100,000ヌクレオチド長(100,000を含む)まで、またはそれらを超える)。本明細書で使用するとき、「第1の領域」は、「コーディング領域」もしくは「コード領域」、または単に「第1の領域」と称され得る。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、約30〜約100,000個のヌクレオチド(例えば、30〜50、30〜100、30〜250、30〜500、30〜1,000、30〜1,500、30〜3,000、30〜5,000、30〜7,000、30〜10,000、30〜25,000、30〜50,000、30〜70,000、100〜250、100〜500、100〜1,000、100〜1,500、100〜3,000、100〜5,000、100〜7,000、100〜10,000、100〜25,000、100〜50,000、100〜70,000、100〜100,000、500〜1,000、500〜1,500、500〜2,000、500〜3,000、500〜5,000、500〜7,000、500〜10,000、500〜25,000、500〜50,000、500〜70,000、500〜100,000、1,000〜1,500、1,000〜2,000、1,000〜3,000、1,000〜5,000、1,000〜7,000、1,000〜10,000、1,000〜25,000、1,000〜50,000、1,000〜70,000、1,000〜100,000、1,500〜3,000、1,500〜5,000、1,500〜7,000、1,500〜10,000、1,500〜25,000、1,500〜50,000、1,500〜70,000、1,500〜100,000、2,000〜3,000、2,000〜5,000、2,000〜7,000、2,000〜10,000、2,000〜25,000、2,000〜50,000、2,000〜70,000、および2,000〜100,000個)を含む。
本発明に従って、第1および第2の隣接領域は、独立して、15〜1,000ヌクレオチド長の範囲(例えば、30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、および900を超えるヌクレオチド長、または少なくとも30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、および1,000ヌクレオチド長)であり得る。
本発明に従って、尾部配列は、0〜500ヌクレオチド長の範囲(例えば、少なくとも60、70、80、90、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、または500ヌクレオチド長)であり得る。尾部領域がポリA尾部である場合、長さは、ポリA結合タンパク質結合の単位で、またはその関数として決定され得る。この実施形態において、ポリA尾部は、ポリA結合タンパク質の少なくとも4個の単量体に結合するのに十分な長さである。ポリA結合タンパク質の単量体は、一続きの約38個のヌクレオチドに結合する。したがって、約80個のヌクレオチドおよび160個のヌクレオチドのポリA尾部が機能的であることが観察されている。
本発明に従って、キャッピング領域は、単一のキャップまたはキャップを形成する一連のヌクレオチドを含み得る。この実施形態において、キャッピング領域は、1〜10、例えば、2〜9、3〜8、4〜7、1〜5、5〜10、または少なくとも2、もしくは10以下のヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、キャップは不在である。
本発明に従って、第1および第2の操作領域は、3〜40、例えば、5〜30、10〜20の範囲、15、または少なくとも4、もしくは30以下のヌクレオチド長であり得、開始コドンおよび/または終止コドンに加えて、1つ以上のシグナルおよび/または制限配列を含み得る。
環状mmRNA 本発明に従って、一次構築物またはmmRNAは、環化またはコンカテマー化されて翻訳コンピテント分子を生成し、ポリA結合タンパク質と5’末端結合タンパク質との間の相互作用を補助し得る。環化またはコンカテマー化の機構は、少なくとも3つの異なる経路、すなわち1)化学的経路、2)酵素的経路、および3)リボザイム触媒経路を通って生じ得る。新たに形成された5’/3’連結は、分子内または分子間であり得る。
第1の経路において、核酸の5’末端および3’末端は、接近しているときに分子の5’末端と3’末端との間に新たな共有結合を形成する化学反応基を含有する。有機溶媒中で、合成mRNA分子の3’末端上の3’−アミノ末端ヌクレオチドが5’−NHS−エステル部分上で求核攻撃を経て新たな5’/3’アミド結合を形成するように、5’末端は、NHS−エステル反応基を含有し得、3’末端は、3’−アミノ末端ヌクレオチドを含有し得る。
第2の経路において、T4 RNAリガーゼを用いて、5’−リン酸化核酸分子を核酸の3’−ヒドロキシル基に酵素結合させて、新たなホスホロジエステル結合を形成することができる。反応の例において、1μgの核酸分子が、製造業者のプロトコルに従って、1〜10単位のT4 RNAリガーゼ(New England Biolabs、Ipswich,MA)と37℃で1時間インキュベートされる。連結反応が、5’領域および3’領域の両方と並んで塩基対合して、酵素的連結反応を補助することができる分裂したオリゴヌクレオチドの存在下で生じ得る。
第3の経路において、cDNA鋳型の5’末端または3’末端のいずれかは、インビトロ転写中に、結果として生じる核酸分子が核酸分子の5’末端を核酸分子の3’末端に連結することができる活性リボザイム配列を含有し得るように、リガーゼリボザイム配列をコードする。リガーゼリボザイムは、I群イントロン、I群イントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピンリボザイムに由来し得るか、またはSELEX(試験管内進化法、systematic evolution of ligands by exponential enrichment)によって選択され得る。リボザイムリガーゼ反応は、0〜37℃の温度で1〜24時間かかり得る。
mmRNA多量体 本発明に従って、複数のはっきりと異なるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、3’末端で修飾されたヌクレオチドを用いて3’末端を介して結合され得る。化学的複合体形成を用いて、細胞への送達の化学量論を制御することができる。例えば、グリオキシル酸回路酵素、イソクエン酸リアーゼ、およびリンゴ酸シンターゼは、HepG2細胞に1:1の比率で供給されて細胞脂肪酸の代謝を変化させ得る。この比率は、一方のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA種に3’−アジド末端ヌクレオチドを用い、かつ反対側のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA種にC5−エチニルまたはアルキニル含有ヌクレオチドを用いて化学結合ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを化学結合させることによって制御され得る。この修飾されたヌクレオチドは、製造業者のプロトコルに従って末端トランスフェラーゼ(New England Biolabs、Ipswich,MA)を用いて転写後に添加される。3’末端修飾ヌクレオチドの添加後、これら2個のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA種は、銅の存在下または不在下において水溶液中で合わせられて、文献内に記載のクリック化学機構を介して新たな共有結合を形成し得る。
別の例において、3個以上のポリヌクレオチドが官能化リンカー分子を用いて結合され得る。例えば、官能化サッカリド分子は、複数の化学反応基(SH−、NH2−、N3等)を含有して3’−官能化mRNA分子上の同族部分(すなわち、3’−マレイミドエステル、3’−NHS−エステル、アルキニル)と反応するように化学修飾され得る。この修飾されたサッカリド上の反応基の数は、化学量論的様式で制御されて、複合体化されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの化学量論比を直接制御し得る。
mmRNA複合体および組み合わせ タンパク質産生をさらに亢進するために、本発明の一次構築物またはmmRNAは、他のポリヌクレオチド、染料、挿入剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、プソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリン、サフィリン)、多環芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG−40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドに特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、または骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体、ホルモンおよびホルモン受容体、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、共同因子、または薬物と複合体化されるように設計され得る。
複合体化は、安定性および/または半減期の増加をもたらし得、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを、細胞、組織、または生物体の特定の部位に標的化するときに特に有用であり得る。
本発明に従って、mmRNAまたは一次構築物は、RNAi剤、siRNA、shRNA、miRNA、miRNA結合部位、アンチセンスRNA、リボザイム、触媒DNA、tRNA、三重らせん形成を誘導するRNA、アプタマー、もしくはベクター等のうちの1つ以上とともに投与され得るか、またはこれらをさらにコードし得る。
二機能性mmRNA 本発明の一実施形態は、二機能性ポリヌクレオチド(例えば、二機能性一次構築物または二機能性mmRNA)である。その名称が示すように、二機能性ポリヌクレオチドは、少なくとも2つの機能を有するか、または少なくとも2つの機能の能力があるポリヌクレオチドである。これらの分子は、慣例により、多機能性とも称され得る。
二機能性ポリヌクレオチドの複数の機能は、RNAによってコードされ得る(この機能は、コードされた産物が翻訳されるまで現れ得ない)か、またはポリヌクレオチド自体の特性であり得る。これは、構造的または化学的であり得る。二機能性修飾ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと共有結合的または静電的に関連した機能を含み得る。さらに、これら2つの機能は、mmRNAおよび別の分子の複合体との関連において提供され得る。
二機能性ポリヌクレオチドは、抗増殖性ペプチドをコードし得る。これらのペプチドは、線状、環状、拘束、またはランダムコイルであり得る。これらは、アプタマー、シグナル伝達分子、リガンド、またはこれらの模倣物もしくはミメティックとして機能し得る。抗増殖性ペプチドは、翻訳されると、3〜50アミノ酸長であり得る。それらは、5〜40、10〜30、または約15アミノ酸長であり得る。それらは、一本鎖、多本鎖、または分岐鎖であり得、翻訳されると、複合体、凝集体、または任意の多ユニット構造を形成し得る。
非コードポリヌクレオチドおよび一次構築物 本明細書に記載されるように、部分的または実質的に翻訳可能ではない配列、例えば、非コード領域を有するポリヌクレオチドおよび一次構築物が提供される。そのような非コード領域は、一次構築物の「第1の領域」であり得る。あるいは、非コード領域は、第1の領域以外の領域であり得る。そのような分子は、通常翻訳されないが、リボソームタンパク質または転移RNA(tRNA)等の1つ以上の翻訳機構成分への結合および隔離のうちの1つ以上によってタンパク質産生に影響を及ぼし、それによって、細胞におけるタンパク質発現を効果的に低下させるか、細胞における1つ以上の経路またはカスケードを調節し得、それが次いでタンパク質レベルを変化させる。ポリヌクレオチドまたは一次構築物は、1個以上の長い非コードRNA(lncRNAもしくはlincRNA)もしくはその部分、低分子核RNA(sno−RNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、またはPiwi干渉RNA(piRNA)を含有し得るか、あるいはこれらをコードし得る。
目的とするポリペプチド 本発明に従って、一次構築物は、1個以上の目的とするポリペプチドまたはその断片をコードするように設計される。目的とするポリペプチドは、全ポリペプチド、複数のポリペプチド、またはポリペプチドの断片を含み得るが、これらに限定されず、これらは、独立して、1個以上の核酸、複数の核酸、核酸の断片、または前述のうちのいずれかの変異形によってコードされ得る。本明細書で使用するとき、「目的とするポリペプチド」という用語は、選択されて本発明の一次構築物においてコードされる任意のポリペプチドを指す。本明細書で使用するとき、「ポリペプチド」とは、ほとんどの場合ペプチド結合によって結合されるアミノ酸残基(天然または非天然)のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用するとき、任意の大きさ、構造、または機能を有するタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。いくつかの例において、コードされたポリペプチドが約50個のアミノ酸よりも小さい場合、このポリペプチドは、ペプチドと称される。ポリペプチドがペプチドである場合、これは、少なくとも約2、3、4、または少なくとも5アミノ酸残基長である。したがって、ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、前述の断片および他の等価物、変異形、ならびに類似体を含む。ポリペプチドは、単一の分子であり得るか、または二量体、三量体、もしくは四量体等の多分子複合体であり得る。それらは、抗体またはインスリン等の一本鎖または多本鎖ポリペプチドも含み得、会合または結合され得る。ほとんどの場合、ジスルフィド結合が多本鎖ポリペプチドに見られる。「ポリペプチド」という用語は、1個以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。
「ポリペプチド変異形」という用語は、それらのアミノ酸配列が天然配列または参照配列とは異なる分子を指す。アミノ酸配列変異形は、天然配列または参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失、および/または挿入を有し得る。通常、変異形は、天然配列または参照配列と少なくとも約50%の同一性(相同性)を有し、好ましくは、それらは、天然配列または参照配列と少なくとも約80%、より好ましくは、少なくとも約90%同一(相同)である。
いくつかの実施形態において、「変異形模倣物」が提供される。本明細書で使用するとき、「変異形模倣物」という用語は、活性化配列を模倣する1個以上のアミノ酸を含有するものである。例えば、グルタミン酸塩は、ホスホロ−トレオニンおよび/またはホスホロ−セリンの模倣物の役割を果たし得る。あるいは、変異形模倣物は、その模倣物を含有する産物の失活または不活性化をもたらし得、例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活性化置換としての機能を果たし得るか、またはアラニンは、セリンの不活性化置換としての機能を果たし得る。
「相同性」は、アミノ酸配列に適用されるとき、最大の相同パーセントを得るために、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の第2の配列のアミノ酸配列内の残基と同一の候補アミノ酸配列内の残基の割合(%)と定義される。整列させるための方法およびコンピュータプログラムは、当技術分野で周知である。相同性が同一性パーセントの計算に依存するが、計算に導入されるギャップおよびペナルティのため値が異なり得ることが理解される。
「相同体」とは、ポリペプチド配列に適用されるとき、第2の種の第2の配列に対してかなりの割合の同一性を有する他の種の対応する配列を意味する。
「類似体」は、親または出発ポリペプチドの特性のうちの1つ以上を依然として維持する、1つ以上のアミノ酸改変、例えば、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって異なるポリペプチド変異形を含むよう意図される。
本発明は、変異形および誘導体を含むポリペプチド系のいくつかの種類の組成物を企図する。これらは、置換、挿入、欠失、および共有結合変異形および誘導体を含む。「誘導体」という用語は、「変異形」という用語と同義に使用されるが、概して、任意の方法で参照分子または出発分子に対して修飾され、かつ/または変化した分子を指す。
したがって、参照配列、具体的には、本明細書に開示のポリペプチド配列に対して置換、挿入および/または付加、欠失、ならびに共有結合修飾を含有するポリペプチドをコードするmmRNAが、本発明の範囲内に包含される。例えば、配列タグまたはアミノ酸、例えば、1個以上のリジンが、本発明のペプチド配列に付加され得る(例えば、N末端またはC末端で)。配列タグは、ペプチド精製または局在化に使用され得る。リジンを用いて、ペプチド溶解度を増加させるか、またはビオチン化を可能にする。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基が任意に欠失されて、切断配列を提供し得る。あるいは、ある特定のアミノ酸(例えば、C末端またはN末端残基)は、配列の使用に応じて、例えば、可溶性のより大きい配列の一部として配列の発現時に欠失され得るか、または固体支持体に結合され得る。
「置換変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、天然配列または出発配列内の少なくとも1個のアミノ酸残基が除去され、その場所の同一の位置に異なるアミノ酸が挿入されたものである。これらの置換は、単一置換であり、分子中の1個のアミノ酸のみが置換されたものであり得、またはこれらの置換は、多置換であり、同一の分子中の2個以上のアミノ酸が置換されたものであり得る。
本明細書で使用するとき、「保存アミノ酸置換」という用語は、配列に通常存在するアミノ酸を、同様の大きさ、電荷、または極性を有する異なるアミノ酸で置換することを指す。保存置換の例には、イソロイシン、バリン、およびロイシン等の非極性(疎水性)残基の別の非極性残基との置換が挙げられる。同様に、保存置換の例には、アルギニンとリジン、グルタミンとアスパラギン、およびグリシンのセリン等の極性(親水性)残基の別の残基との置換が挙げられる。さらに、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジン等の塩基性残基の別の塩基性残基との置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸等のある酸性残基の別の酸性残基との置換が、保存置換のさらなる例である。非保存置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニン等の非極性(疎水性)アミノ酸残基の、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリジン等の極性(親水性)残基との置換、および/または極性残基の非極性残基との置換が挙げられる。
「挿入変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、1個以上のアミノ酸が天然配列または出発配列内の特定の位置のアミノ酸にすぐ隣接して挿入されたものである。アミノ酸に「すぐ隣接した」とは、アミノ酸のα−カルボキシ官能基またはα−アミノ官能基のいずれかに連結されていることを意味する。
「欠失変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、天然アミノ酸配列または出発アミノ酸配列内の1個以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失変異形は、1個以上のアミノ酸を分子の特定の領域で欠失させる。
「共有結合誘導体」は、ポリペプチドについて言及するとき、有機タンパク質性もしくは非タンパク質性誘導体化剤での天然タンパク質もしくは出発タンパク質の修飾、および/または翻訳後修飾を含む。共有結合修飾は、従来、タンパク質の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、または選択された組換え宿主細胞において機能する翻訳後修飾の機構を利用することによって導入される。結果として生じる共有結合誘導体は、組換え糖タンパク質の免疫親和性精製のための抗タンパク質抗体の生物学的活性、免疫学的アッセイ、または調製に重要な残基の特定を目的としたプログラムにおいて有用である。そのような修飾は、当技術分野の技術の範囲内であり、過度の実験なく行われる。
ある特定の翻訳後修飾は、発現ポリペプチドにおける組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、高い頻度で、翻訳後に対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態も、本発明に従って産生されたポリペプチドに存在し得る。
他の翻訳後修飾は、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化を含む(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,pp.79−86(1983))。
「特徴」は、ポリペプチドについて言及するとき、分子のはっきりと異なるアミノ酸配列に基づく成分と定義される。本発明のmmRNAによってコードされるポリペプチドの特徴には、表面出現、局所立体配座形状、折り畳み、ループ、半ループ、ドメイン、半ドメイン、部位、末端、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「表面出現」という用語は、タンパク質のポリペプチド系成分が最も外側の表面に現れることを指す。
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「局所立体配座形状」という用語は、タンパク質の定義可能な空間内に位置するタンパク質のポリペプチド系構造の出現を意味する。
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「折り畳み」という用語は、エネルギー最小化時のアミノ酸配列の結果として生じる立体構造を指す。折り畳みは、折り畳みプロセスの二次または三次レベルで生じ得る。二次レベルの折り畳みの例には、βシートおよびαヘリックスが挙げられる。三次レベルの折り畳みの例には、エネルギー力の凝集または分離が原因で形成されるドメインおよび領域を含む。このようにして形成された領域は、疎水性および親水性ポケット等を含む。
本明細書で使用する「回転」という用語は、タンパク質構造に関するとき、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を変化させる屈曲を意味し、1、2、または3個以上のアミノ酸残基が関与し得る。
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「ループ」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を逆転させる役目を果たし得るポリペプチドの構造的特徴を指す。ループがポリペプチドで見つけられ、かつ骨格の方向のみを変化させる場合、これは、4個以上のアミノ酸残基を含み得る。Olivaらは、少なくとも5つのクラスのタンパク質ループを特定している(J.Mol Biol 266(4):814−830;1997)。ループは、開ループまたは閉ループであり得る。閉ループまたは「環状」ループは、架橋部分の間に2、3、4、5、6、7、8、9、または10個以上のアミノ酸を含み得る。そのような架橋部分は、ジスルフィド架橋を有するポリペプチドにおいて典型的なシステイン−システイン架橋(Cys−Cys)を含み得るか、またはあるいは架橋部分は、本明細書で用いられるジブロモジルイル剤(dibromozylyl agent)等の非タンパク質系のものであり得る。
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「半ループ」という用語は、それが由来するループとして特定されたアミノ酸残基の少なくとも半数を有するループの部分を指す。ループが必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有するわけではないことが理解される。したがって、ループが奇数のアミノ酸を含有するか、または奇数のアミノ酸を含むと特定された場合において、奇数のループの半ループは、ループの整数部分または次の整数部分(ループのアミノ酸の数/2+/−0.5個のアミノ酸)を含む。例えば、7アミノ酸ループと特定されたループは、3個のアミノ酸または4個のアミノ酸(7/2=3.5+/−0.5で3または4になる)の半ループをもたらし得る。
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「ドメイン」という用語は、1つ以上の特定可能な構造または機能特徴または特性(例えば、結合能力、タンパク質間の相互作用の部位としての役割を果たす)を有するポリペプチドのモチーフを指す。
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「半ドメイン」という用語は、それが由来するドメインとして特定されたアミノ酸残基の少なくとも半数を有するドメインの部分を意味する。ドメインが必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有するわけではないことが理解される。したがって、ドメインが奇数のアミノ酸を含有するか、または奇数のアミノ酸を含むと特定された場合において、奇数のドメインの半ドメインは、ドメインの整数部分または次の整数部分(ドメインのアミノ酸の数/2+/−0.5個のアミノ酸)を含む。例えば、7アミノ酸ドメインと特定されたドメインは、3個のアミノ酸または4個のアミノ酸(7/2=3.5+/−0.5で3または4になる)の半ドメインをもたらし得る。サブドメインがドメインまたは半ドメイン内で特定され得、これらのサブドメインが、それらが由来するドメインまたは半ドメインで特定された構造特性または機能特性のすべてに満たない構造特性または機能特性を有することも理解される。本明細書のドメイン型のうちのいずれを含むアミノ酸もポリペプチドの骨格に沿って隣接している必要はない(すなわち、非隣接アミノ酸が構造的に折り畳まれて、ドメイン、半ドメイン、またはサブドメインをもたらし得る)ことも理解される。
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「部位」という用語は、アミノ酸系の実施形態に関するとき、「アミノ酸残基」および「アミノ酸側鎖」と同義に使用される。部位は、本発明のポリペプチド系分子内で修飾、操作、改変、誘導体化、または変更され得るペプチドまたはポリペプチド内の位置を表す。
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「末端(termini)」または「末端(terminus)」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの端を指す。そのような端は、ペプチドまたはポリペプチドの第1または最終部位に限定されるだけでなく、末端領域にさらなるアミノ酸も含み得る。本発明のポリペプチド系分子は、N末端(アミノ酸によって遊離アミノ基(NH2)で終端する)もC末端(アミノ酸によって遊離カルボキシル基(COOH)で終端する)もいずれも有することを特徴とし得る。本発明のタンパク質は、ある場合には、ジスルフィド結合または非共有結合力(多量体、オリゴマー)によって結び付けられた複数のポリペプチド鎖から成り得る。これらの種類のタンパク質は、複数のN末端およびC末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末端は、それらが場合によって有機複合体等の非ポリペプチド系部分で始まるか、または終了するように修飾され得る。
これらの特徴のうちのいずれかが本発明の一次構築物またはmmRNAによってコードされるポリペプチドの所望の成分であると特定または定義されると、これらの特徴のいくつかの操作および/または修飾のうちのいずれも、移動、交換、反転、欠失、ランダム化、または複製によって行われ得る。さらに、特徴の操作が本発明の分子に対する修飾と同一の結果をもたらすことが理解される。例えば、ドメインの欠失を伴う操作は、全長分子未満をコードする核酸の修飾のような分子の長さの改変をもたらす。
修飾および操作は、部位特異的変異誘発等であるが、これに限定されない当技術分野で既知の方法によって達成され得る。その後、結果として生じる修飾された分子は、本明細書に記載のアッセイ等のインビトロまたはインビボアッセイ、または当技術分野で既知の任意の他の好適なスクリーニングアッセイを用いて活性について試験され得る。
本発明に従って、ポリペプチドは、一連の実験によって発見されるコンセンサス配列を含み得る。本明細書で使用するとき、「コンセンサス」配列とは、1つ以上の部位で可変性を可能にする配列の集合集団を表す単一配列である。
当業者によって認識されるように、タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、および相同タンパク質も、本発明の目的とするポリペプチドの範囲内であると見なされる。例えば、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、または100を超えるアミノ酸長の参照タンパク質の任意のタンパク質断片(少なくとも1個のアミノ酸残基が参照ポリペプチド配列よりも短いが、他の点では同一であるポリペプチド配列を意味する)が本明細書に提供される。別の例において、本明細書に記載の配列のうちのいずれかと約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、または約100%同一の一続きの約20、約30、約40、約50、または約100個のアミノ酸を含む任意のタンパク質が本発明に従って利用され得る。ある特定の実施形態において、本発明に従って利用されるポリペプチドは、本明細書に提供または参照される配列のうちのいずれかに示される2、3、4、5、6、7、8、9、10以上の変異を含む。
コードされたポリペプチド 本発明の一次構築物またはmmRNAは、生物製剤、抗体、ワクチン、治療用タンパク質もしくはペプチド、細胞透過性ペプチド、分泌タンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質もしくは細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連したタンパク質、標的部分、またはいかなる治療指標も特定されていないにもかかわらず、研究および発見の分野において有用性を有するヒトゲノムによってコードされたタンパク質を含むが、これらに限定されないいくつかの標的カテゴリーのうちのいずれかから選択される目的とするポリペプチドをコードするように設計され得る。
一実施形態において、一次構築物またはmmRNAは、参照ポリペプチド配列とある特定の同一性を有する変異形ポリペプチドをコードし得る。本明細書で使用するとき、「参照ポリペプチド配列」は、出発ポリペプチド配列を指す。参照配列は、別の配列の設計において参照される野生型配列または任意の配列であり得る。「参照ポリペプチド配列」は、例えば、本明細書に開示の配列番号3858〜7559のうちのいずれか1つ、例えば、配列番号3858、3859、3860、3861、3862、3863、3864、3865、3866、3867、3868、3869、3870、3871、3872、3873、3874、3875、3876、3877、3878、3879、3880、3881、3882、3883、3884、3885、3886、3887、3888、3889、3890、3891、3892、3893、3894、3895、3896、3897、3898、3899、3900、3901、3902、3903、3904、3905、3906、3907、3908、3909、3910、3911、3912、3913、3914、3915、3916、3917、3918、3919、3920、3921、3922、3923、3924、3925、3926、3927、3928、3929、3930、3931、3932、3933、3934、3935、3936、3937、3938、3939、3940、3941、3942、3943、3944、3945、3946、3947、3948、3949、3950、3951、3952、3953、3954、3955、3956、3957、3958、3959、3960、3961、3962、3963、3964、3965、3966、3967、3968、3969、3970、3971、3972、3973、3974、3975、3976、3977、3978、3979、3980、3981、3982、3983、3984、3985、3986、3987、3988、3989、3990、3991、3992、3993、3994、3995、3996、3997、3998、3999、4000、4001、4002、4003、4004、4005、4006、4007、4008、4009、4010、4011、4012、4013、4014、4015、4016、4017、4018、4019、4020、4021、4022、4023、4024、4025、4026、4027、4028、4029、4030、4031、4032、4033、4034、4035、4036、4037、4038、4039、4040、4041、4042、4043、4044、4045、4046、4047、4048、4049、4050、4051、4052、4053、4054、4055、4056、4057、4058、4059、4060、4061、4062、4063、4064、4065、4066、4067、4068、4069、4070、4071、4072、4073、4074、4075、4076、4077、4078、4079、4080、4081、4082、4083、4084、4085、4086、4087、4088、4089、4090、4091、4092、4093、4094、4095、4096、4097、4098、4099、4100、4101、4102、4103、4104、4105、4106、4107、4108、4109、4110、4111、4112、4113、4114、4115、4116、4117、4118、4119、4120、4121、4122、4123、4124、4125、4126、4127、4128、4129、4130、4131、4132、4133、4134、4135、4136、4137、4138、4139、4140、4141、4142、4143、4144、4145、4146、4147、4148、4149、4150、4151、4152、4153、4154、4155、4156、4157、4158、4159、4160、4161、4162、4163、4164、4165、4166、4167、4168、4169、4170、4171、4172、4173、4174、4175、4176、4177、4178、4179、4180、4181、4182、4183、4184、4185、4186、4187、4188、4189、4190、4191、4192、4193、4194、4195、4196、4197、4198、4199、4200、4201、4202、4203、4204、4205、4206、4207、4208、4209、4210、4211、4212、4213、4214、4215、4216、4217、4218、4219、4220、4221、4222、4223、4224、4225、4226、4227、4228、4229、4230、4231、4232、4233、4234、4235、4236、4237、4238、4239、4240、4241、4242、4243、4244、4245、4246、4247、4248、4249、4250、4251、4252、4253、4254、4255、4256、4257、4258、4259、4260、4261、4262、4263、4264、4265、4266、4267、4268、4269、4270、4271、4272、4273、4274、4275、4276、4277、4278、4279、4280、4281、4282、4283、4284、4285、4286、4287、4288、4289、4290、4291、4292、4293、4294、4295、4296、4297、4298、4299、4300、4301、4302、4303、4304、4305、4306、4307、4308、4309、4310、4311、4312、4313、4314、4315、4316、4317、4318、4319、4320、4321、4322、4323、4324、4325、4326、4327、4328、4329、4330、4331、4332、4333、4334、4335、4336、4337、4338、4339、4340、4341、4342、4343、4344、4345、4346、4347、4348、4349、4350、4351、4352、4353、4354、4355、4356、4357、4358、4359、4360、4361、4362、4363、4364、4365、4366、4367、4368、4369、4370、4371、4372、4373、4374、4375、4376、4377、4378、4379、4380、4381、4382、4383、4384、4385、4386、4387、4388、4389、4390、4391、4392、4393、4394、4395、4396、4397、4398、4399、4400、4401、4402、4403、4404、4405、4406、4407、4408、4409、4410、4411、4412、4413、4414、4415、4416、4417、4418、4419、4420、4421、4422、4423、4424、4425、4426、4427、4428、4429、4430、4431、4432、4433、4434、4435、4436、4437、4438、4439、4440、4441、4442、4443、4444、4445、4446、4447、4448、4449、4450、4451、4452、4453、4454、4455、4456、4457、4458、4459、4460、4461、4462、4463、4464、4465、4466、4467、4468、4469、4470、4471、4472、4473、4474、4475、4476、4477、4478、4479、4480、4481、4482、4483、4484、4485、4486、4487、4488、4489、4490、4491、4492、4493、4494、4495、4496、4497、4498、4499、4500、4501、4502、4503、4504、4505、4506、4507、4508、4509、4510、4511、4512、4513、4514、4515、4516、4517、4518、4519、4520、4521、4522、4523、4524、4525、4526、4527、4528、4529、4530、4531、4532、4533、4534、4535、4536、4537、4538、4539、4540、4541、4542、4543、4544、4545、4546、4547、4548、4549、4550、4551、4552、4553、4554、4555、4556、4557、4558、4559、4560、4561、4562、4563、4564、4565、4566、4567、4568、4569、4570、4571、4572、4573、4574、4575、4576、4577、4578、4579、4580、4581、4582、4583、4584、4585、4586、4587、4588、4589、4590、4591、4592、4593、4594、4595、4596、4597、4598、4599、4600、4601、4602、4603、4604、4605、4606、4607、4608、4609、4610、4611、4612、4613、4614、4615、4616、4617、4618、4619、4620、4621、4622、4623、4624、4625、4626、4627、4628、4629、4630、4631、4632、4633、4634、4635、4636、4637、4638、4639、4640、4641、4642、4643、4644、4645、4646、4647、4648、4649、4650、4651、4652、4653、4654、4655、4656、4657、4658、4659、4660、4661、4662、4663、4664、4665、4666、4667、4668、4669、4670、4671、4672、4673、4674、4675、4676、4677、4678、4679、4680、4681、4682、4683、4684、4685、4686、4687、4688、4689、4690、4691、4692、4693、4694、4695、4696、4697、4698、4699、4700、4701、4702、4703、4704、4705、4706、4707、4708、4709、4710、4711、4712、4713、4714、4715、4716、4717、4718、4719、4720、4721、4722、4723、4724、4725、4726、4727、4728、4729、4730、4731、4732、4733、4734、4735、4736、4737、4738、4739、4740、4741、4742、4743、4744、4745、4746、4747、4748、4749、4750、4751、4752、4753、4754、4755、4756、4757、4758、4759、4760、4761、4762、4763、4764、4765、4766、4767、4768、4769、4770、4771、4772、4773、4774、4775、4776、4777、4778、4779、4780、4781、4782、4783、4784、4785、4786、4787、4788、4789、4790、4791、4792、4793、4794、4795、4796、4797、4798、4799、4800、4801、4802、4803、4804、4805、4806、4807、4808、4809、4810、4811、4812、4813、4814、4815、4816、4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9、6890、6891、6892、6893、6894、6895、6896、6897、6898、6899、6900、6901、6902、6903、6904、6905、6906、6907、6908、6909、6910、6911、6912、6913、6914、6915、6916、6917、6918、6919、6920、6921、6922、6923、6924、6925、6926、6927、6928、6929、6930、6931、6932、6933、6934、6935、6936、6937、6938、6939、6940、6941、6942、6943、6944、6945、6946、6947、6948、6949、6950、6951、6952、6953、6954、6955、6956、6957、6958、6959、6960、6961、6962、6963、6964、6965、6966、6967、6968、6969、6970、6971、6972、6973、6974、6975、6976、6977、6978、6979、6980、6981、6982、6983、6984、6985、6986、6987、6988、6989、6990、6991、6992、6993、6994、6995、6996、6997、6998、6999、7000、7001、7002、7003、7004、7005、7006、7007、7008、7009、7010、7011、7012、7013、7014、7015、7016、7017、7018、7019、7020、7021、7022、7023、7024、7025、7026、7027、7028、7029、7030、7031、7032、7033、7034、7035、7036、7037、7038、7039、7040、7041、7042、7043、7044、7045、7046、7047、7048、7049、7050、7051、7052、7053、7054、7055、7056、7057、7058、7059、7060、7061、7062、7063、7064、7065、7066、7067、7068、7069、7070、7071、7072、7073、7074、7075、7076、7077、7078、7079、7080、7081、7082、7083、7084、7085、7086、7087、7088、7089、7090、7091、7092、7093、7094、7095、7096、7097、7098、7099、7100、7101、7102、7103、7104、7105、7106、7107、7108、7109、7110、7111、7112、7113、7114、7115、7116、7117、7118、7119、7120、7121、7122、7123、7124、7125、7126、7127、7128、7129、7130、7131、7132、7133、7134、7135、7136、7137、7138、7139、7140、7141、7142、7143、7144、7145、7146、7147、7148、7149、7150、7151、7152、7153、7154、7155、7156、7157、7158、7159、7160、7161、7162、7163、7164、7165、7166、7167、7168、7169、7170、7171、7172、7173、7174、7175、7176、7177、7178、7179、7180、7181、7182、7183、7184、7185、7186、7187、7188、7189、7190、7191、7192、7193、7194、7195、7196、7197、7198、7199、7200、7201、7202、7203、7204、7205、7206、7207、7208、7209、7210、7211、7212、7213、7214、7215、7216、7217、7218、7219、7220、7221、7222、7223、7224、7225、7226、7227、7228、7229、7230、7231、7232、7233、7234、7235、7236、7237、7238、7239、7240、7241、7242、7243、7244、7245、7246、7247、7248、7249、7250、7251、7252、7253、7254、7255、7256、7257、7258、7259、7260、7261、7262、7263、7264、7265、7266、7267、7268、7269、7270、7271、7272、7273、7274、7275、7276、7277、7278、7279、7280、7281、7282、7283、7284、7285、7286、7287、7288、7289、7290、7291、7292、7293、7294、7295、7296、7297、7298、7299、7300、7301、7302、7303、7304、7305、7306、7307、7308、7309、7310、7311、7312、7313、7314、7315、7316、7317、7318、7319、7320、7321、7322、7323、7324、7325、7326、7327、7328、7329、7330、7331、7332、7333、7334、7335、7336、7337、7338、7339、7340、7341、7342、7343、7344、7345、7346、7347、7348、7349、7350、7351、7352、7353、7354、7355、7356、7357、7358、7359、7360、7361、7362、7363、7364、7365、7366、7367、7368、7369、7370、7371、7372、7373、7374、7375、7376、7377、7378、7379、7380、7381、7382、7383、7384、7385、7386、7387、7388、7389、7390、7391、7392、7393、7394、7395、7396、7397、7398、7399、7400、7401、7402、7403、7404、7405、7406、7407、7408、7409、7410、7411、7412、7413、7414、7415、7416、7417、7418、7419、7420、7421、7422、7423、7424、7425、7426、7427、7428、7429、7430、7431、7432、7433、7434、7435、7436、7437、7438、7439、7440、7441、7442、7443、7444、7445、7446、7447、7448、7449、7450、7451、7452、7453、7454、7455、7456、7457、7458、7459、7460、7461、7462、7463、7464、7465、7466、7467、7468、7469、7470、7471、7472、7473、7474、7475、7476、7477、7478、7479、7480、7481、7482、7483、7484、7485、7486、7487、7488、7489、7490、7491、7492、7493、7494、7495、7496、7497、7498、7499、7500、7501、7502、7503、7504、7505、7506、7507、7508、7509、7510、7511、7512、7513、7514、7515、7516、7517、7518、7519、7520、7521、7522、7523、7524、7525、7526、7527、7528、7529、7530、7531、7532、7533、7534、7535、7536、7537、7538、7539、7540、7541、7542、7543、7544、7545、7546、7547、7548、7549、7550、7551、7552、7553、7554、7555、7556、7557、7558、7559のうちのいずれかであり得る。
当技術分野で既知の「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される2個以上のペプチドの配列間の関係を指す。当技術分野において、同一性は、2個以上のアミノ酸残基のストリング間のマッチ数によって決定されるペプチド間の配列関連性の程度も意味する。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム(すなわち、「アルゴリズム」)によって処理されるギャップアライメント(存在する場合)を有する2つ以上の配列のうちのより小さい配列間の同一のマッチの割合(%)を測定する。関連ペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算され得る。そのような方法には、Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988、Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993、Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994、Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987、Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press,New York,1991、およびCarillo et al.,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)に記載の方法が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ポリペプチド変異形は、参照ポリペプチドと同一または同様の活性を有し得る。あるいは、変異形は、参照ポリペプチドと比較して変化(例えば、増加または減少)した活性を有し得る。概して、本発明の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異形は、本明細書に記載され、かつ当業者に既知の配列アライメントプログラムおよびパラメータによって決定されるように、特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異形と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%であるが、100%未満の配列同一性を有する。そのようなアライメントのツールは、BLASTプログラム一式を含む(Stephen F.Altschul,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman(1997),“Gapped BLAST and PSI−BLAST:a new generation of protein databese search programs”,Nucleic Acids Res.25:3389−3402)。他のツールは、本明細書、具体的には、「同一性」の定義に記載される。
BLASTアルゴリズムの初期設定パラメータは、例えば、予測閾値10、ワードサイズ28、マッチ/ミスマッチスコア1、−2、線形ギャップコストを含む。任意のフィルター、ならびに種特異的繰り返し配列、例えば、ヒト特異的繰り返し配列の選択が適用され得る。
生物製剤 本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、1つ以上の生物製剤をコードし得る。本明細書で使用するとき、「生物製剤」は、本明細書に提供される方法によって産生され、かつ重病もしくは命にかかわる疾患または病状を治療、治癒、軽減、予防、または診断するために用いられ得るポリペプチド系分子である。生物製剤には、本発明に従って、アレルゲン抽出物(例えば、アレルギー注射および試験用)、血液成分、遺伝子治療産物、移植に用いられるヒト組織または細胞産物、ワクチン、モノクローナル抗体、サイトカイン、成長因子、酵素、血栓溶解剤、ならびに免疫調節因子等が含まれるが、これらに限定されない。
本発明に従って、現在販売されているか、または開発中の1つ以上の生物製剤が、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによってコードされ得る。理論によって束縛されることを望まないが、少なくとも部分的には、特異性、純度、および/または構築物設計の選択性により、既知の生物製剤をコードするポリヌクレオチドの本発明の一次構築物またはmmRNAへの組み込みが治療効果の改善をもたらすと考えられる。
抗体 本明細書に開示の一次構築物またはmmRNAは、1個以上の抗体またはその断片をコードし得る。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体(免疫グロブリンFc領域を有する全長抗体を含む)、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体、二特異性抗体(diabody)、および一本鎖分子)、ならびに抗体断片を含む。「免疫グロブリン(Ig)」という用語は、本明細書において「抗体」と同義に使用される。本明細書で使用するとき、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体、すなわち、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する変異および/または翻訳後修飾(例えば、異性化、アミド化)を除いて同一であるその集団を含む個々の抗体を指す。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向される。
本明細書におけるモノクローナル抗体は、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一もしくは相同である一方で、鎖(複数可)の残りの部分が、別の種に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一もしくは相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、ならびにそのような抗体の断片を明確に含む。本明細書における目的とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば、旧世界ザル、類人猿等)由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれるが、これに限定されない。
「抗体断片」は、無傷抗体の一部、好ましくは、無傷抗体の抗原結合および/または可変領域を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびFv断片;二特異性抗体;線形抗体;ナノボディ;一本鎖抗体分子;および抗体断片から形成された多特異性抗体が挙げられる。
α、δ、ε、γ、およびμと指定される重鎖を含む、それぞれ、免疫グロブリン、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMの5つのクラスのうちのいずれかが本発明のmmRNAによってコードされ得る。サブクラス、γおよびμをコードするポリヌクレオチド配列も含まれる。したがって、以下のサブクラス:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2を含む抗体のサブクラスのうちのいずれかが、部分的または全体的にコードされ得る。
本発明に従って、現在販売されているか、または開発中の1個以上の抗体または断片が、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによってコードされ得る。理論によって束縛されることを望まないが、少なくとも部分的に、特異性、純度、およびmmRNA設計の選択性により、本発明の一次構築物への組み込みが治療効果の改善をもたらすと考えられる。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAにおいてコードされる抗体を利用して、血液、心臓血管、CNS、中毒(抗毒素を含む)、皮膚科学、内分泌学、胃腸、医療画像、筋骨格、腫瘍学、免疫学、呼吸器、知覚、および抗感染等であるが、これらに限定されない多くの治療分野における状態または疾患を治療することができる。
一実施形態において、本明細書に開示の一次構築物またはmmRNAは、モノクローナル抗体および/またはその変異形をコードし得る。抗体の変異形には、置換変異形、保存アミノ酸置換、挿入変異形、欠失変異形、および/または共有結合誘導体も含まれ得るが、これらに限定されない。一実施形態において、本明細書に開示の一次構築物および/またはmmRNAは、免疫グロブリンFc領域をコードし得る。別の実施形態において、一次構築物および/またはmmRNAは、変異形免疫グロブリンFc領域をコードし得る。非限定的な例として、一次構築物および/またはmmRNAは、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,217,147号に記載の変異形免疫グロブリンFc領域を有する抗体をコードし得る。
ワクチン 本明細書に開示の一次構築物またはmmRNAは、1個以上のワクチンをコードし得る。本明細書で使用するとき、「ワクチン」は、特定の疾患または感染体に対する免疫を高める生物学的調製物である。本発明に従って、現在販売されているか、または開発中の1個以上のワクチンが、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによってコードされ得る。理論によって束縛されることを望まないが、少なくとも部分的に、特異性、純度、および構築物設計の選択性により、本発明の一次構築物またはmmRNAへの組み込みが治療効果の改善をもたらすと考えられる。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAにおいてコードされるワクチンを利用して、心臓血管、CNS、皮膚科学、内分泌学、腫瘍学、免疫学、呼吸器、および抗感染等であるが、これらに限定されない多くの治療分野における状態または疾患を治療することができる。
治療用タンパク質またはペプチド 本明細書に開示の一次構築物またはmmRNAは、1個以上の有効なまたは「試験用の」治療用タンパク質またはペプチドをコードし得る。
本発明に従って、現在販売されているか、または開発中の1個以上の治療用タンパク質またはペプチドが、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによってコードされ得る。理論によって束縛されることを望まないが、少なくとも部分的に、特異性、純度、および構築物設計の選択性により、本発明の一次構築物またはmmRNAへの組み込みが治療効果の改善をもたらすと考えられる。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAにおいてコードされる治療用タンパク質およびペプチドを利用して、血液、心臓血管、CNS、中毒(抗毒素を含む)、皮膚科学、内分泌学、遺伝学、泌尿生殖器、胃腸、筋骨格、腫瘍学、および免疫学、呼吸器、知覚、および抗感染等であるが、これらに限定されない多くの治療分野における状態または疾患を治療することができる。
細胞透過性ポリペプチド 本明細書に開示の一次構築物またはmmRNAは、1個以上の細胞透過性ポリペプチドをコードし得る。本明細書で使用するとき、「細胞透過性ポリペプチド」またはCPPは、分子の細胞取り込みを促進し得るポリペプチドを指す。本発明の細胞透過性ポリペプチドは、1つ以上の検出可能な標識を含有し得る。ポリペプチドは、部分的に標識化され得るか、または完全に全体を通して標識化され得る。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、検出可能な標識を完全にコードし得るか、部分的にコードし得るか、または全くコードし得ない。細胞透過性ペプチドは、シグナル配列も含み得る。本明細書で使用するとき、「シグナル配列」は、タンパク質翻訳中に新生タンパク質のアミノ末端に結合されるアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列を用いて、細胞透過性ポリペプチドの分泌をシグナル伝達することができる。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、融合タンパク質もコードし得る。融合タンパク質は、荷電タンパク質を治療用タンパク質に動作可能に結合させることによって作成され得る。本明細書で使用するとき、「動作可能に結合する」とは、治療用タンパク質および荷電タンパク質が細胞に導入されたときに複合体の発現を可能にするような形で結合していることを指す。本明細書で使用するとき、「荷電タンパク質」は、正電荷、負電荷、または全体的に中性の電荷を持つタンパク質を指す。好ましくは、治療用タンパク質は、融合タンパク質の形成時に荷電タンパク質に共有結合され得る。全アミノ酸または表面アミノ酸に対する表面電荷の比率は、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、または0.9であり得る。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによってコードされる細胞透過性ポリペプチドは、翻訳された後に複合体を形成し得る。この複合体は、細胞透過性ポリペプチドに結合、例えば、共有結合された荷電タンパク質を含み得る。「治療用タンパク質」は、細胞に投与されたときに、治療、診断、および/もしくは予防効果を有し、かつ/または所望の生物学的および/もしくは薬理学的効果を誘発するタンパク質を指す。
一実施形態において、細胞透過性ポリペプチドは、第1のドメインおよび第2のドメインを含み得る。第1のドメインは、超荷電ポリペプチドを含み得る。第2のドメインは、タンパク質結合パートナーを含み得る。本明細書で使用するとき、「タンパク質結合パートナー」は、抗体およびその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドを含むが、これらに限定されない。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーの細胞内結合パートナーをさらに含み得る。細胞透過性ポリペプチドは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが導入され得る細胞から分泌されることができ得る。細胞透過性ポリペプチドは、第1の細胞に浸透することもでき得る。
さらなる実施形態において、細胞透過性ポリペプチドは、第2の細胞に浸透することができる。第2の細胞は、第1の細胞と同一の領域に由来し得るか、または異なる領域に由来し得る。この領域は、組織および器官を含み得るが、これらに限定されない。第2の細胞は、第1の細胞の近位にあるか、またはその遠位にあり得る。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、タンパク質結合パートナーを含み得る細胞透過性ポリペプチドをコードし得る。タンパク質結合パートナーは、抗体、超荷電抗体、または機能的断片を含み得るが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、タンパク質結合パートナーを含む細胞透過性ポリペプチドが導入される細胞に導入され得る。
分泌タンパク質 ヒトおよび他の真核細胞は、膜によって多くの機能的にはっきりと異なる区画に細分される。各膜結合型区画、または小器官は、小器官の機能に必須の異なるタンパク質を含有する。この細胞は、タンパク質内に位置するアミノ酸モチーフである「選別シグナル」を用いて、タンパク質を特定の細胞小器官に標的化する。
シグナル配列、シグナルペプチド、またはリーダー配列と呼ばれる一種の選別シグナルは、タンパク質のクラスを小胞体(ER)と呼ばれる小器官に指向する。
シグナル配列によってERに標的化されたタンパク質は、分泌タンパク質として細胞外空間に放出され得る。同様に、細胞膜上に存在するタンパク質は、タンパク質を膜に保持する「リンカー」のタンパク質分解切断によって細胞外空間に分泌され得る。理論によって束縛されることを望まないが、上述の細胞輸送を利用するために本発明の分子が用いられ得る。したがって、本発明のいくつかの実施形態において、分泌タンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。分泌タンパク質は、本明細書または米国特許公開第20100255574号に記載のものから選択され得、その内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態において、これらは、大量の有益なヒト遺伝子産物の製造時に用いられ得る。
原形質膜タンパク質 本発明のいくつかの実施形態において、原形質膜のタンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。
細胞質または細胞骨格タンパク質 本発明のいくつかの実施形態において、細胞質または細胞骨格タンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。
細胞内膜結合タンパク質 本発明のいくつかの実施形態において、細胞内膜結合タンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。
核タンパク質 本発明のいくつかの実施形態において、核タンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。
ヒト疾患に関連したタンパク質 本発明のいくつかの実施形態において、ヒト疾患に関連したタンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。
種々のタンパク質 本発明のいくつかの実施形態において、現在未知の治療的機能を有するタンパク質を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。
標的部分 本発明のいくつかの実施形態において、標的部分を発現するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。これらには、インビボもしくはインビトロのいずれかで、細胞を特定の組織空間に標的化するか、または特定の部分と相互作用する働きをする細胞の表面上のタンパク質結合パートナーまたは受容体が含まれる。好適なタンパク質結合パートナーには、抗体およびその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドが含まれるが、これらに限定されない。さらに、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを用いて、脂質、炭水化物、または他の生物学的部分もしくは生体分子の合成および細胞外局在化を指向することができる。
ポリペプチドライブラリ 一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを用いて、ポリペプチドライブラリを生成することができる。これらのライブラリは、それぞれ、様々な構造または化学修飾設計を有する、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの集団の生成から生じ得る。この実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの集団は、本明細書に教示されるか、または当技術分野で既知の抗体もしくは抗体断片、タンパク質結合パートナー、足場タンパク質、および他のポリペプチドを含むが、これらに限定されない複数のコードされたポリペプチドを含み得る。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、その後にコードされたポリペプチドを合成し得る標的細胞または培養物への直接導入に好適であり得るmmRNAを含む本発明の一次構築物である。
ある特定の実施形態において、それぞれ異なるアミノ酸修飾(複数可)を有するタンパク質の複数の変異形は、薬物動態、安定性、生体適合性、および/もしくは生物学的活性、または発現レベル等の生物物理学的特性の点で最善の変異形を決定するために、産生および試験され得る。そのようなライブラリは、10、102、103、104、105、106、107、108、109、または109を超える可能な変異形(1個以上の残基の置換、欠失、および1個以上の残基の挿入を含むが、これらに限定されない)を含有し得る。
抗菌性および抗ウイルス性ポリペプチド 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、1個以上の抗菌性ペプチド(AMP)または抗ウイルス性ペプチド(AVP)をコードするように設計され得る。AMPおよびAVPは、微生物、無脊椎動物、植物、両生類、鳥類、魚、および哺乳動物等であるが、これらに限定されない様々な動物から単離され、説明されている(Wang et al.,Nucleic Acids Res.2009;37(データベース刊行):D933−7)。例えば、抗菌性ポリペプチドは、抗菌性ペプチドデータベース(http://aps.unmc.edu/AP/main.php;Wang et al.,Nucleic Acids Res.2009;37(データベース刊行):D933−7)、CAMP:Collection of Anti−Microbial Peptides(http://www.bicnirrh.res.in/antimicrobial/);Thomas et al.,Nucleic Acids Res.2010;38(データベース刊行):D774−80)、米国特許第US5221732号、同第US5447914号、同第US5519115号、同第US5607914号、同第US5714577号、同第US5734015号、同第US5798336号、同第US5821224号、同第US5849490号、同第US5856127号、同第US5905187号、同第US5994308号、同第US5998374号、同第US6107460号、同第US6191254号、同第US6211148号、同第US6300489号、同第US6329504号、同第US6399370号、同第US6476189号、同第US6478825号、同第US6492328号、同第US6514701号、同第US6573361号、同第US6573361号、同第US6576755号、同第US6605698号、同第US6624140号、同第US6638531号、同第US6642203号、同第US6653280号、同第US6696238号、同第US6727066号、同第US6730659号、同第US6743598号、同第US6743769号、同第US6747007号、同第US6790833号、同第US6794490号、同第US6818407号、同第US6835536号、同第US6835713号、同第US6838435号、同第US6872705号、同第US6875907号、同第US6884776号、同第US6887847号、同第US6906035号、同第US6911524号、同第US6936432号、同第US7001924号、同第US7071293号、同第US7078380号、同第US7091185号、同第US7094759号、同第US7166769号、同第US7244710号、同第US7314858号、および同第US7582301号に記載されており、これらの内容は、参照によりこれらの全体が組み込まれる。
本明細書に記載の抗菌性ポリペプチドは、1個以上のエンベロープウイルス(例えば、HIV、HCV)に よる細胞融合および/またはウイルス侵入をブロックし得る。例えば、抗菌性ポリペプチドは、ある領域、例えば、ウイルスエンベロープタンパク質、例えば、HIV−1 gp120またはgp41の膜貫通サブユニットの少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、もしくは60個のアミノ酸の連続配列に対応する合成ペプチドを含み得るか、またはそれからなり得る。HIV−1 gp120またはgp41のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えば、Kuiken et al.,(2008)“HIV Sequence Compendium,”Los Alamos National Laboratoryに記載される。
いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、対応するウイルスタンパク質配列に対して少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、100%の配列相同性を有し得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、対応するウイルスタンパク質配列に対して少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、または100%の配列相同性を有し得る。
他の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、ある領域、例えば、カプシド結合タンパク質の結合ドメインの少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、もしくは60個のアミノ酸の連続配列に対応する合成ペプチドを含み得るか、またはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、カプシド結合タンパク質の対応する配列に対して少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、または100%の配列相同性を有し得る。
本明細書に記載の抗菌性ポリペプチドは、プロテアーゼ二量体化をブロックし、機能的タンパク質へのウイルスプロタンパク質(例えば、HIV Gag−pol処理)の切断を阻害し、それによって、1個以上のエンベロープウイルス(例えば、HIV、HCV)の放出を阻止し得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、対応するウイルスタンパク質配列に対して少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、100%の配列相同性を有し得る。
他の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、ある領域、例えば、プロテアーゼ結合タンパク質の結合ドメインの少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、もしくは60個のアミノ酸の連続配列に対応する合成ペプチドを含み得るか、またはそれからなり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、プロテアーゼ結合タンパク質の対応する配列に対して少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、100%の配列相同性を有し得る。
本明細書に記載の抗菌性ポリペプチドは、ウイルス性病原体に対して指向されるインビトロで進化したポリペプチドを含み得る。
抗菌性ポリペプチド 抗菌性ポリペプチド(AMP)は、細菌、ウイルス、真菌、原虫、寄生虫、プリオン、および腫瘍/癌細胞を含むが、これらに限定されない様々な微生物に対して広域活性を有する可変長、可変配列、および可変構造の小ペプチドである(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Zaiou,J Mol Med,2007;85:317を参照のこと)。AMPが広範囲の迅速に発生する殺活性を有し、低レベルの誘導耐性および同時に起こる広範囲の抗炎症作用を有する可能性があることが示されている。
いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、10kDa未満、例えば、8kDa、6kDa、4kDa、2kDa、または1kDa未満であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、約6〜約100個のアミノ酸、例えば、約6〜約75個のアミノ酸、約6〜約50個のアミノ酸、約6〜約25個のアミノ酸、約25〜約100個のアミノ酸、約50〜約100個のアミノ酸、または約75〜約100個のアミノ酸からなる。ある特定の実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、約15〜約45個のアミノ酸からなり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、実質的にカチオン性である。
いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、実質的に両親媒性であり得る。ある特定の実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、実質的にカチオン性および両親媒性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陽性細菌に対して細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陰性細菌に対して細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陰性細菌に対して細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、グラム陽性細菌に対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞傷害性であり得る。ある特定の実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、ウイルス、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト腫瘍および/または癌細胞)に対して細胞傷害性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト腫瘍および/または癌細胞)に対して細胞増殖抑制性であり得る。ある特定の実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト腫瘍または癌細胞)に対して細胞傷害性および細胞増殖抑制性であり得る。いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)は、分泌ポリペプチドであり得る。
いくつかの実施形態において、抗菌性ポリペプチドは、デフェンシンを含むか、またはそれからなる。例示のデフェンシンには、α−デフェンシン(例えば、好中球デフェンシン1、デフェンシンα1、好中球デフェンシン3、好中球デフェンシン4、デフェンシン5、デフェンシン6)、β−デフェンシン(例えば、β−デフェンシン1、β−デフェンシン2、β−デフェンシン103、β−デフェンシン107、β−デフェンシン110、β−デフェンシン136)、およびθ−デフェンシンが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、カテリシジン(例えば、hCAP18)を含むか、またはそれからなる。
抗ウイルス性ポリペプチド 抗ウイルス性ポリペプチド(AVP)は、様々なウイルスに対して広域活性を有する可変長、可変配列、および可変構造の小ペプチドである。例えば、Zaiou,J Mol Med,2007;85:317を参照されたい。AVP広範囲の迅速に発生する殺活性を有し、低レベルの誘導耐性および同時に起こる広範囲の抗炎症作用を有する可能性があることが示されている。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、10kDa未満、例えば、8kDa、6kDa、4kDa、2kDa、または1kDa未満である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、約6〜約100個のアミノ酸、例えば、約6〜約75個のアミノ酸、約6〜約50個のアミノ酸、約6〜約25個のアミノ酸、約25〜約100個のアミノ酸、約50〜約100個のアミノ酸、または約75〜約100個のアミノ酸を含むか、またはこれらからなる。ある特定の実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、約15〜約45個のアミノ酸を含むか、またはこれからなる。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質的にカチオン性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質的に両親媒性である。ある特定の実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、実質的にカチオン性および両親媒性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞増殖抑制性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、ウイルスに対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞傷害性である。ある特定の実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、細菌、真菌、原生動物、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせに対して細胞増殖抑制性および細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト癌細胞)に対して細胞傷害性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト癌細胞)に対して細胞増殖抑制性である。ある特定の実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、腫瘍または癌細胞(例えば、ヒト癌細胞)細胞傷害性およびに対して細胞増殖抑制性である。いくつかの実施形態において、抗ウイルス性ポリペプチドは、分泌ポリペプチドである。
細胞傷害性ヌクレオシド 一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、1個以上の細胞傷害性ヌクレオシドを組み込み得る。例えば、細胞傷害性ヌクレオシドは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA、例えば、二機能性修飾RNAまたはmRNAに組み込まれ得る。細胞傷害性ヌクレオシド抗癌剤には、アデノシンアラビノシド、シタラビン、シトシンアラビノシド、5−フルオロウラシル、フルダラビン、フロキシウリジン、FTORAFUR(登録商標)(テガフールおよびウラシルの組み合わせ)、テガフール((RS)−5−フルオロ−1−(テトラヒドロフラン−2−イル)ピリミジン−2,4(1H,3H)−ジオン)、および6−メルカプトプリンが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの細胞傷害性ヌクレオシド類似体は、臨床で用いられているか、または抗癌剤として臨床試験の対象になっている。そのような類似体の例には、シタラビン、ゲムシタビン、トロキサシタビン、デシタビン、テザシタビン、2’−デオキシ−2’−メチリデンシチジン(DMDC)、クラドリビン、クロファラビン、5−アザシチジン、4’−チオ−アラシチジン、シクロペンテニルシトシン、および1−(2−C−シアノ−2−デオキシ−β−D−アラビノ−ペントフラノシル)−シトシンが含まれるが、これらに限定されない。そのような化合物の別の例には、リン酸フルダラビンがある。これらの化合物は、全身投与され得、正常細胞の増殖時の腫瘍細胞に対する特異性がほとんどまたは全くないといった副作用等であるが、これに限定されない細胞傷害性薬剤の典型的な副作用を有し得る。
細胞傷害性ヌクレオシド類似体のいくつかのプロドラッグも当技術分野において報告されている。例には、N4−ベヘノイル−1−β−D−アラビノフラノシルシトシン、N4−オクタデシル−1−β−D−アラビノフラノシルシトシン、N4−パルミトイル−1−(2−C−シアノ−2−デオキシ−β−D−アラビノ−ペントフラノシル)シトシン、およびP−4055(シタラビン5’−エライジン酸エステル)が含まれるが、これらに限定されない。概して、これらのプロドラッグは、主に肝臓および体循環において活性薬物に変換され、腫瘍組織における活性薬物の選択的放出をほとんどまたは全く呈しない。例えば、5’−デオキシ−5−フルオロシチジン(最終的に、5−フルオロウラシル)のプロドラッグであるカペシタビンは、肝臓および腫瘍組織で代謝される。「生理学的条件下で容易に加水分解可能なラジカル」を含有する一連のカペシタビン類似体は、Fujiuら(米国特許第4,966,891号)によって特許請求されており、参照により本明細書に組み込まれる。Fujiuによって説明されるこの一連のカペシタビン類似体は、5’−デオキシ−5−フルオロシチジンのN4アルキルおよびアラルキルカルバミン酸塩を含み、これらの化合物が正常な生理学的条件下で加水分解によって活性化されて、5’−デオキシ−5−フルオロシチジンをもたらすことを暗示する。
一連のシタラビンN4−カルバミン酸塩が、Fadlら(参照により本明細書に組み込まれる、Pharmazie.1995,50,382−7)によって報告されており、そこで、化合物は、肝臓および血漿においてシタラビンに変換するように設計された。参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2004/041203号は、ゲムシタビンのプロドラッグを開示しており、そこで、プロドラッグのうちのいくつかは、N4−カルバミン酸塩である。これらの化合物は、ゲムシタビンの胃腸毒性を克服するように設計されており、無傷プロドラッグを胃腸管から吸収した後に、肝臓および血漿における加水分解放出によってゲムシタビンを提供するよう意図された。Nomuraら(参照により本明細書に組み込まれる、Bioorg Med.Chem.2003,11,2453−61)は、生体内還元時に酸性条件下でさらなる加水分解を必要とした中間体を産生して、細胞傷害性ヌクレオシド化合物を産生した1−(3−C−エチニル−β−D−リボ−ペントファラノシル)シトシンのアセタール誘導体を説明している。
化学療法薬であり得る細胞傷害性ヌクレオチドには、ピラゾロ[3,4−D]−ピリミジン、アロプリノール、アザチオプリン、カペシタビン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メルカプトプリン、6−チオグアニン、アシクロビル、アラ−アデノシン、リバビリン、7−デアザ−アデノシン、7−デアザ−グアノシン、6−アザ−ウラシル、6−アザ−シチジン、チミジンリボヌクレオチド、5−ブロモデオキシウリジン、2−クロロ−プリン、およびイノシン、またはこれらの組み合わせも含まれるが、これらに限定されない。
隣接領域:非翻訳領域(UTR) 遺伝子の非翻訳領域(UTR)は、転写されるが、翻訳されない。5’UTRが転写開始部位で始まり開始コドンに続くが、開始コドンを含まない一方で、3’UTRは、終止コドンの直後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子および翻訳の安定性においてUTRが果たす制御的役割についての報告が相次いでいる。UTRの制御特徴は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAに組み込まれて、分子の安定性を高め得る。特定の特徴も組み込まれて、万が一それらが望ましくない器官部位に誤指向される場合には転写物の制御された下方制御を確保することができる。
5’UTRおよび翻訳開始 天然5’UTRは、翻訳開始に関与する特徴を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することで一般に知られているコザック配列のような特徴を有する。コザック配列は、コンセンサスCCR(A/G)CCAUGGを有し、式中、Rは、開始コドン(AUG)の3塩基上流のプリン(アデニンまたはグアニン)であり、この後に別の「G」が続く。5’UTRは、伸長因子結合に関与する二次構造を形成することも知られている。
特定の標的器官の多量に発現した遺伝子において典型的に見られる特徴を操作することによって、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの安定性およびタンパク質産生を高めることができる。例えば、アルブミン、血清アミロイドA、アポリポタンパク質A/B/E、トランスフェリン、αフェトタンパク質、エリスロポエチン、または第VIII因子等の肝臓で発現したmRNAの5’UTR導入を用いて、肝細胞株または肝臓でのmmRNA等の核酸分子の発現を高めることができる。同様に、他の組織特異的mRNAからの5’UTRを用いてその組織での発現を高めることは、筋肉(MyoD、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン(Herculin))、内皮細胞(Tie−1、CD36)、骨髄細胞(C/EBP、AML1、G−CSF、GM−CSF、CD11b、MSR、Fr−1、i−NOS)、白血球(CD45、CD18)、脂肪組織(CD36、GLUT4、ACRP30、アディポネクチン)、および肺上皮細胞(SP−A/B/C/D)において可能である。
他の非UTR配列が、5’UTR(または3’UTR)に組み込まれ得る。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの隣接領域に組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生、ならびにmRNAレベルを増加させ得る。
3’UTRおよびAU豊富な要素 3’UTRは、それらに包理される一続きのアデノシン(Adenosine)およびウリジン(Uridine)を有することで知られている。これらのAU豊富な特徴は、特に高代謝回転率を有する遺伝子においてよく見られる。それらの配列特徴および機能特性に基づいて、AU豊富な要素(ARE)は、3つのクラスに分類され得る(Chen et al,1995):クラスIのAREは、U豊富な領域内にAUUUAモチーフのいくつかの分散したコピーを含有する。C−MycおよびMyoDは、クラスIのAREを含有する。クラスIIのAREは、2個以上の重複したUUAUUUA(U/A)(U/A)九量体を有する。この種のAREを含有する分子は、GM−CSFおよびTNF−aを含む。クラスIIIのAREは、あまり明確にされていない。これらのU豊富な領域は、AUUUAモチーフを含有しない。C−Junおよびミオゲニンが、十分に研究されたこのクラスの例の2つである。AREに結合する大半のタンパク質がメッセンジャーを不安定にすることで知られているが、ELAVファミリーのメンバー、中でも注目すべきHuRがmRNAの安定性を向上させることが実証されている。HuRは、これら3つのクラスのAREに結合する。HuR特異的結合部位を操作して核酸分子の3’UTRに入れることで、HuR結合、ひいてはインビボでのメッセージの安定化につながる。
3’UTRのAU豊富な要素(ARE)の導入、除去、または修飾を用いて、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの安定性を調節することができる。特定のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを操作するとき、AREの1つ以上のコピーが導入されて、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの安定性を低下させ、それによって、結果として生じるタンパク質の翻訳を抑制し、その産生を低減させ得る。同様に、AREは、特定および除去されるか、または変異されて、細胞内安定性を向上させ、ひいては結果として生じるタンパク質の翻訳および産生を増加させることができる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを用いたトランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、タンパク質産生をトランスフェクション後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば、細胞を、異なるARE操作分子でトランスフェクトすることができ、関連タンパク質に対してELISAキットを用いてトランスフェクション後6時間、12時間、24時間、48時間、および7日時点で産生されたタンパク質をアッセイすることができる。
マイクロRNA結合部位の組み込み マイクロRNA(またはmiRNA)は、核酸分子の3’UTRに結合し、かつ核酸分子安定性を低下させるか、または翻訳を阻害するかのいずれかによって遺伝子発現を下方制御する19〜25ヌクレオチド長の非コードRNAである。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、1つ以上のマイクロRNA標的配列、マイクロRNA配列、またはマイクロRNA種を含み得る。そのような配列は、米国特許公開第US2005/0261218号および米国特許公開第US2005/0059005号に教示されるもの等の任意の既知のマイクロRNAに対応し得、これらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
マイクロRNA配列は、「種」領域、すなわち、成熟マイクロRNAの2〜8位の領域における配列を含み、この配列は、miRNA標的配列に対して完全なワトソン・クリック相補性を有する。マイクロRNA種は、成熟マイクロRNAの2〜8位または2〜7位を含み得る。いくつかの実施形態において、マイクロRNA種は、7個のヌクレオチド(例えば、成熟マイクロRNAのヌクレオチド2〜8位)を含み得、対応するmiRNA標的におけるこの種相補的部位は、マイクロRNA1位と反対のアデニン(A)に隣接する。いくつかの実施形態において、マイクロRNA種は、6個のヌクレオチド(例えば、成熟マイクロRNAのヌクレオチド2〜7位)を含み得、対応するmiRNA標的における種相補的部位は、マイクロRNA1位と反対のアデニン(A)に隣接する。例えば、Grimson A,Farh KK,Johnston WK,Garrett−Engele P,Lim LP,Bartel DP;Mol Cell.2007 Jul 6;27(1):91−105を参照されたく、それぞれ、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。マイクロRNA種の塩基は、標的配列と完全な相補性を有する。マイクロRNA標的配列を操作して、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの3’UTRに入れることによって、分解または翻訳減少のためにこの分子を標的化することができるが、但し、問題のマイクロRNAが利用可能であることを条件とする。このプロセスは、核酸分子送達時のオフターゲット効果の危険を低下させる。マイクロRNA、マイクロRNA標的領域、およびそれらの発現パターンの特定、ならびに生物学におけるそれらの役割が報告されている(それぞれ、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Bonauer et al.,Curr Drug Targets 2010 11:943−949、Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171−176、Contreras and Rao Leukemia 2012 26:404−413(2011 Dec 20.doi:10.1038/leu.2011.356)、Bartel Cell 2009 136:215−233、Landgraf et al,Cell,2007 129:1401−1414)。
例えば、核酸分子がmRNAであり、肝臓に送達されることが意図されないが、そこで落ち着く場合、肝臓中に豊富なマイクロRNAであるmiR−122が、miR−122の1つまたは複数の標的部位が操作されて、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの3’UTRに入れられると、目的とする遺伝子の発現を阻害することができる。異なるマイクロRNAの1つまたは複数の結合部位の導入を操作して、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの長寿命、安定性、およびタンパク質翻訳をさらに減少させることができる。
本明細書で使用するとき、「マイクロRNA部位」という用語は、マイクロRNA標的部位もしくはマイクロRNA認識部位、またはマイクロRNAが結合もしくは会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合」は、従来のワトソン・クリックハイブリダイゼーション規則に従い得るか、あるいはマイクロRNA部位に、またはマイクロRNA部位に隣接して標的配列を有するマイクロRNAの任意の安定した会合を示し得ることを理解されたい。
逆に、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの目的のために、特定の組織でのタンパク質発現を増加させるために自然に生じるマイクロRNA結合部位を操作して配列から出す(すなわち、配列から除去する)ことができる。例えば、miR−122結合部位が除去されて、肝臓でのタンパク質発現を改善することができる。複数の組織での発現の制御は、1つまたはいくつかのマイクロRNA結合部位の導入または除去によって達成され得る。
マイクロRNAがmRNAを制御し、その結果タンパク質発現を制御することで知られている組織の例には、肝臓(miR−122)、筋肉(miR−133、miR−206、miR−208)、内皮細胞(miR−17−92、miR−126)、骨髄細胞(miR−142−3p、miR−142−5p、miR−16、miR−21、miR−223、miR−24、miR−27)、脂肪組織(let−7、miR−30c)、心臓(miR−1d、miR−149)、腎臓(miR−192、miR−194、miR−204)、および肺上皮細胞(let−7、miR−133、miR−126)が挙げられるが、これらに限定されない。マイクロRNAは、血管新生(miR−132)等の複雑な生物学的プロセスも制御し得る(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171−176)。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAにおいて、そのようなプロセスに関与するマイクロRNAの結合部位は、生物学的に関連した細胞型に対して、または関連生物学的プロセスに関連してポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの発現を調整するために除去または導入され得る。マイクロRNA、miR配列、およびmiR結合部位の一覧が、2013年1月17日出願の米国特許仮出願第61/753,661号の表9、2013年1月18日出願の米国特許仮出願第61/754,159号の表9、および2013年1月31日出願の米国特許仮出願第61/758,921号の表7に列記されており、それぞれ、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
組織または疾患特異的遺伝子発現を駆動するためのマイクロRNAの使用例が列記されている(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Getner and Naldini,Tissue Antigens.2012,80:393−403)。加えて、マイクロRNA種部位は、mRNAに組み込まれてある特定の細胞における発現を低下させ得、これは、生物学的改善をもたらす。これについての例は、miR−142部位のUGT1A1発現レンチウイルスベクターへの組み込みである。miR−142種部位の存在が造血細胞での発現を低下させ、結果として抗原提示細胞での発現を低下させ、ウイルスによって発現したUGT1A1に対する免疫応答の不在をもたらした(いずれも参照により全体が本明細書に組み込まれる、Schmitt et al.,Gastroenterology 2010;139:999−1007、Gonzalez−Asequinolaza et al.Gastroenterology 2010,139:726−729)。miR−142部位の修飾mRNAへの組み込みが、造血細胞でのコードされたタンパク質の発現を低下させることができただけでなく、mRNAでコードされたタンパク質に対する免疫応答を低下または無効にすることもできた。miR−142種部位(1つまたは複数)のmRNAへの組み込みは、完全なタンパク質欠乏症を有する患者(I型UGT1A1、LDLR欠損患者、CRIM陰性Pompe患者等)の治療時に重要である。
最後に、異なる細胞型におけるマイクロRNAの発現パターンの理解を通じて、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、特定の細胞型におけるより標的化された発現または特定の生物学的条件下のみでのより標的化された発現のために操作され得る。組織特異的マイクロRNA結合部位の導入によって、組織でのタンパク質発現または生物学的条件に関連したタンパク質発現に最適なポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが設計され得る。
操作されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを用いたトランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、タンパク質産生をトランスフェクション後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば、細胞を、異なるマイクロRNA結合部位操作ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAでトランスフェクトすることができ、関連タンパク質に対してELISAキットを用いてトランスフェクション後6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、および7日時点で産生されたタンパク質をアッセイすることができる。マイクロRNA結合部位操作分子を用いたインビボ実験を行って、製剤化されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの組織特異的発現の変化を試験することもできる。
5’キャッピング mRNAの5’キャップ構造は、核外輸送に関与し、mRNAの安定性を向上させ、mRNAキャップ結合タンパク質(CBP)に結合し、これは、CBPのポリ(A)結合タンパク質との会合を介して細胞におけるmRNA安定性および翻訳適格性に関与し、成熟環状mRNA種を形成する。このキャップはさらに、mRNAスプライシング中に5’近位のイントロンの除去を支援する。
内因性mRNA分子は、5’末端キャップされて、末端グアノシンキャップ残基とmRNA分子の5’末端転写センスヌクレオチドとの間に5’−ppp−5’−トリホスフェート結合をもたらし得る。その後、この5’−グアニル酸キャップがメチル化されて、N7−メチル−グアニル酸残基を生成し得る。mRNAの5’末端の末端および/または前末端転写ヌクレオチドのリボース糖も、任意に2’−O−メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断を介する5’デキャッピングは、分解するためにmRNA分子等の核酸分子を標的とし得る。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAの修飾は、デキャッピングを阻止する非加水分解性のキャップ構造を生成し、その結果mRNAの半減期を増加させ得る。キャップ構造の加水分解が5’−ppp−5’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするため、修飾ヌクレオチドが、キャッピング反応中に用いられ得る。例えば、New England Biolabs(Ipswich,MA)のワクシニアキャッピング酵素を製造業者の指示に従ってα−チオ−グアノシンヌクレオチドとともに用いて、5’−ppp−5’キャップにおけるホスホロチオエート結合を引き起こすことができる。α−メチル−ホスホネートおよびセレノ−ホスフェートヌクレオチド等のさらなる修飾グアノシンヌクレオチドを用いることができる。
さらなる修飾には、糖環の2’−ヒドロキシル基におけるmRNAの5’末端および/または5’前末端ヌクレオチドのリボース糖の2’−O−メチル化(上述のもの)が含まれるが、これに限定されない。複数のはっきりと異なる5’−キャップ構造を用いて、mRNA分子等の核酸分子の5’キャップを生成することができる。
本明細書において合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、または構造もしくは機能キャップ類似体とも称されるキャップ類似体は、それらの化学構造の点で天然の(すなわち、内因性、野生型、または生理学的)5’キャップとは異なるが、キャップ機能は保持する。キャップ類似体は、化学的(すなわち、非酵素的)もしくは酵素的に合成され、かつ/または核酸分子に結合され得る。
例えば、反逆方向キャップ類似体(ARCA)キャップは、5’−5’−トリホスフェート基によって結合される2個のグアニンを含有し、一方のグアニンは、N7メチル基、ならびに3’−O−メチル基(すなわち、N7,3’−O−ジメチル−グアノシン−5’−トリホスフェート−5’−グアノシン(m7G−3’mppp−G、これは同等に3’O−Me−m7G(5’)ppp(5’)Gと指定され得る)を含有する。他方の未修飾グアニンの3’−O原子は、キャップされた核酸分子(例えば、mRNAまたはmmRNA)の5’末端ヌクレオチドに結合される。N7−および3’−O−メチル化グアニンは、キャップされた核酸分子(例えば、mRNAまたはmmRNA)の末端部分を提供する。
別の例示のキャップには、mCAPがあり、これは、ARCAと同様であるが、グアノシン上に2’−O−メチル基(すなわち、N7,2’−O−ジメチル−グアノシン−5’−トリホスフェート−5’−グアノシン、m7Gm−ppp−G)を有する。
キャップ類似体がインビトロ転写反応において同時に起こる核酸分子のキャッピングを可能にする一方で、転写物の最大20%がキャップされないままであり得る。これ、ならびに内因性細胞転写機構によって産生される核酸の内因性5’−キャップ構造とのキャップ類似体の構造差は、翻訳適格性の低下および細胞安定性の低下をもたらし得る。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、より真正の5’−キャップ構造を生成するために、酵素を用いて転写後にもキャップされ得る。本明細書で使用するとき、「より真正の」という表現は、構造的または機能的のいずれかで内因性または野生型特徴を酷似させるか、または模倣する特徴を指す。すなわち、「より真正の」特徴は、先行技術の合成特徴もしくは類似体等と比較して、より良好に内因性、野生型、天然、もしくは生理学的細胞機能および/もしくは構造を表しているか、またはこれは、対応する内因性、野生型、天然または生理学的特徴を1つ以上の点においてしのぐ。本発明のより真正の5’キャップ構造の非限定的な例には、当技術分野で既知の合成5’キャップ構造(または野生型、天然、または生理学的5’キャップ構造)と比較して、とりわけ、強化されたキャップ結合タンパク質の結合、増加した半減期、低下した5’エンドヌクレアーゼに対する感受性、および/または低下した5’デキャッピングを有するものがある。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素および組換え2’−O−メチルトランスフェラーゼ酵素は、mRNAの5’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に基準の5’−5’−トリホスフェート結合を生成し得、キャップグアニンは、N7メチル化を含有、mRNAの5’末端ヌクレオチドは、2’−O−メチルを含有する。そのような構造は、キャップ1構造と称される。このキャップは、例えば、当技術分野で既知の他の5’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳適格性および細胞安定性、ならびに細胞炎症誘発性サイトカインの活性化の低下をもたらす。キャップ構造には、7mG(5’)ppp(5’)N,pN2p(キャップ0)、7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp(キャップ1)、および7mG(5’)−ppp(5’)NlmpN2mp(キャップ2)が含まれるが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが転写後にキャップされ得、かつこのプロセスがより効率的であるため、ほぼ100%のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAがキャップされ得る。これは、キャップ類似体がインビトロ転写反応の過程でmRNAに結合されるときの約80%とは大いに異なる。
本発明に従って、5’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本発明に従って、5’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体には、イノシン、N1−メチル−グアノシン、2’フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、および2−アジド−グアノシンが含まれるが、これらに限定されない。
ウイルス配列 大麦縞萎縮ウイルス(BYDV−PAV)の翻訳エンハンサー配列、ヤーグジークテヒツジレトロウイルス(JSRV)、および/または地方病性鼻腫瘍ウイルス(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012129648号を参照のこと)等であるが、これらに限定されないさらなるウイルス配列は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの3’UTRに操作および挿入され得、インビトロおよびインビボで構築物の翻訳を刺激し得る。トランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、ELISAによってタンパク質産生をトランスフェクション後12時間、24時間、48時間、72時間、および7日時点でアッセイすることができる。
IRES配列 さらに、内部リボソーム進入部位(IRES)を含有し得るポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。最初に特徴的なピコルナウイルスRNAと特定されたIRESは、5’キャップ構造の不在下でタンパク質合成を開始するときに重要な役割を果たす。IRESは、mRNAの唯一のリボソーム結合部位として働き得るか、または複数のリボソーム結合部位のうちの1つの役割を果たし得る。2個以上の機能的リボソーム結合部位を含有するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、リボソーム(「多シストロン性核酸分子」)によって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAにIRESが提供されるとき、第2の翻訳可能な領域がさらに任意に提供される。本発明に従って用いられ得るIRES配列の例には、制限なく、ピコルナウイルス(例えば、FMDV)、ペストウイルス(CFFV)、ポリオウイルス(PV)、脳心筋炎ウイルス(ECMV)、口蹄疫ウイルス(FMDV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、豚コレラウイルス(CSFV)、マウス白血病ウイルス(MLV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、またはコオロギ麻痺ウイルス(CrPV)由来のものが挙げられる。
ポリA尾部 RNA処理中、長いアデニンヌクレオチド鎖(ポリA尾部)が、安定性を向上させるためにmRNA分子等のポリヌクレオチドに付加され得る。転写直後、転写物の3’末端が切断されて3’ヒドロキシルを遊離させ得る。その後、ポリAポリメラーゼは、アデニンヌクレオチド鎖をRNAに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、例えば、約100〜250残基長であり得るポリA尾部を付加する。
特有のポリA尾部の長さが、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAにある特定の利点を提供することが見出されている。
概して、本発明のポリA尾部の長さは、30ヌクレオチド長を超える。別の実施形態において、ポリA尾部は、35ヌクレオチド長を超える(例えば、少なくとも約35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、および3,000ヌクレオチド長であるか、またはこれらを超える)。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、約30〜約3,000個のヌクレオチド(例えば、30〜50、30〜100、30〜250、30〜500、30〜750、30〜1,000、30〜1,500、30〜2,000、30〜2,500、50〜100、50〜250、50〜500、50〜750、50〜1,000、50〜1,500、50〜2,000、50〜2,500、50〜3,000、100〜500、100〜750、100〜1,000、100〜1,500、100〜2,000、100〜2,500、100〜3,000、500〜750、500〜1,000、500〜1,500、500〜2,000、500〜2,500、500〜3,000、1,000〜1,500、1,000〜2,000、1,000〜2,500、1,000〜3,000、1,500〜2,000、1,500〜2,500、1,500〜3,000、2,000〜3,000、2,000〜2,500、および2,500〜3,000個)を含む。
一実施形態において、ポリA尾部は、全体のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの長さに対して設計される。この設計は、コーディング領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さ(第1もしくは隣接領域等)に基づき得るか、またはポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAから発現した最終産物の長さに基づき得る。
この文脈において、ポリA尾部は、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNA、またはその特徴よりも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、もしくは100%長い長さであり得る。ポリA尾部は、それが属するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの画分としても設計され得る。この文脈において、ポリA尾部は、構築物の全長または構築物の全長からポリA尾部を差し引いた長さの10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%以上であり得る。さらに、結合部位の操作、およびポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのポリA結合タンパク質への複合体化は、発現を高め得る。
さらに、複数のはっきりと異なるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、ポリA尾部の3’末端で修飾されたヌクレオチドを用いて3’末端を介してPABP(ポリA結合タンパク質)に結合され得る。トランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、ELISAによってタンパク質産生をトランスフェクション後12時間、24時間、48時間、72時間、および7日時点でアッセイすることができる。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド一次構築物は、ポリA〜G四重項を含むように設計される。G四重項は、DNAおよびRNAの両方においてG豊富な配列によって形成され得る4個のグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。この実施形態において、G四重項は、ポリA尾部の終端に組み込まれる。結果として生じるmmRNA構築物は、安定性、タンパク質産生、および様々な時点での半減期他のパラメータについてアッセイされる。ポリA〜G四重項が、120個のヌクレオチドのポリA尾部を単独で用いてもたらされるタンパク質産生の少なくとも75%に相当するタンパク質産生をもたらすことが見出されている。
定量化 一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、1つ以上の体液由来のエクソソームにおいて定量化され得る。本明細書で使用するとき、「体液」には、末梢血、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液(CSF)、痰、唾液、骨髄、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、クーパー腺液または射精前液、汗、糞便、毛髪、涙液、嚢胞液、胸膜および腹水、心嚢液、リンパ液、粥状液、乳糜、胆汁、間質液、帯下、膿汁、皮脂、嘔吐物、膣分泌物、粘膜分泌物、水便、膵液、鼻腔からの洗浄液、気管支肺吸引物、胚盤胞腔液、および臍帯血が含まれる。あるいは、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、睾丸、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、および胎盤からなる群から選択される器官から回収され得る。
定量化方法において、2mL未満の試料が対象から得られ、エクソソームが、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸収捕獲、親和性精製、微小流体分離、またはこれらの組み合わせによって単離される。分析において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのレベルまたは濃度は、投与された構築物の発現レベル、存在、不在、切断、または改変であり得る。このレベルを1つ以上の臨床表現型またはヒト疾患バイオマーカーについてのアッセイと相関させることは、有利である。このアッセイが、構築物特異的プローブ、サイトメトリー、qRT−PCR、実時間PCR、PCR、フローサイトメトリー、電気泳動、質量分析、またはこれらの組み合わせを用いて行われ得る一方で、エクソソームは、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)等の免疫組織化学法を用いて単離され得る。エクソソームは、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、分画遠心分離、ナノ膜限外濾過、免疫吸収捕獲、親和性精製、微小流体分離、またはこれらの組み合わせによっても単離され得る。
これらの方法は、残存しているか、または送達されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのレベルをリアルタイムで監視する能力を研究者に提供する。これは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが構造または化学修飾に起因して内因性形態とは異なるといった理由から、可能である。
II.mmRNAの設計および合成 本発明に従って用いるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、化学合成、一般にインビトロ転写(IVT)と称される酵素合成、またはより長い前駆体の酵素的もしくは化学的切断等を含むが、これらに限定されない任意の利用可能な技法に従って調製され得る。RNAを合成する方法は、当技術分野において既知である(例えば、いずれも参照により本明細書に組み込まれる、Gait,M.J.(ed.)Oligonucleotide synthesis:a practical approach,Oxford[Oxfordshire],Washington,DC:IRL Press,1984、およびHerdewijn,P.(ed.)Oligonucleotide synthesis:methods and applications,Methods in Molecular Biology,v.288(Clifton,N.J.)Totowa,N.J.:Humana Press,2005を参照のこと)。
本発明の一次構築物の設計および合成のプロセスは、概して、遺伝子構築ステップ、mRNA産生ステップ(修飾を伴うか、または伴わない)、および精製ステップを含む。酵素合成方法において、目的とするポリペプチドをコードする標的ポリヌクレオチド配列が、増幅されてcDNA鋳型を産生するベクターへの組み込みのために最初に選択される。任意に、標的ポリヌクレオチド配列および/または任意の隣接配列は、コドン最適化され得る。その後、cDNA鋳型を用いて、インビトロ転写(IVT)によってmRNAを産生する。産生後、mRNAは、精製および浄化プロセスを経り得る。これらのステップは、以下でより詳細に提供される。
遺伝子構築 遺伝子構築ステップは、遺伝子合成、ベクター増幅、プラスミド精製、プラスミド線形化および浄化、ならびにcDNA鋳型合成および浄化を含み得るが、これらに限定されない。
遺伝子合成 目的とするポリペプチドまたは標的が産生のために選択された時点で、一次構築物が設計される。一次構築物内で、目的とするポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの第1の領域は、選択された核酸(DNAまたはRNA)転写物のオープンリーディングフレーム(ORF)を用いて構築され得る。ORFは、野生型ORF、アイソフォーム、変異形、またはその断片を含み得る。本明細書で使用するとき、「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、目的とするポリペプチドをコードすることができる核酸配列(DNAまたはRNA)を指すよう意図される。ORFは、多くの場合、開始コドンATGで始まり、ナンセンスまたは終止コドンもしくはシグナルで終わる。
さらに、第1の領域のヌクレオチド配列は、コドン最適化され得る。コドン最適化方法は、当技術分野において既知であり、いくつかの目標のうちの1つ以上を達成する取り組みにおいて有用であり得る。これらの目標には、標的および宿主生物体におけるコドン頻度を一致させて適切な折り畳みを確実にすること、GC含量を付勢させてmRNAの安定性を高めるか、または二次構造を減少させること、遺伝子構築または発現を障害し得る縦列反復コドンまたは塩基泳動を最小限に抑えること、転写および翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質輸送配列を挿入または除去すること、コードされたタンパク質における翻訳後修飾部位(例えば、グリコシル化部位)を除去/付加すること、タンパク質ドメインを付加、除去、または組み替えること、制限部位を挿入するか、または欠失させること、リボソーム結合部位およびmRNA分解部位を修飾すること、翻訳速度を調節してタンパク質の様々なドメインの適切な折り畳みを可能にすること、あるいはmRNA内の問題の二次構造を減少させるか、または排除することが含まれる。コドン最適化ツール、アルゴリズム、およびサービスは、当技術分野において既知であり、非限定的な例には、GeneArtのサービス(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)、および/または所有権を有する方法が挙げられる。一実施形態において、ORF配列は、最適化アルゴリズムを用いて最適化される。各アミノ酸のコドン選択肢が表1に提供される。 表1.コドン選択肢
本発明のいくつかの実施形態において有益であると見なされ得る特徴は、一次構築物によってコードされ得、第1または第2の隣接領域としてORFに隣接し得る。この隣接領域は、ORFの最適化前および/または後に一次構築物に組み込まれ得る。一次構築物が5’隣接領域と3’隣接領域の両方を含有する必要はない。そのような特徴の例には、非翻訳領域(UTR)、コザック配列、オリゴ(dT)配列、および検出可能なタグが挙げられるが、これらに限定されず、XbaI認識を有し得る複数のクローニング部位も挙げられ得る。
いくつかの実施形態において、5’UTRおよび/または3’UTRが、隣接領域として提供され得る。複数の5’または3’UTRが、隣接領域に含まれ得、同一または異なる配列であり得る。隣接領域の任意の部分(そのような部分がない場合を含み)が、コドン最適化され得、それらのいずれも、独立して、コドン最適化の前および/または後に1つ以上の異なる構造または化学修飾を含有し得る。特徴の組み合わせは、第1および第2の隣接領域に含まれ得、他の特徴内に含有され得る。例えば、ORFは、ポリA尾部の鋳型付加のために、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有し得る5’UTRおよび/またはオリゴ(dT)配列を含み得る3’UTRに隣接し得る。参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第20100293625号に記載の5’UTR等の5’UTRは、同一および/または異なる遺伝子由来の第1のポリヌクレオチド断片および第2のポリヌクレオチド断片を含み得る。
表2および3は、隣接領域として本発明の一次構築物において利用され得る例示のUTRの一覧を提供する。本発明の5’非翻訳領域の一覧が表2に示される。A、T、C、もしくはGを含む1個以上のヌクレオチドが末端に付加されるか、または末端から除去される5’UTRの変異形が利用され得る。 表2.5’非翻訳領域
本発明の3’非翻訳領域の代表的な一覧が表3に示される。A、T、C、もしくはGを含む1個以上のヌクレオチドが末端に付加されるか、または末端から除去される3’UTRの変異形が利用され得る。 表3.3’非翻訳領域
先の表に列記されるものは例であり、任意の遺伝子由来の任意のUTRが一次構築物のそれぞれの第1または第2の隣接領域に組み込まれ得ることを理解されたい。さらに、任意の既知の遺伝子の複数の野生型UTRが利用され得る。野生型遺伝子の変異形ではない人工UTRを提供することも本発明の範囲内である。これらのUTRもしくはその部分は、それらが選択され得る転写物のUTRもしくはその部分と同一の配向で配置され得るか、または配向もしくは位置を変更し得る。したがって、5’または3’UTRは、反転し、短縮され、延長され、1つ以上の他の5’UTRまたは3’UTRでキメラにされ得る。本明細書で使用する「変更される」という用語は、UTR配列に関するとき、UTRが参照配列との関連である点において変化したことを意味する。例えば、3’または5’UTRは、上で教示される配向もしくは位置の変化によって野生型または天然UTRに対して変更され得るか、またはさらなるヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転置によって変更され得る。「変更された」UTR(3’または5’にかかわらず)をもたらすこれらの変化のうちのいずれかは、変異形UTRを含む。
一実施形態において、5’または3’UTR等の二重、三重、または四重UTRが用いられ得る。本明細書で使用するとき、「二重」UTRは、同一のUTRの2つのコピーが連続して、または実質的に連続してのいずれかでコードされるものである。例えば、内容が参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第20100129877号に記載の二重β−グロビン3’UTRが用いられ得る。
パターン化されたUTRを有することも本発明の範囲内である。本明細書で使用するとき、「パターン化されたUTR」は、1回、2回、または3回以上繰り返された繰り返しまたは交互のパターン、例えば、ABABABもしくはAABBAABBAABBもしくはABCABCABCまたはその変異形を示すUTRである。これらのパターンにおいて、各文字、A、B、またはCは、ヌクレオチドレベルでの異なるUTRを表す。
一実施形態において、隣接領域は、そのタンパク質が共通の機能、構造、特性特徴を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、目的とするポリペプチドは、特定の細胞、組織で発現するか、または発生中のある時点で発現するタンパク質のファミリーに属し得る。これらの遺伝子のうちのいずれのUTRも、同一または異なるタンパク質ファミリーの任意の他のUTRと交換されて、新たなキメラ一次転写物を作成し得る。本明細書で使用するとき、「タンパク質のファミリー」は、最も広い意味において、少なくとも1つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する2個以上の目的とするポリペプチドの群を指すために用いられる。
最適化後(所望の場合)、一次構築物成分は、プラスミド、ウイルス、コスミド、および人工染色体等であるが、これらに限定されないベクターに再構築および変換され得る。例えば、最適化された構築物は、化学的にコンピテントな大腸菌、酵母、アカパンカビ、トウモロコシ、ショウジョウバエ等に再構築および変換され得、高コピー数のプラスミド様または染色体構造は、本明細書に記載の方法によって生じる。
非翻訳領域は、翻訳エンハンサー要素(TEE)も含み得る。非限定的な例として、TEEには、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第20090226470号に記載のTEE、および当技術分野で既知のTEEが含まれ得る。
終止コドン 一実施形態において、本発明の一次構築物は、3’非翻訳領域(UTR)の前に少なくとも2つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、TGA、TAA、およびTAGから選択され得る。一実施形態において、本発明の一次構築物は、終止コドンTGAおよびもう1つの終止コドンを含む。さらなる実施形態において、もう1つの終止コドンは、TAAであり得る。別の実施形態において、本発明の一次構築物は、3つの終止コドンを含む。
ベクター増幅 一次構築物を含有するベクターは、その後、増幅され、Invitrogen PURELINK(商標)HiPure Maxiprepキット(Carlsbad,CA)を用いたマキシプレップ等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いてプラスミドが単離および精製される。
プラスミド線形化 プラスミドは、その後、制限酵素および緩衝液の使用等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて線形化され得る。線形化反応物は、例えば、InvitrogenのPURELINK(商標)PCR Microキット(Carlsbad,CA)、ならびに強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)等であるが、これらに限定されないHPLCに基づく精製方法、ならびにInvitrogenの標準PURELINK(商標)PCRキット(Carlsbad,CA)を含む方法を用いて精製され得る。精製方法は、もたらされた線形化反応物の大きさに応じて修正され得る。その後、線形化されたプラスミドを用いて、インビトロ転写(IVT)反応のためのcDNAを生成する。
cDNA鋳型合成 cDNA鋳型は、線形化されたプラスミドにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を経させることによって合成され得る。表4は、本発明のPCR反応において有用であり得るプライマーおよびプローブの一覧である。この一覧が網羅的ではなく、任意の増幅のためのプライマー−プローブ設計が当技術分野の技術の範囲内であることを理解されたい。プローブは、標的分子に対する塩基対合忠実性および塩基対合強度を高めるように化学的に修飾された塩基も含有し得る。そのような修飾には、5−メチル−シチジン、2、6−ジ−アミノ−プリン、2’−フルオロ、ホスホロ−チオエート、またはロックド核酸が含まれ得る。 表4.プライマーおよびプローブ
*UFPはユニバーサル順方向プライマーであり、URPはユニバーサル逆方向プライマーである。
一実施形態において、cDNAは、転写を経る前に配列決定分析のために提出され得る。
mRNA産生 mRNAまたはmmRNA産生のプロセスは、インビトロ転写、cDNA鋳型除去およびRNA浄化、ならびにmRNAキャッピングおよび/またはテーリング反応を含み得るが、これらに限定されない。
インビトロ転写 先のステップで産生されたcDNAは、インビトロ転写(IVT)系を用いて転写され得る。この系は、典型的には、転写緩衝液、ヌクレオチドトリホスフェート(NTP)、RNase阻害剤、およびポリメラーゼを含む。NTPは、自家で製造され得るか、供給業者から選択され得るか、または本明細書に記載されるように合成され得る。NTPは、天然および非天然(修飾された)NTPを含む本明細書に記載のNTPから選択され得るが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、および修飾された核酸を組み込むことができるポリメラーゼ等であるが、これらに限定されない変異体ポリメラーゼから選択され得るが、これらに限定されない。
RNAポリメラーゼ 任意の数のRNAポリメラーゼまたは変異形が本発明の一次構築物の設計において用いられ得る。
RNAポリメラーゼは、RNAポリメラーゼ配列のアミノ酸を挿入するか、または欠失させることによって修飾され得る。非限定的な例として、RNAポリメラーゼは、未修飾RNAポリメラーゼと比較して、2’−修飾ヌクレオチドトリホスフェートを組み込む能力の向上を示すように修飾され得る(参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2008078180号および米国特許第8,101,385号を参照のこと)。
変異形は、RNAポリメラーゼを進化させ、RNAポリメラーゼアミノ酸および/または核酸配列を最適化し、かつ/または当技術分野で既知の他の方法を用いることによって得られ得る。非限定的な例として、T7 RNAポリメラーゼ変異形は、Esveltら(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Nature(2011)472(7344):499−503)によって立案された連続指向進化システムを用いて進化させられ得、T7 RNAポリメラーゼのクローンは、93位のリジンがトレオニンで置換された変異(K93T)、I4M、A7T、E63V、V64D、A65E、D66Y、T76N、C125R、S128R、A136T、N165S、G175R、H176L、Y178H、F182L、L196F、G198V、D208Y、E222K、S228A、Q239R、T243N、G259D、M267I、G280C、H300R、D351A、A354S、E356D、L360P、A383V、Y385C、D388Y、S397R、M401T、N410S、K450R、P451T、G452V、E484A、H523L、H524N、G542V、E565K、K577E、K577M、N601S、S684Y、L699I、K713E、N748D、Q754R、E775K、A827V、D851N、またはL864F等であるが、これらに限定されない少なくとも1つの変異をコードし得る。別の非限定的な例として、T7 RNAポリメラーゼ変異形は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第20100120024号および同第20070117112号に記載の少なくとも1つの変異をコードし得る。RNAポリメラーゼの変異形には、置換変異形、保存アミノ酸置換、挿入変異形、欠失変異形、および/または共有結合誘導体も含まれ得るが、これらに限定されない。
一実施形態において、一次構築物は、野生型または変異形RNAポリメラーゼによって認識されるように設計され得る。そうすることで、一次構築物は、野生型または親一次構築物由来の配列変化部位または領域を含有するように修飾され得る。
一実施形態において、一次構築物は、5’UTR内、5’UTRの前、および/または5’UTRの後に、少なくとも1つの置換および/または挿入を、一次構築物のRNAポリメラーゼ結合または認識部位の上流、RNAポリメラーゼ結合または認識部位の下流、TATAボックス配列の上流、TATAボックス配列の下流であるが、一次構築物のコーディング領域の上流に含むように設計され得る。
一実施形態において、一次構築物の5’UTRは、同一の塩基のヌクレオチドの少なくとも1つの領域および/またはストリングの挿入によって置換され得る。ヌクレオチドの領域および/またはストリングは、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、または少なくとも8個のヌクレオチドを含み得るが、これらに限定されず、このヌクレオチドは、天然および/または非天然であり得る。非限定的な例として、このヌクレオチド基は、5〜8個のアデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示の他のヌクレオチドのうちのいずれかのストリング、および/またはこれらの組み合わせを含み得る。
一実施形態において、一次構築物の5’UTRは、アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示の他のヌクレオチドのうちのいずれか、および/またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない2つの異なる塩基のヌクレオチドの少なくとも2つの領域および/またはストリングの挿入によって置換され得る。例えば、5’UTRは、5〜8個のアデニン塩基を挿入し、その後、5〜8個のシトシン塩基を挿入することによって置換され得る。別の例において、5’UTRは、5〜8個のシトシン塩基を挿入し、その後、5〜8個のアデニン塩基を挿入することによって置換され得る。
一実施形態において、一次構築物は、RNAポリメラーゼによって認識され得る転写開始部位の下流に少なくとも1つの置換および/または挿入を含み得る。非限定的な例として、少なくとも1つの置換および/または挿入は、転写開始部位のすぐ下流(+1〜+6等であるが、これらに限定されない)の領域内の少なくとも1個の核酸を置換することによって転写開始部位の下流で生じ得る。転写開始部位のすぐ下流のヌクレオチド領域を変化させることにより、開始速度に影響を及ぼし、見かけ上のヌクレオチドトリホスフェート(NTP)反応一定値を増加させ、かつ初期転写物を硬化させることによる転写複合体からの短い転写物の解離を高め得る(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Brieba et al,Biochemistry(2002)41:5144−5149)。少なくとも1個の核酸の修飾、置換、および/または挿入は、核酸配列のサイレント変異を引き起こし得るか、またはアミノ酸配列における変異を引き起こし得る。
一実施形態において、一次構築物は、転写開始部位の下流で、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、または少なくとも13個のグアニン塩基の置換を含み得る。
一実施形態において、一次構築物は、転写開始部位のすぐ下流の領域において、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、または少なくとも6個のグアニン塩基の置換を含み得る。非限定的な例として、その領域内のヌクレオチドがGGGAGAであるとき、グアニン塩基は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、または少なくとも4個のアデニンヌクレオチドによって置換され得る。別の非限定的な例において、その領域内のヌクレオチドがGGGAGAであるとき、グアニン塩基は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、または少なくとも4個のシトシン塩基によって置換され得る。別の非限定的な例において、その領域内のヌクレオチドがGGGAGAであるとき、グアニン塩基は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、もしくは少なくとも4個のチミン、および/または本明細書に記載のヌクレオチドのうちのいずれかによって置換され得る。
一実施形態において、一次構築物は、開始コドンの上流に少なくとも1つの置換および/または挿入を含み得る。明確化のために、当業者は、開始コドンがタンパク質コーディング領域の第1のコドンである一方で、転写開始部位が転写が始まる部位であることを理解する。一次構築物は、ヌクレオチド塩基の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、もしくは少なくとも8つの置換および/または挿入を含み得るが、これらに限定されない。ヌクレオチド塩基は、開始コドンの上流の1つ、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4、もしくは少なくとも5つの位置に挿入または置換され得る。挿入および/または置換されたヌクレオチドは、同一の塩基(例えば、すべてAもしくはすべてCもしくはすべてTもしくはすべてG)、2個の異なる塩基(例えば、AおよびC、AおよびT、もしくはCおよびT)、3個の異なる塩基(例えば、A、C、およびT、もしくはA、C、およびT)、または少なくとも4個の異なる塩基であり得る。非限定的な例として、一次構築物内のコーディング領域の上流のグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、または本明細書に記載のヌクレオチドのうちのいずれかで置換され得る。別の非限定的な例において、一次構築物におけるグアニン塩基の置換は、転写開始部位の下流であり、かつ開始コドンの前の領域に1個のグアニン塩基を残すように設計され得る(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Esvelt et al.Nature(2011)472(7344):499−503を参照のこと)。非限定的な例として、少なくとも5個のヌクレオチドは、転写開始部位の下流および開始コドンの上流の1つの位置に挿入され得、少なくとも5個のヌクレオチドは、同一の塩基型であり得る。
cDNA鋳型除去および浄化 cDNA鋳型は、デオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)での処理等であるが、これに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて除去され得る。RNA浄化は、Beckman Coulter(Danvers,MA)のAGENCOURT(登録商標)CLEANSEQ(登録商標)システム;強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)等であるが、これらに限定されないHPLCに基づく精製方法等であるが、これらに限定されない精製方法も含み得る。
キャッピングおよび/またはテーリング反応 一次構築物またはmmRNAは、キャッピングおよび/またはテーリング反応も経り得る。キャッピング反応は、5’キャップを一次構築物の5’末端に付加する当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。キャッピングのための方法には、ワクシニアキャッピング酵素(New England Biolabs、Ipswich,MA)の使用が含まれるが、これに限定されない。
ポリAテーリング反応は、2’O−メチルトランスフェラーゼおよび本明細書に記載の方法等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。cDNAから生成された一次構築物がポリTを含まない場合、一次構築物が浄化される前にポリAテーリング反応を行うことは有益であり得る。
mRNA精製 一次構築物またはmmRNA精製は、mRNAまたはmmRNA浄化、品質保証、および品質管理を含み得るが、これらに限定されない。mRNAまたはmmRNA浄化は、AGENCOURT(登録商標)ビーズ(Beckman Coulter Genomics、Danvers,MA);ポリTビーズ;LNA(商標)オリゴT捕捉プローブ(EXIQON(登録商標)Inc、Vedbaek,Denmark);または強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)等であるが、これらに限定されないHPLCに基づく精製方法等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法を用いて行われ得る。「精製されたmRNAまたはmmRNA」等の「精製された」という用語は、ポリヌクレオチドとの関連で用いられるとき、少なくとも1つの混入物質から分離されるものを指す。本明細書で使用するとき、「混入物質」とは、別の物質を不適切、不純、または劣性にする任意の物質である。したがって、精製されたポリヌクレオチド(例えば、DNAおよびRNA)は、天然に見られる形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境、またはそれを処理もしくは精製方法に供する前に存在した形態もしくは環境とは異なる形態もしくは環境において存在する。
品質保証および/または品質管理検査は、ゲル電気泳動、紫外線吸収、または分析的HPLC等であるが、これらに限定されない方法を用いて行われ得る。
別の実施形態において、mRNAまたはmmRNAは、逆転写PCRを含むが、これに限定されない方法を用いて配列決定され得る。
一実施形態において、mRNAまたはmmRNAは、紫外可視分光法(UV/Vis)等であるが、これに限定されない方法を用いて定量化され得る。UV/Vis分光計の非限定的な例には、NANODROP(登録商標)分光計(ThermoFisher、Waltham,MA)がある。定量化されたmRNAまたはmmRNAは、mRNAまたはmmRNAが適切な大きさであり得るかを決定し、mRNAまたはmmRNAの分解が生じていないことを確認するために分析され得る。mRNAおよび/またはmmRNAの分解は、アガロースゲル電気泳動;強アニオン交換HPLC、弱アニオン交換HPLC、逆相HPLC(RP−HPLC)、および疎水性相互作用HPLC(HIC−HPLC)等であるが、これらに限定されないHPLCに基づく精製方法;液体クロマトグラフィー質量分析(LCMS);キャピラリー電気泳動(CE);ならびにキャピラリーゲル電気泳動(CGE)等であるが、これらに限定されない方法を用いて確認され得る。
シグナル配列 一次構築物またはmmRNAは、ポリペプチドの治療関連部位への輸送を促進するさらなる特徴もコードし得る。タンパク質輸送を支援するそのような特徴の1つに、シグナル配列がある。本明細書で使用するとき、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」とは、それぞれ、コーディング領域またはコードされたポリペプチドの5’(またはN末端)に組み込まれる、それぞれ、約9〜200ヌクレオチド長(3〜60アミノ酸長)のポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。これらの配列の付加は、1つ以上の分泌経路を通るコードされたポリペプチドの小胞体への輸送をもたらす。いくつかのシグナルペプチドは、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
表5は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAをコードするために組み込まれ得るタンパク質シグナル配列の代表的な一覧である。 表5.シグナル配列
この表において、SSは分泌シグナルであり、MLSはミトコンドリアリーダーシグナルである。本発明の一次構築物またはmmRNAは、配列番号94〜155のシグナル配列のうちのいずれか、またはその断片もしくは変異形をコードするように設計され得る。これらの配列は、ポリペプチドコーディング領域の最初、中間、もしくは最後に含まれ得るか、またはあるいは隣接領域に含まれ得る。さらに、本発明のポリヌクレオチド一次構築物のうちのいずれかは、配列番号32〜93によって定義される配列のうちの1つ以上も含み得る。これらは、第1の領域またはいずれかの隣接領域に存在し得る。
本発明において利用され得るさらなるシグナル配列は、例えば、http://www.signalpeptide.de/またはhttp://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/で見出されるデータベース等のデータベースに教示されるシグナル配列を含む。米国特許第8,124,379号、同第7,413,875号、および同第7,385,034号に記載のものも本発明の範囲内であり、これら各々の内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
標的選択 本発明に従って、一次構築物は、少なくとも1つの目的とするポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの少なくとも1つの第1の領域を含む。本発明の目的とするポリペプチドまたは「標的」が表6に列記される。目的とするポリペプチドをコードする遺伝子の名称および説明(標的説明)に加えて、ENSEMBL転写物配列番号(ENST)、ENSEMBLタンパク質配列番号(ENSP)、および利用可能な場合、最適化されたオープンリーディングフレーム配列番号(最適化されたORF配列番号)も表6に示される。任意の特定の遺伝子について、1つ以上の変異形またはアイソフォームが存在し得る。これらが存在する場合、それらも同様に表に示される。当業者であれば、表に開示されるものが可能性のある隣接領域であることを理解する。これらは、各ENST転写物におけるORFまたはコーディング領域の5’(上流)または3’(下流)のいずれかにコードされる。コーディング領域は、ENSP配列を教示することによって断定的かつ具体的に開示される。その結果として、タンパク質をコードする隣接する教示の配列が隣接領域と見なされる。1つ以上の利用可能なデータベースまたはアルゴリズムを利用することによって5’および3’隣接領域をさらに特徴付けることも可能である。データベースは、ENST転写物の隣接領域に含有される特徴に注釈を付けており、これらは、当技術分野において利用可能である。 表6.核タンパク質
タンパク質切断シグナルおよび部位 一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも1個のタンパク質切断部位を含有する少なくとも1個のタンパク質切断シグナルを含み得る。タンパク質切断部位は、N末端とC末端の真ん中、N末端と中間点との間、中間点とC末端との間、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されないN末端とC末端との間の任意の空間で、N末端、C末端に位置し得る。
本発明のポリペプチドは、プロタンパク質コンバターゼ(またはプロホルモンコンバターゼ)、トロンビン、または第Xa因子タンパク質切断シグナルを含み得るが、これらに限定されない。プロタンパク質コンバターゼは、プロホルモンコンバターゼ1/3(PC1/3)、PC2、フーリン、PC4、PC5/6、対合塩基性アミノ酸切断酵素4(PACE4)、およびPC7として既知の酵母ケキシンに関連した7個の塩基性アミノ酸特異的サブチリシン様セリンプロテイナーゼと、サブチリシンケキシンアイソザイム1(SKI−1)およびプロタンパク質コンバターゼサブチリシンケキシン9(PCSK9)と呼ばれる非塩基性残基で切断する他の2個のサブチラーゼを含む9個のプロテイナーゼのファミリーである。タンパク質切断シグナルアミノ酸配列の非限定的な例が表7に列記される。表7において、「X」は、任意のアミノ酸を指し、「n」は、0、2、4、または6個のアミノ酸であり得、「*」は、タンパク質切断部位を指す。表7において、配列番号26156は、nが4であるときを指し、配列番号26157は、nが6であるときを指す。 表7.タンパク質切断部位配列
一実施形態において、本発明の一次構築物およびmmRNAは、一次構築物またはmmRNAが少なくとも1個のコードされたタンパク質切断シグナルを含有するように操作され得る。コードされたタンパク質切断シグナルは、開始コドンの前、開始コドンの後、コーディング領域の前、コーディング領域内に位置し得、例えば、コーディング領域の中間、開始コドンと中間点との間、中間点と終止コドンとの間、コーディング領域の後、終止コドンの後、2つの終止コドンの間、終止コドンの後、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない。
一実施形態において、本発明の一次構築物またはmmRNAは、少なくとも1個のタンパク質切断部位を含有する少なくとも1個のコードされたタンパク質切断シグナルを含み得る。コードされたタンパク質切断シグナルは、プロタンパク質コンバターゼ(もしくはプロホルモンコンバターゼ)、トロンビン、および/または第Xa因子タンパク質切断シグナルを含み得るが、これらに限定されない。当業者であれば、上の表1または他の既知の方法を用いて、本発明の一次構築物またはmmRNAに含める適切なコードされたタンパク質切断シグナルを決定することができる。例えば、表7のシグナルから始め、表1のコドンを考慮して、結果として生じるポリペプチドにおいてタンパク質シグナルを生成し得る一次構築物のシグナルを設計することができる。
一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも1個のタンパク質切断シグナルおよび/または部位を含む。
非限定的な例として、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第7,374,930号および米国特許公開第20090227660号は、フーリン切断部位を用いて、発現産物におけるGLP−1のN末端メチオニンをその細胞のゴルジ装置から切断する。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、少なくとも1個のタンパク質切断シグナルおよび/または部位を含むが、但し、ポリペプチドがGLP−1ではないことを条件とする。
一実施形態において、本発明の一次構築物またはmmRNAは、少なくとも1個のコードされたタンパク質切断シグナルおよび/または部位を含む。
一実施形態において、本発明の一次構築物またはmmRNAは、少なくとも1個のコードされたタンパク質切断シグナルおよび/または部位を含むが、但し、一次構築物またはmmRNAがGLP−1をコードしないことを条件とする。
一実施形態において、本発明の一次構築物またはmmRNAは、2つ以上のコーディング領域を含み得る。複数のコーディング領域が本発明の一次構築物またはmmRNAに存在する場合、複数のコーディング領域は、コードされたタンパク質切断部位によって分離され得る。非限定的な例として、一次構築物またはmmRNAは、順序付けられたパターンで書き込まれ得る。そのようなパターンは、AXBY形態に従い、式中、AおよびBは、同一もしくは異なるコーディング領域であり得、かつ/または同一もしくは異なるポリペプチドをコードし得るコーディング領域であり、XおよびYは、同一もしくは異なるタンパク質切断シグナルをコードし得るコードされたタンパク質切断シグナルである。第2のそのようなパターンは、AXYBZ形態に従い、式中、AおよびBは、同一もしくは異なるコーディング領域であり得、かつ/または同一もしくは異なるポリペプチドをコードし得るコーディング領域であり、X、Y、およびZは、同一もしくは異なるタンパク質切断シグナルをコードし得るコードされたタンパク質切断シグナルである。第3のパターンは、ABXCY形態に従い、A、B、およびCは、同一もしくは異なるコーディング領域であり得、かつ/または同一もしくは異なるポリペプチドをコードし得るコーディング領域であり、XおよびYは、同一もしくは異なるタンパク質切断シグナルをコードし得るコードされたタンパク質切断シグナルである。
一実施形態において、ポリペプチド、一次構築物および、mmRNAは、ポリペプチド、一次構築物、およびmmRNAがタンパク質切断部位に特異的なプロテアーゼでの処理によって担体領域または融合パートナーから放出され得るように、前述のタンパク質切断部位をコードする配列も含有し得る。
一実施形態において、本発明のポリペプチド、一次構築物、およびmmRNAは、2Aペプチドをコードする配列を含み得る。一実施形態において、この配列を用いて、2個以上の目的とするポリペプチドのコーディング領域を分離することができる。非限定的な例として、2Aペプチドをコードする配列は、コーディング領域Aとコーディング領域Bとの間に存在し得る(A−2Apep−B)。2Aペプチドの存在は、1個の長いタンパク質のタンパク質A、タンパク質B、および2Aペプチドへの切断をもたらす。タンパク質Aおよびタンパク質Bは、同一または異なる目的とするポリペプチドであり得る。別の実施形態において、2Aペプチドを本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAで用いて、2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上のタンパク質を産生することができる。
転写後制御調節因子の組み込み 一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、少なくとも1つの転写後制御調節因子を含み得る。これらの転写後制御調節因子は、小分子、化合物、および制御配列であり得るが、これらに限定されない。非限定的な例として、転写後制御は、GEMS(商標)(小分子による遺伝子発現調節(Gene Expression Modulation by Small−Moleclues))スクリーニング技術を用いてPTC Therapeutics Inc.(South Plainfield,NJ)によって特定された小分子を用いて達成され得る。
転写後制御調節因子は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2006022712号に詳述される方法によってスクリーニングされる遺伝子発現調節因子、またはこれに記載の遺伝子発現調節因子であり得る。翻訳制御に関与するRNA制御配列を特定する方法は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2004067728号に記載されており、遺伝子の非翻訳領域依存的発現を調節する化合物を特定する方法は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2004065561号に記載されている。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAの5’および/または3’非翻訳領域に位置する少なくとも1つの転写後制御調節因子を含み得る。
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、未熟な翻訳終結を調節するために少なくとも1つの転写後制御調節因子を含み得る。転写後制御調節因子は、それぞれ、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2004010106号、同第WO2006044456号、同第WO2006044682号、同第WO2006044503号、および同第WO2006044505号に記載の化合物、またはこれらに概説の方法によって見出される化合物であり得る。非限定的な例として、この化合物は、未熟な翻訳終結を調節するために、28SリボソームRNAの領域に結合し得る(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2004010106号を参照のこと)。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、タンパク質発現を変化させるために少なくとも1つの転写後制御調節因子を含み得る。非限定的な例として、VEGFの発現は、それぞれ、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2005118857号、同第WO2006065480号、同第WO2006065479号、および同第WO2006058088号に記載の化合物、またはこれらに記載の方法によって見出され得る化合物を用いて制御され得る。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、翻訳を制御するために少なくとも1つの転写後制御調節因子を含み得る。一実施形態において、転写後制御調節因子は、RNA制御配列であり得る。非限定的な例として、RNA制御配列は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2006071903号に記載の方法によって特定され得る。
III.修飾 本明細書におけるポリヌクレオチド(一次構築物またはmRNA分子等)において、「修飾」または必要に応じて「修飾された」という用語は、A、G、U、またはCリボヌクレオチドに対する修飾を指す。概して、本明細書において、これらの用語は、天然に存在する5’末端mRNAキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すようには意図されていない。ポリペプチドにおいて、「修飾」という用語は、基準の組の20個のアミノ酸(部分)と比較した修飾を指す。
この修飾は、様々なはっきりと異なる修飾であり得る。いくつかの実施形態において、コーディング領域、隣接領域、および/または末端領域は、1つ、2つ、または2つ以上の(任意に異なる)ヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含有し得る。いくつかの実施形態において、細胞に導入された修飾ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、未修飾ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAと比較して、細胞における分解の減少を呈し得る。
ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、糖、核酸塩基、またはヌクレオシド間結合(例えば、結合リン酸/ホスホジエステル結合/ホスホジエステル骨格への)等に対する任意の有用な修飾を含み得る。ピリミジン核酸塩基の1個以上の原子は、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたチオール、任意に置換されたアルキル(例えば、メチルもしくはエチル)、またはハロ(例えば、クロロもしくはフルオロ)と置き換えれ得るか、またはこれらで置換され得る。ある特定の実施形態において、修飾(例えば、1つ以上の修飾)は、糖およびヌクレオシド間結合の各々において存在する。本発明に従う修飾は、デオキシリボ核酸(DNA)、トレオース核酸(TNA)、グリコール核酸(GNA)、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA)、またはこれらのハイブリッド)に対するリボ核酸(RNA)の修飾であり得る。さらなる修飾が本明細書に記載される。
本明細書に記載されるように、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、mRNAが導入される細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。誘導された自然免疫応答の特徴には、1)炎症誘発性サイトカインの発現の増加、2)細胞内PRR(RIG−I、MDA5等の活性化、および/または3)タンパク質翻訳の終結もしくは減少が含まれる。
ある特定の実施形態において、細胞に導入された修飾核酸分子を細胞内で分解することが望ましくあり得る。例えば、修飾核酸分子の分解は、タンパク質産生の正確なタイミングが所望される場合に好ましくあり得る。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、指向された様式で細胞内で作用され得る、分解ドメインを含有する修飾核酸分子を提供する。別の態様において、本開示は、ポリヌクレオチドとの主溝相互作用(例えば、結合)パートナーの結合を攪乱し得るヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する(例えば、修飾ヌクレオチドは、未修飾ヌクレオチドと比較して、主溝相互作用パートナーに対して低下した結合親和性を有する場合)。
ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、他の作用物質(例えば、RNAi誘導剤、RNAi剤、siRNA、shRNA、miRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、触媒DNA、tRNA、三重らせん形成を誘導するRNA、アプタマー、ベクター等)を任意に含み得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、1個以上のメッセンジャーRNA(mRNA)および1個以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド(例えば、mmRNA分子)を含み得る。これらのポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAについての詳細は、以下に続く。
ポリヌクレオチドおよび一次構築物 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、目的とするポリペプチドをコードする結合ヌクレオシドの第1の領域、第1の領域の5’末端に位置する第1の隣接領域、および第1の領域の3’末端に位置する第2の隣接領域を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA(例えば、第1の領域、第1の隣接領域、または第2の隣接領域)は、式(Ia)もしくは式(Ia−1):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
Uが、O、S、N(RU)nu、またはC(RU)nuであり、式中、nuが、0〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
−−−が、一重結合であるか、または不在であり、
R1’、R2’、R1”、R2”、R1、R2、R3、R4、およびR5の各々が、独立して、存在する場合、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニルであるか、または不在であり、R3と、R1’、R1”、R2’、R2”、またはR5のうちの1つ以上との組み合わせ(例えば、R1’とR3の組み合わせ、R1”とR3の組み合わせ、R2’とR3の組み合わせ、R2”とR3の組み合わせ、またはR5とR3の組み合わせ)が一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得、および、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリル(例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル)を提供し得、R5と、R1’、R1”、R2’、またはR2”のうちの1つ以上との組み合わせ(例えば、R1’とR5の組み合わせ、R1”とR5の組み合わせ、R2’とR5の組み合わせ、またはR2”とR5の組み合わせ)が一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得、および、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリル(例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル)を提供し得、R4と、R1’、R1”、R2’、R2”、R3、またはR5のうちの1つ以上との組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得、および、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリル(例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル)を提供し得、m’およびm”の各々が、独立して、0〜3(例えば、0〜2、0〜1、1〜3、または1〜2)の整数であり、
Y1、Y2、およびY3の各々が、独立して、O、S、Se、−NRN1−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリールであるか、または不在であり、
各Y4が、独立して、H、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
各Y5が、独立して、O、S、Se、任意に置換されたアルキレン(例えば、メチレン)、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、
nが、1〜100,000の整数であり、
Bが、核酸塩基(例えば、プリン、ピリミジン、またはこれらの誘導体)であり、BとR1’の組み合わせ、BとR2’の組み合わせ、BとR1”の組み合わせ、もしくはBとR2”の組み合わせが、それらが結合する炭素と一緒になって、二環式基(例えば、二環式ヘテロシクリル)を任意に形成し得るか、またはB、R1”、およびR3の組み合わせ、もしくはB、R2”、およびR3の組み合わせが、三環式もしくは四環式基(例えば、本明細書の式(IIo)−(IIp)等の三環式または四環式ヘテロシクリル)を任意に形成し得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、修飾リボースを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA(例えば、第1の領域、第1の隣接領域、または第2の隣接領域)は、式(Ia−2)〜(Ia−5)を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA(例えば、第1の領域、第1の隣接領域、または第2の隣接領域)は、式(Ib)もしくは式(Ib−1):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
Uが、O、S、N(RU)nu、またはC(RU)nuであり、式中、nuが、0〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
−−−が、一重結合であるか、または不在であり、
R1、R3’、R3”、およびR4の各々が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニルであるか、または不在であり、R1とR3’の組み合わせまたはR1とR3”の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得(例えば、ロックド核酸を産生するために)、
各R5が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシであるか、または不在であり、
Y1、Y2、およびY3の各々が、独立して、O、S、Se、−NRN1−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり、
各Y4が、独立して、H、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
nが、1〜100,000の整数であり、
Bが、核酸塩基である。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA(例えば、第1の領域、第1の隣接領域、または第2の隣接領域)は、式(Ic):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
Uが、O、S、N(RU)nu、またはC(RU)nuであり、式中、nuが、0〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
−−−が、一重結合であるか、または不在であり、
B1、B2、およびB3の各々が、独立して、核酸塩基(例えば、本明細書に記載のプリン、ピリミジン、またはその誘導体)、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルであり、B1、B2、およびB3のうちの1つのみが核酸塩基であり、
Rb1、Rb2、Rb3、R3、およびR5の各々が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルであり、
Y1、Y2、およびY3の各々が、独立して、O、S、Se、−NRN1−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり、
各Y4が、独立して、H、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
各Y5が、独立して、O、S、Se、任意に置換されたアルキレン(例えば、メチレン)、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、
nが、1〜100,000の整数であり、
Uを含む環が、1つ以上の二重結合を含み得る。
特定の実施形態において、Uを含む環は、U−CB3Rb3間またはCB3Rb3−CB2Rb2間に二重結合を有しない。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA(例えば、第1の領域、第1の隣接領域、または第2の隣接領域)は、式(Id):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
Uが、O、S、N(RU)nu、またはC(RU)nuであり、式中、nuが、0〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
各R3が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルであり、
Y1、Y2、およびY3の各々が、独立して、O、S、Se、−NRN1−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり、
各Y4が、独立して、H、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
各Y5が、独立して、O、S、任意に置換されたアルキレン(例えば、メチレン)、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、
nが、1〜100,000の整数であり、
Bが、核酸塩基(例えば、プリン、ピリミジン、またはその誘導体)である。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA(例えば、第1の領域、第1の隣接領域、または第2の隣接領域)は、式(Ie):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
U’およびU”の各々が、独立して、O、S、N(RU)nu、またはC(RU)nuであり、式中、nuが、0〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり、
各R6が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルであり、
各Y5’が、独立して、O、S、任意に置換されたアルキレン(例えば、メチレンもしくはエチレン)、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、
nが、1〜100,000の整数であり、
Bが、核酸塩基(例えば、プリン、ピリミジン、またはその誘導体)である。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA(例えば、第1の領域、第1の隣接領域、または第2の隣接領域)は、式(If)もしくは(If−1):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
U’およびU”の各々が、独立して、O、S、N、N(RU)nu、またはC(RU)nuであり、式中、nuが、0〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルであり(例えば、U’がOであり、U”がNである)、
−−−が、一重結合であるか、または不在であり、
R1’、R2’、R1”、R2”、R3、およびR4の各々が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニルであるか、または不在であり、R1’とR3の組み合わせ、R1”とR3の組み合わせ、R2’とR3の組み合わせ、またはR2”とR3の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得(例えば、ロックド核酸を産生するため)、m’およびm”の各々が、独立して、0〜3(例えば、0〜2、0〜1、1〜3、または1〜2)の整数であり、
Y1、Y2、およびY3の各々が、独立して、O、S、Se、−NRN1−、任意に置換されたアルキレン、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリールであるか、または不在であり、
各Y4が、独立して、H、ヒドロキシ、チオール、ボラニル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
各Y5が、独立して、O、S、Se、任意に置換されたアルキレン(例えば、メチレン)、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、
nが、1〜100,000の整数であり、
Bが、核酸塩基(例えば、プリン、ピリミジン、またはその誘導体)である。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのいくつかの実施形態において(例えば、式(Ia)、(Ia−1)〜(Ia−3)、(Ib)〜(If)、および(IIa)〜(IIp))、Uを含む環は、1つまたは2つの二重結合を有する。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのいくつかの実施形態において(例えば、式(Ia)〜(Ia−5)、(Ib)〜(If−1)、(IIa)〜(IIp)、(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)〜(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr))、R1、R1’、およびR1”の各々は、存在する場合、Hである。さらなる実施形態において、R2、R2’、およびR2”の各々は、存在する場合、独立して、H、ハロ(例えば、フルオロ)、ヒドロキシ、任意に置換されたアルコキシ(例えば、メトキシもしくはエトキシ)、または任意に置換されたアルコキシアルコキシである。特定の実施形態において、アルコキシアルコキシは、−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’であり、式中、s1が、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’が、HまたはC1〜20アルキルである。いくつかの実施形態において、s2は0であり、s1は1または2であり、s3は0または1であり、R’はC1〜6アルキルである。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのいくつかの実施形態において(例えば、式(Ia)〜(Ia−5)、(Ib)〜(If−1)、(IIa)〜(IIp)、(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)〜(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr))、R2、R2’、およびR2”の各々は、存在する場合、Hである。さらなる実施形態において、R1、R1’、およびR1”の各々は、存在する場合、独立して、H、ハロ(例えば、フルオロ)、ヒドロキシ、任意に置換されたアルコキシ(例えば、メトキシまたはエトキシ)、または任意に置換されたアルコキシアルコキシである。特定の実施形態において、アルコキシアルコキシは、−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’であり、式中、s1が、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’が、HまたはC1〜20アルキルである。いくつかの実施形態において、s2は0であり、s1は1または2であり、s3は0または1であり、R’はC1〜6アルキルである。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのいくつかの実施形態において(例えば、式(Ia)〜(Ia−5)、(Ib)〜(If−1)、(IIa)〜(IIp)、(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)〜(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr))、R3、R4、およびR5の各々は、独立して、H、ハロ(例えば、フルオロ)、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ(例えば、メトキシもしくはエトキシ)、または任意に置換されたアルコキシアルコキシである。特定の実施形態において、R3がHであり、R4がHであり、R5がHであるか、またはR3、R4、およびR5のすべてがHである。特定の実施形態において、R3がC1〜6アルキルであり、R4がC1〜6アルキルであり、R5がC1〜6アルキルであるか、またはR3、R4、およびR5のすべてがC1〜6アルキルである。特定の実施形態において、R3もR4もいずれもHであり、R5はC1〜6アルキルである。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのいくつかの実施形態において(例えば、式(Ia)〜(Ia−5)、(Ib)〜(If−1)、(IIa)〜(IIp)、(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)〜(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr))、R3およびR5が一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し、かつそれらが結合する炭素と一緒になって、トランス−3’,4’類似体等の任意に置換されたヘテロシクリル(例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル)を提供し、R3およびR5が一緒になって、ヘテロアルキレンを形成する(例えば、−(CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3−であって、式中、b1、b2、およびb3の各々が、独立して、0〜3の整数である)。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのいくつかの実施形態において(例えば、式(Ia)〜(Ia−5)、(Ib)〜(If−1)、(IIa)〜(IIp)、(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)〜(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr))、R3と、R1’、R1”、R2’、R2”、またはR5のうちの1つ以上が一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリル(例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル)を提供し、R3と、R1’、R1”、R2’、R2”、またはR5のうちの1つ以上が一緒になって、ヘテロアルキレンを形成する(例えば、−(CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3−であって、式中、b1、b2、およびb3の各々が、独立して、0〜3の整数である)。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのいくつかの実施形態において(例えば、式(Ia)〜(Ia−5)、(Ib)〜(If−1)、(IIa)〜(IIp)、(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)〜(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr))、R5と、R1’、R1”、R2’、またはR2”のうちの1つ以上が一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し、それらが結合する炭素と一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリル(例えば、二環式、三環式、または四環式ヘテロシクリル)を提供し、R5と、R1’、R1”、R2’、またはR2”のうちの1つ以上が一緒になって、ヘテロアルキレンを形成する(例えば、−(CH2)b1O(CH2)b2O(CH2)b3−であって、式中、b1、b2、およびb3の各々が、独立して、0〜3の整数である)。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのいくつかの実施形態において(例えば、式(Ia)〜(Ia−5)、(Ib)〜(If−1)、(IIa)〜(IIp)、(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)〜(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr))、各Y2は、独立して、O、S、または−NRN1−であり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールである。特定の実施形態において、Y2は、NRN1−であり、式中、RN1が、Hまたは任意に置換されたアルキル(例えば、C1〜6アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、またはn−プロピル)である。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのいくつかの実施形態において(例えば、式(Ia)〜(Ia−5)、(Ib)〜(If−1)、(IIa)〜(IIp)、(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)〜(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr))、各Y3は、独立して、OまたはSである。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのいくつかの実施形態において(例えば、式(Ia)〜(Ia−5)、(Ib)〜(If−1)、(IIa)〜(IIp)、(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)〜(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr))、R1は、Hであり、各R2は、独立して、H、ハロ(例えば、フルオロ)、ヒドロキシ、任意に置換されたアルコキシ(例えば、メトキシもしくはエトキシ)、または任意に置換されたアルコキシアルコキシであり(例えば、−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’であり、式中、s1が、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’が、HまたはC1〜20アルキルであり、例えば、式中、s2が0であり、s1が1または2であり、s3が0または1であり(例えば、R’が、C1〜6アルキルであり)、各Y2は、独立して、Oまたは−NRN1−であり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり(例えば、式中、RN1が、Hまたは任意に置換されたアルキル(例えば、C1〜6アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、またはn−プロピル)であり)、各Y3は、独立して、OまたはS(例えば、S)である。さらなる実施形態において、R3は、H、ハロ(例えば、フルオロ)、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ(例えば、メトキシもしくはエトキシ)、または任意に置換されたアルコキシアルコキシである。なおさらなる実施形態において、各Y1は、独立して、Oまたは−NRN1−であり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり(例えば、式中、RN1が、Hまたは任意に置換されたアルキル(例えば、C1〜6アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、またはn−プロピル)であり)、各Y4は、独立して、H、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノである。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのいくつかの実施形態において(例えば、式(Ia)〜(Ia−5)、(Ib)〜(If−1)、(IIa)〜(IIp)、(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)〜(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr))、各R1は、独立して、H、ハロ(例えば、フルオロ)、ヒドロキシ、任意に置換されたアルコキシ(例えば、メトキシもしくはエトキシ)、または任意に置換されたアルコキシアルコキシであり(例えば、−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’であり、式中、s1が、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1〜20アルキルであり(例えば、式中、s2が0であり、s1が1または2であり、s3が0または1であり、R’がC1〜6アルキルであり)、R2がHであり、各Y2は、独立して、Oまたは−NRN1−であり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり(例えば、式中、RN1が、Hまたは任意に置換されたアルキル(例えば、C1〜6アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、またはn−プロピル)であり)、各Y3は、独立して、OまたはS(例えば、S)である。さらなる実施形態において、R3は、H、ハロ(例えば、フルオロ)、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ(例えば、メトキシもしくはエトキシ)、または任意に置換されたアルコキシアルコキシである。なおさらなる実施形態において、各Y1は、独立して、Oまたは−NRN1−であり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり(例えば、式中、RN1が、Hまたは任意に置換されたアルキル(例えば、C1〜6アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、またはn−プロピル)であり)、各Y4は、独立して、H、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、または任意に置換されたアミノである。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのいくつかの実施形態において(例えば、式(Ia)〜(Ia−5)、(Ib)〜(If−1)、(IIa)〜(IIp)、(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)−(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr))、Uを含む環は、β−D(例えば、β−D−リボ)配置である。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのいくつかの実施形態において(例えば、式(Ia)〜(Ia−5)、(Ib)〜(If−1)、(IIa)〜(IIp)、(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)〜(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr))、Uを含む環は、α−L(例えば、α−L−リボ)配置である。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのいくつかの実施形態において(例えば、式(Ia)〜(Ia−5)、(Ib)〜(If−1)、(IIa)〜(IIp)、(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)〜(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr))、1つ以上のBがシュードウリジン(ψ)または5−メチル−シチジン(m5C)であることはない。いくつかの実施形態において、n個のB核酸塩基の約10%〜約100%は、ψでもm5Cでもない(例えば、n個のBの10%〜20%、10%〜35%、10%〜50%、10%〜60%、10%〜75%、10%〜90%、10%〜95%、10%〜98%、10%〜99%、20%〜35%、20%〜50%、20%〜60%、20%〜75%、20%〜90%、20%〜95%、20%〜98%、20%〜99%、20%〜100%、50%〜60%、50%〜75%、50%〜90%、50%〜95%、50%〜98%、50%〜99%、50%〜100%、75%〜90%、75%〜95%、75%〜98%、75%〜99%、および75%〜100%は、ψでもm5Cでもない)。いくつかの実施形態において、Bは、ψでもm5Cでもない。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのいくつかの実施形態において(例えば、式(Ia)〜(Ia−5)、(Ib)〜(If−1)、(IIa)〜(IIp)、(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)〜(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr))、Bが、シトシン、グアニン、ウラシル、およびアデニンから選択される未修飾核酸塩基であるとき、Y1、Y2、またはY3のうちの少なくとも1つは、Oではない。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、修飾リボースを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA(例えば、第1の領域、第1の隣接領域、または第2の隣接領域)は、式(IIa)〜(IIc):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む。特定の実施形態において、Uは、OまたはC(RU)nuであり、式中、nuが、0〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルである(例えば、Uが、−CH2−または−CH−である)。他の実施形態では、R1、R2、R3、R4、およびR5の各々は、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニルであるか、または不在であり(例えば、各R1およびR2は、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、各R3およびR4は、独立して、Hまたは任意に置換されたアルキルであり、R5は、Hまたはヒドロキシであり)、−−−は、一重結合または二重結合である。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはmmRNAは、式(IIb−1)〜(IIb−2):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む。いくつかの実施形態において、Uは、OまたはC(RU)nuであり、式中、nuが、0〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルである(例えば、Uは、−CH2−または−CH−である)。他の実施形態では、R1およびR2 の各々は、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニルであるか、または不在である(例えば、各R1およびR2は、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシ、例えば、H、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、またはアルコキシである)。特定の実施形態において、R2は、ヒドロキシまたは任意に置換されたアルコキシ(例えば、メトキシ、エトキシ、または本明細書に記載のいずれか)である。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、式(IIc−1)〜(IIc−4):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む。いくつかの実施形態において、Uは、OまたはC(RU)nuであり、式中、nuが、0〜2の整数であり、各RUが、独立して、H、ハロ、または任意に置換されたアルキルである(例えば、Uが、−CH2−または−CH−である)。いくつかの実施形態において、R1、R2、およびR3の各々は、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたヒドロキシアルコキシ、任意に置換されたアミノ、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニルであるか、または不在である(例えば、各R1およびR2は、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシ、例えば、H、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、またはアルコキシであり、各R3は、独立して、Hまたは任意に置換されたアルキル)である)。特定の実施形態において、R2は、任意に置換されたアルコキシ(例えば、メトキシもしくはエトキシ、または本明細書に記載のいずれか)である。特定の実施形態において、R1は、任意に置換されたアルキルであり、R2は、ヒドロキシである。他の実施形態では、R1は、ヒドロキシであり、R2は、任意に置換されたアルキルである。さらなる実施形態において、R3は、任意に置換されたアルキルである。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、非環式修飾リボースを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA(例えば、第1の領域、第1の隣接領域、または第2の隣接領域)は、式(IId)〜(IIf):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、非環式修飾ヘキシトールを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA(例えば、第1の領域、第1の隣接領域、または第2の隣接領域)は、式(IIg)〜(IIj):
のn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、短縮または延長したリボース環を有する糖部分を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA(例えば、第1の領域、第1の隣接領域、または第2の隣接領域)は、式 (IIk)〜(IIm):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、R1’、R1”、R2’、およびR2”の各々が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシであるか、または不在であり、R2’とR3の組み合わせまたはR2”とR3の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたアルキレンまたは任意に置換されたヘテロアルキレンを形成し得る。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、ロックド修飾リボースを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA(例えば、第1の領域、第1の隣接領域、または第2の隣接領域)は、式(IIn):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、R3’が、O、S、または−NRN1−であり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり、R3”が、任意に置換されたアルキレン(例えば、−CH2−、−CH2CH2−、もしくは−CH2CH2CH2−)または任意に置換されたヘテロアルキレン(例えば、−CH2NH−、−CH2CH2NH−、−CH2OCH2−、もしくは−CH2CH2OCH2−)である(例えば、R3’がOであり、R3”が任意に置換されたアルキレン(例えば、−CH2−、−CH2CH2−、もしくは−CH2CH2CH2−)である)。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、式(IIn−1)〜(II−n2):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、R3’が、O、S、または−NRN1−であり、式中、RN1が、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたアリールであり、R3”が、任意に置換されたアルキレン(例えば、−CH2−、−CH2CH2−、もしくは−CH2CH2CH2−)または任意に置換されたヘテロアルキレン(例えば、−CH2NH−、−CH2CH2NH−、−CH2OCH2−、もしくは−CH2CH2OCH2−)である(例えば、R3’がOであり、R3”が任意に置換されたアルキレン(例えば、−CH2−、−CH2CH2−、もしくは−CH2CH2CH2−)である)。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、四環式ヘテロシクリルを形成するロックド修飾リボースを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA(例えば、第1の領域、第1の隣接領域、または第2の隣接領域)は、式(IIo):
を有するn個の結合ヌクレオシド、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、R12a、R12c、T1’、T1”、T2’、T2”、V1、およびV3は、本明細書に記載の通りである。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの式のうちのいずれかは、本明細書に記載の1個以上の核酸塩基(例えば、式(b1)〜(b43))を含み得る。
一実施形態において、本発明は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを調製する方法を提供し、このポリヌクレオチドは、本明細書で定義される式(Ia):
を有するn個のヌクレオシドを含み、この方法は、本明細書で定義される式(IIIa):
の化合物を、RNAポリメラーゼおよびcDNA鋳型と反応させることを含む。
さらなる実施形態において、本発明は、少なくとも1個のヌクレオチド(例えば、mmRNA分子)を含むポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを増幅する方法を提供し、この方法は、本明細書で定義される式(IIIa)の化合物を、プライマー、cDNA鋳型、およびRNAポリメラーゼと反応させることを含む。
一実施形態において、本発明は、少なくとも1個のヌクレオチド(例えば、mmRNA分子)を含むポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを調製する方法を提供し、このポリヌクレオチドは、本明細書で定義される式(Ia):
を有するn個のヌクレオシドを含み、この方法は、本明細書で定義される式(IIIa−1):
の化合物を、RNAポリメラーゼおよびcDNA鋳型と反応させることを含む。
さらなる実施形態において、本発明は、少なくとも1個のヌクレオチド(例えば、mmRNA分子)を含むポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを増幅する方法を提供し、この方法は、
本明細書で定義される式(IIIa−1)の化合物を、プライマー、cDNA鋳型、およびRNAポリメラーゼと反応させることを含む。
一実施形態において、本発明は、少なくとも1個のヌクレオチド(例えば、mmRNA分子)を含む修飾mRNAを調製する方法を提供し、このポリヌクレオチドは、本明細書で定義される式(Ia−2):
を有するn個のヌクレオシドを含み、この方法は、本明細書で定義される式(IIIa−2):
の化合物を、RNAポリメラーゼおよびcDNA鋳型と反応させることを含む。
さらなる実施形態において、本発明は、少なくとも1個のヌクレオチド(例えば、mmRNA分子)を含む修飾mRNAを増幅する方法を提供し、この方法は、
本明細書で定義される式(IIIa−2)の化合物を、プライマー、cDNA鋳型、およびRNAポリメラーゼと反応させることを含む。
いくつかの実施形態において、反応は、1〜約7,000回繰り返され得る。本明細書の実施形態のうちのいずれかにおいて、Bは、式(b1)〜(b43)の核酸塩基であり得る。
ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、本明細書に記載の5’および/または3’隣接領域を任意に含み得る。
修飾RNA(mmRNA)分子 本発明は、修飾RNA(mmRNA)分子のビルディングブロック、例えば、修飾リボヌクレオシド、修飾リボヌクレオチドも含む。例えば、これらのビルディングブロックは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの調製に有用であり得る。 いくつかの実施形態において、ビルディングブロック分子は、式(IIIa)もしくは(IIIa−1):
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、置換基は、本明細書に記載のもの(例えば、式(Ia)および(Ia−1))であり、Bが、シトシン、グアニン、ウラシル、およびアデニンから選択される未修飾核酸塩基であるとき、Y1、Y2、またはY3のうちの少なくとも1つは、Oではない。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、式(IVa)〜(IVb):
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Bは、本明細書に記載のもの(例えば、(b1)〜(b43)のうちのいずれか1つ)である。特定の実施形態において、式(IVa)または(IVb)は、修飾ウラシル(例えば、式(b1)〜(b9)、(b21)〜(b23)、および(b28)〜(b31)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b1)、(b8)、(b28)、(b29)、または(b30))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IVa)または(IVb)は、修飾シトシン(例えば、式(b10)〜(b14)、(b24)、(b25)、および(b32)〜(b36)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b10)または(b32))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IVa)または(IVb)は、修飾グアニン(例えば、式(b15)〜(b17)および(b37)〜(b40)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IVa)または(IVb)は、修飾アデニン(例えば、式(b18)〜(b20)および(b41)〜(b43)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、式(IVc)〜(IVk):
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Bは、本明細書に記載のもの(例えば、(b1)〜(b43)のうちのいずれか1つ)である。特定の実施形態において、式(IVc)〜(IVk)のうちの1つは、修飾ウラシル(例えば、式(b1)〜(b9)、(b21)〜(b23)、および(b28)〜(b31)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b1)、(b8)、(b28)、(b29)、または(b30))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IVc)〜(IVk)のうちの1つは、修飾シトシン(例えば、式(b10)〜(b14)、(b24)、(b25)、および(b32)〜(b36)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b10)または(b32))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IVc)〜(IVk)のうちの1つは、修飾グアニン(例えば、式(b15)〜(b17)および(b37)〜(b40)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IVc)〜(IVk)のうちの1つは、修飾アデニン(例えば、式(b18)〜(b20)および(b41)〜(b43)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。
他の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、式(Va)もしくは(Vb):
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Bは、本明細書に記載のもの(例えば、(b1)〜(b43)のうちのいずれか1つ)である。
他の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、式(IXa)〜(IXd):
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Bは、本明細書に記載のもの(例えば、(b1)〜(b43)のうちのいずれか1つ)である。特定の実施形態において、式(IXa)〜(IXd)のうちの1つは、修飾ウラシル(例えば、式(b1)〜(b9)、(b21)〜(b23)、および(b28)〜(b31)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b1)、(b8)、(b28)、(b29)、または(b30))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXa)〜(IXd)のうちの1つは、修飾シトシン(例えば、式(b10)〜(b14)、(b24)、(b25)、および(b32)〜(b36)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b10)または(b32))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXa)〜(IXd)のうちの1つは、修飾グアニン(例えば、式(b15)〜(b17)および(b37)〜(b40)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXa)〜(IXd)のうちの1つは、修飾アデニン(例えば、式(b18)〜(b20)および(b41)〜(b43)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。
他の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、式(IXe)〜(IXg):
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Bは、本明細書に記載のもの(例えば、(b1)〜(b43)のうちのいずれか1つ)である。特定の実施形態において、式(IXe)〜(IXg)のうちの1つは、修飾ウラシル(例えば、式(b1)〜(b9)、(b21)〜(b23)、および(b28)〜(b31)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b1)、(b8)、(b28)、(b29)、または(b30))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXe)〜(IXg)のうちの1つは、修飾シトシン(例えば、式(b10)〜(b14)、(b24)、(b25)、および(b32)〜(b36)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b10)または(b32))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXe)〜(IXg)のうちの1つは、修飾グアニン(例えば、式(b15)〜(b17)および(b37)〜(b40)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXe)〜(IXg)のうちの1つは、修飾アデニン(例えば、式(b18)〜(b20)および(b41)〜(b43)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。
他の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、式(IXh)〜(IXk):
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、Bは、本明細書に記載のもの(例えば、(b1)〜(b43)のうちのいずれか1つ)である。特定の実施形態において、式(IXh)〜(IXk)のうちの1つは、修飾ウラシル(例えば、式(b1)〜(b9)、(b21)〜(b23)、および(b28)〜(b31)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b1)、(b8)、(b28)、(b29)、または(b30))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXh)〜(IXk)のうちの1つは、修飾シトシン(例えば、式(b10)〜(b14)、(b24)、(b25)、および(b32)〜(b36)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b10)または(b32))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXh)〜(IXk)のうちの1つは、修飾グアニン(例えば、式(b15)〜(b17)および(b37)〜(b40)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXh)〜(IXk)のうちの1つは、修飾アデニン(例えば、式(b18)〜(b20)および(b41)〜(b43)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。
他の実施形態では、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、式(IXl)〜(IXr):
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を有し、式中、各r1およびr2は、独立して、0〜5(例えば、0〜3、1〜3、または1〜5)の整数であり、Bは、本明細書に記載のもの(例えば、(b1)〜(b43)のうちのいずれか1つ)である。特定の実施形態において、式(IXl)〜(IXr)のうちの1つは、修飾ウラシル(例えば、式(b1)〜(b9)、(b21)〜(b23)、および(b28)〜(b31)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b1)、(b8)、(b28)、(b29)、または(b30))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXl)〜(IXr)のうちの1つは、修飾シトシン(例えば、式(b10)〜(b14)、(b24)、(b25)、および(b32)〜(b36)のうちのいずれか1つ、例えば、式(b10)または(b32))と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXl)〜(IXr)のうちの1つは、修飾グアニン(例えば、式(b15)〜(b17)および(b37)〜(b40)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。特定の実施形態において、式(IXl)〜(IXr)のうちの1つは、修飾アデニン(例えば、式(b18)〜(b20)および(b41)〜(b43)のうちのいずれか1つ)と組み合わせられる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体からなる群から選択され得、式中、各rは、独立して、0〜5(例えば、0〜3、1〜3、または1〜5)の整数である。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体からなる群から選択され得、式中、各rは、独立して、0〜5(例えば、0〜3、1〜3、または1〜5)の整数であり、s1は、本明細書に記載の通りである。
いくつかの実施形態において、核酸(例えば、RNA、mRNA、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA)に組み込まれ得るビルディングブロック分子は、修飾ウリジンである(例えば、以下からなる群から選択されるもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり、式中、Y1、Y3、Y4、Y6、およびrは、本明細書に記載の通りである(例えば、各rは、独立して、0〜5、例えば、0〜3、1〜3、または1〜5の整数である):
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、修飾シチジンである(例えば、以下からなる群から選択されるもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり、式中、Y1、Y3、Y4、Y6、およびrは、本明細書に記載の通りである(例えば、各rは、独立して、0〜5、例えば、0〜3、1〜3、または1〜5の整数である):
例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり得、式中、各rは、独立して、0〜5(例えば、0〜3、1〜3、または1〜5)の整数である。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、修飾アデノシンである(例えば、以下からなる群から選択されるもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり、式中、Y1、Y3、Y4、Y6、およびrは、本明細書に記載の通りである(例えば、各rは、独立して、0〜5、例えば、0〜3、1〜3、または1〜5の整数である):
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、修飾グアノシンである(例えば、以下からなる群から選択されるもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり、式中、Y1、Y3、Y4、Y6、およびrは、本明細書に記載の通りである(例えば、各rは、独立して、0〜5、例えば、0〜3、1〜3、または1〜5の整数である):
いくつかの実施形態において、化学修飾は、(例えば、ピリミジンヌクレオシド、例えば、シトシンまたはウラシルの)環のC−5のC基のNとの置換(例えば、C−5の>CH基の>NRN1基との置換(式中、RN1は、Hまたは任意に置換されたアルキルである))を含み得る。例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり得、式中、各rは、独立して、0〜5(例えば、0〜3、1〜3、または1〜5)の整数である。
別の実施形態において、化学修飾は、シトシンのC−5の水素のハロ(例えば、Br、Cl、F、もしくはI)または任意に置換されたアルキル(例えば、メチル)との置換を含み得る。例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり得、式中、各rは、独立して、0〜5(例えば、0〜3、1〜3、または1〜5)の整数である。
なおさらなる実施形態において、化学修飾は、C−4位でNH2によって、かつC−5位で炭素原子によって形成される縮合環を含み得る。例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに組み込まれ得るビルディングブロック分子は、
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であり得、式中、各rは、独立して、0〜5(例えば、0〜3、1〜3、または1〜5)の整数である。
糖における修飾 ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA(例えば、本明細書に記載のRNAまたはmRNA)に組み込まれ得る修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド(例えば、ビルディングブロック分子)は、リボ核酸の糖において修飾され得る。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)は、いくつかの異なる置換基で修飾または置換され得る。2’位での例示の置換には、H、ハロ、任意に置換されたC1〜6アルキル、任意に置換されたC1〜6アルコキシ、任意に置換されたC6〜10アリールオキシ、任意に置換されたC3〜8シクロアルキル、任意に置換されたC3〜8シクロアルコキシ、任意に置換されたC6〜10アリールオキシ、任意に置換されたC6〜10アリール−C1〜6アルコキシ、任意に置換されたC1〜12(ヘテロシクリル)オキシ、糖(例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載のいずれか)、ポリエチレングリコール(PEG)、−O(CH2CH2O)nCH2CH2OR(式中、RがHまたは任意に置換されたアルキルであり、nが0〜20(例えば、0〜4、0〜8、0〜10、0〜16、1〜4、1〜8、1〜10、1〜16、1〜20、2〜4、2〜8、2〜10、2〜16、2〜20、4〜8、4〜10、4〜16、および4〜20)の整数である)、2’−ヒドロキシルがC1〜6アルキレンまたはC1〜6ヘテロアルキレン架橋によって同一のリボース糖の4’−炭素に結合される「ロックド」核酸(LNA)(例示の架橋には、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋が挙げられる)、本明細書で定義されるアミノアルキル、本明細書で定義されるアミノアルコキシ、本明細書で定義されるアミノ、および本明細書で定義されるアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。概して、RNAは、酸素を有する5員環の糖類リボースを含む。非限定的な例示の修飾ヌクレオチドには、リボースの酸素の(例えば、S、Se、またはアルキレン、例えば、メチレンまたはエチレンとの)置換、二重結合の付加(例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルと置換するため)、リボースの環縮小(例えば、シクロブタンまたはオキセタンの4員環を形成するため)、リボースの環拡大(例えば、無水ヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、およびホスホラミデート骨格も有するモルホリノ等のさらなる炭素またはヘテロ原子を有する6または7員環を形成するため)、多環式形態(例えば、トリシクロ、および「アンロックド」形態、例えば、グリコール核酸(GNA)(例えば、R−GNAまたはS−GNA、リボースがホスホジエステル結合に結合するグリコール単位で置換される部分)、トレオース核酸(TNA、リボースがα−L−トレオフラノシル−(3’→2’)で置換される部分)、ならびにペプチド核酸(PNA、2−アミノ−エチル−グリシン結合がリボースおよびホスホジエステル骨格を置換する部分)が挙げられる。糖基は、リボースの対応する炭素の立体化学配置とは逆の立体化学配置を有する1個以上の炭素も含有し得る。したがって、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA分子は、糖として、例えば、アラビノースを含有するヌクレオチドを含み得る。
核酸塩基における修飾 本開示は、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドを提供する。本明細書に記載の「ヌクレオシド」は、有機塩基(例えば、プリンもしくはピリミジン)またはその誘導体(本明細書において「核酸塩基」とも称される)と組み合わせて糖分子(例えば、ペントースもしくはリボース)またはその誘導体を含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドと定義される。修飾ヌクレオチドは、(1個以上の修飾または非天然ヌクレオシドを含めるために、例えば、化学的、酵素的、または組換え的に)本明細書に記載の任意の有用な方法によって合成され得る。
修飾ヌクレオチド塩基対合は、標準のアデノシン−チミン、アデノシン−ウラシル、またはグアノシン−シトシン塩基対のみならず、非標準塩基または修飾塩基を含むヌクレオチド間および/または修飾ヌクレオチド間に形成される塩基対も包含し、水素結合ドナーおよび水素結合受容体の配置は、非標準塩基および標準塩基間または2つの相補的非標準塩基構造間の水素結合を可能にする。そのような非標準塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンと、アデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対合である。
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。RNAに見られる核酸塩基の例には、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。DNAに見られる核酸塩基の例には、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンが挙げられるが、これらに限定されない。これらの核酸塩基は、修飾または完全に置換されて、強化された特性、例えば、主溝結合パートナーの結合の破壊によるヌクレアーゼへの耐性を有するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA分子を提供し得る。以下の表8は、各基準のヌクレオチドの化学的外観を特定する。円は、それぞれの化学領域を含む原子を特定する。 表8
いくつかの実施形態において、Bは、修飾ウラシルである。例示の修飾ウラシルは、式(b1)〜(b5):
を有するもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
が、一重または二重結合であり、
T1’、T1”、T2’、およびT2”の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、もしくは任意に置換されたチオアルコキシであるか、またはT1’とT1”の組み合わせもしくはT2’とT2”の組み合わせが一緒になって(例えば、T2にあるような)、O(オキソ)、S(チオ)、もしくはSe(セレノ)を形成し、
V1およびV2の各々が、独立して、O、S、N(RVb)nv、またはC(RVb)nvであり、式中、nvが、0〜2の整数であり、各RVbが、独立して、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたハロアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアミノアルキル(例えば、N−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチルで置換されたもの)、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアシルアミノアルキル(例えば、N−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチルで置換されたもの)、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、または任意に置換されたアルキニルオキシ(例えば、本明細書に記載のいずれかの置換基、例えば、アルキルの(1)〜(21)から選択された置換基で任意に置換されたもの)であり、
R10が、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、ヒドロキシ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、
R11が、Hまたは任意に置換されたアルキルであり、
R12aが、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたカルボキシアルキル(例えば、ヒドロキシで任意に置換されたもの)、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアミノアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、
R12cが、H、ハロ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルである。
他の例示の修飾ウラシルは、式(b6)〜(b9):
を有するもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
が、一重または二重結合であり、
T1’、T1”、T2’、およびT2”の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、もしくは任意に置換されたチオアルコキシであるか、またはT1’とT1”の組み合わせが一緒になって(例えば、T1にあるような)、またはT2’とT2”の組み合わせが一緒になって(例えば、T2にあるような)、O(オキソ)、S(チオ)、もしくはSe(セレノ)を形成するか、または各T1およびT2が、独立して、O(オキソ)、S(チオ)、もしくはSe(セレノ)であり、
W1およびW2の各々が、独立して、N(RWa)nwまたはC(RWa)nwであり、式中、nwが、0〜2の整数であり、各RWaが、独立して、H、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、
各V3が、独立して、O、S、N(RVa)nv、またはC(RVa)nvであり、式中、nvが、0〜2の整数であり、各RVaが、独立して、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルキル(例えば、N−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたもの)、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアシルアミノアルキル(例えば、N−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチルで置換されたもの)、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアシル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル(例えば、ヒドロキシおよび/もしくはO−保護基で任意に置換されたもの)、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアミノアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキル(例えば、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、アルキルの(1)〜(21)から選択される置換基で任意に置換されたもの)であり、RVaおよびR12cが、それらが結合する炭素原子と一緒になって、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロシクリル(例えば、5もしくは6員環)を形成し得、
R12aが、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたカルボキシアルキル(例えば、ヒドロキシおよび/もしくはO−保護基で任意に置換されたもの)、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアミノアルキル、任意に置換されたカルバモイルアルキルであるか、または不在であり、
R12bは、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアルキルアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルコキシカルボニルアシル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル(例えば、ヒドロキシおよび/もしくはO−保護基で任意に置換されたもの)、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアミノアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、
R12bとT1’の組み合わせまたはR12bとR12cの組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
R12cは、H、ハロ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルである。
さらなる例示の修飾ウラシルは、式(b28)〜(b31):
を有するもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
T1およびT2の各々が、独立して、O(オキソ)、S(チオ)、またはSe(セレノ)であり、
各RVb’およびRVb”が、独立して、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたハロアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルキル(例えば、N−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたもの)、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアシルアミノアルキル(例えば、N−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチルで置換されたもの)、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアシル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル(例えば、ヒドロキシおよび/もしくはO−保護基で任意に置換されたもの)、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアミノアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキル(例えば、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、アルキルの(1)〜(21)から選択される置換基で任意に置換されたもの)であり(例えば、RVb’が、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキル、例えば、N−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたものであり)、
R12aが、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたカルボキシアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルキル(例えば、例えば、N−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたもの)、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルであり、
R12bが、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル(例えば、例えば、N−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたもの)、
任意に置換されたアルコキシカルボニルアシル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルである。
特定の実施形態において、T1は、O(オキソ)であり、T2は、S(チオ)またはSe(セレノ)である。他の実施形態では、T1は、S(チオ)であり、T2は、O(オキソ)またはSe(セレノ)である。いくつかの実施形態において、RVb’は、H、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシである。
他の実施形態では、各R12aおよびR12bは、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、または任意に置換されたヒドロキシアルキルである。特定の実施形態において、R12aは、Hである。他の実施形態では、R12aもR12bもいずれもHである。
いくつかの実施形態において、R12bの各RVb’は、独立して、任意に置換されたアミノアルキル(例えば、N−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチル、もしくはスルホアルキルで置換されたもの)、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、または任意に置換されたアシルアミノアルキル(例えば、N−保護基、例えば、本明細書に記載のいずれか、例えば、トリフルオロアセチルで置換されたもの)である。いくつかの実施形態において、任意に置換されたアミノアルキルのアミノおよび/またはアルキルは、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたスルホアルキル、任意に置換されたカルボキシ(例えば、O−保護基で置換されたもの)、任意に置換されたヒドロキシ(例えば、O−保護基で置換されたもの)、任意に置換されたカルボキシアルキル(例えば、O−保護基で置換されたもの)、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル(例えば、O−保護基で置換されたもの)、またはN−保護基のうちの1つ以上で置換される。いくつかの実施形態において、任意に置換されたアミノアルキルは、任意に置換されたスルホアルキルまたは任意に置換されたアルケニルで置換される。特定の実施形態において、R12aもRVb”もいずれもHである。特定の実施形態において、T1は、O(オキソ)であり、T2は、S(チオ)またはSe(セレノ)である。
いくつかの実施形態において、RVb’は、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキルまたは任意に置換されたカルバモイルアルキルである。
特定の実施形態において、R12a、R12b、R12c、またはRVaの任意の置換基は、ポリエチレングリコール基(例えば、−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’であり、式中、s1が、1〜10(例えば、1〜6もしくは1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、もしくは1〜10)の整数であり、R’が、HもしくはC1〜20アルキルである)、またはアミノ−ポリエチレングリコール基(例えば、−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1であり、式中、s1が、1〜10(例えば、1〜6もしくは1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、もしくは1〜10)の整数であり、各RN1が、独立して、水素もしくは任意に置換されたC1〜6アルキルである)である。
いくつかの実施形態において、Bは、修飾シトシンである。例示の修飾シトシンは、式(b10)〜(b14):
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、 式中、
T3’およびT3”の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、もしくは任意に置換されたチオアルコキシであるか、またはT3’とT3”の組み合わせが一緒になって(例えば、T3にあるような)、O(オキソ)、S(チオ)、もしくはSe(セレノ)を形成し、
各V4が、独立して、O、S、N(RVc)nv、またはC(RVc)nvであり、式中、nvが、0〜2の整数であり、各RVcが、独立して、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、または任意に置換されたアルキニルオキシ(例えば、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、アルキルの(1)〜(21)から選択される置換基で任意に置換されたもの)であり、R13bとRVcの組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
各V5が、独立して、N(RVd)nv、またはC(RVd)nvであり、式中、nvが、0〜2の整数であり、各RVdが、独立して、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、または任意に置換されたアルキニルオキシ(例えば、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、アルキルの(1)〜(21)から選択される置換基で任意に置換されたもの)であり(例えば、V5が、−CHまたはNであり)、
R13aおよびR13bの各々が、独立して、H、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアシルオキシアルキル、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、R13bとR14の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
各R14が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたハロアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル(例えば、O−保護基で置換されたもの)、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアシルオキシアルキル、任意に置換されたアミノ(例えば、−NHR(式中、Rが、H、アルキル、アリール、もしくはホスホリルである))、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキルであり、
R15およびR16の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルである。
さらなる例示の修飾シトシンは、式(b32)〜(b35):
を有するもの、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
T1およびT3の各々が、独立して、O(オキソ)、S(チオ)、またはSe(セレノ)であり、
R13aおよびR13bの各々が、独立して、H、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアシルオキシアルキル、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、R13bとR14の組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
各R14が、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたハロアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル(例えば、O−保護基で置換されたもの)、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアシルオキシアルキル、任意に置換されたアミノ(例えば、−NHR(式中、Rが、H、アルキル、アリール、もしくはホスホリルである)、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアミノアルキル(例えば、ヒドロキシアルキル、アルキル、アルケニル、もしくはアルキニル)、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルであり、
R15およびR16の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルである(例えば、R15が、Hであり、R16が、Hまたは任意に置換されたアルキルである)。
いくつかの実施形態において、R15は、Hであり、R16は、Hまたは任意に置換されたアルキルである。特定の実施形態において、R14は、H、アシル、またはヒドロキシアルキルである。いくつかの実施形態において、R14は、ハロである。いくつかの実施形態において、R14もR15もいずれもHである。いくつかの実施形態において、R15もR16もいずれもHである。いくつかの実施形態において、R14およびR15およびR16の各々は、Hである。さらなる実施形態において、R13aおよびR13bの各々は、独立して、Hまたは任意に置換されたアルキルである。
修飾シトシンのさらなる非限定的な例には、式(b36):
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体が挙げられ、
式中、
各R13bが、独立して、H、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアシルオキシアルキル、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、R13bとR14bの組み合わせが一緒になって、任意に置換されたヘテロシクリルを形成し得、
各R14aおよびR14bが、独立して、H、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたハロアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル(例えば、O−保護基で置換されたもの)、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、任意に置換されたアルキニルオキシ、任意に置換されたアミノアルコキシ、任意に置換されたアルコキシアルコキシ、任意に置換されたアシルオキシアルキル、任意に置換されたアミノ(例えば、−NHR(式中、Rが、H、アルキル、アリール、ホスホリル、任意に置換されたアミノアルキル、もしくは任意に置換されたカルボキシアミノアルキルである))、アジド、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、または任意に置換されたアミノアルキニルであり、
R15の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルである。
特定の実施形態において、R14bは、任意に置換されたアミノ酸(例えば、任意に置換されたリジン)である。いくつかの実施形態において、R14aは、Hである。
いくつかの実施形態において、Bは、修飾グアニンである。例示の修飾グアニンは、式(b15)〜(b17):
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
T4’、T4”、T5’、T5”、T6’、およびT6”の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、T4’とT4”の組み合わせ(例えば、T4にあるような)またはT5’とT5”の組み合わせ(例えば、T5にあるような)またはT6’とT6”の組み合わせ(例えば、T6にあるような)が一緒になって、O(オキソ)、S(チオ)、またはSe(セレノ)を形成し、
V5およびV6の各々が、独立して、O、S、N(RVd)nv、またはC(RVd)nvであり、式中、nvが、0〜2の整数であり、各RVdが、独立して、H、ハロ、チオール、任意に置換されたアミノ酸、シアノ、アミジン、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシ(例えば、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、アルキルの(1)〜(21)から選択される置換基で任意に置換されたもの)、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
R17、R18、R19a、R19b、R21、R22、R23、およびR24の各々が、独立して、H、ハロ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアミノ、または任意に置換されたアミノ酸である。
例示の修飾グアノシンは、式(b37)〜(b40):
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
T4’の各々が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアルコキシであり、各T4が、独立して、O(オキソ)、S(チオ)、またはSe(セレノ)であり、
R18、R19a、R19b、およびR21の各々が、独立して、H、ハロ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたチオアルコキシ、任意に置換されたアミノ、または任意に置換されたアミノ酸である。
いくつかの実施形態において、R18は、Hまたは任意に置換されたアルキルである。さらなる実施形態において、T4は、オキソである。いくつかの実施形態において、R19aおよびR19bの各々は、独立して、Hまたは任意に置換されたアルキルである。
いくつかの実施形態において、Bは、修飾アデニンである。例示の修飾アデニンは、式(b18)〜(b20):
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、式中、各V7が、独立して、O、S、N(RVe)nv、またはC(RVe)nvであり、式中、nvが、0〜2の整数であり、各RVeが、独立して、H、ハロ、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルケニルオキシ、または任意に置換されたアルキニルオキシ(例えば、本明細書に記載の任意の置換基、例えば、アルキルの(1)〜(21)から選択される置換基で任意に置換されたもの)であり、
各R25が、独立して、H、ハロ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
R26aおよびR26bの各々が、独立して、H、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたカルバモイルアルキル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、またはポリエチレングリコール基(例えば、−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’(式中、s1が、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’が、HまたはC1〜20アルキル)である))、またはアミノポリエチレングリコール基(例えば、−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1(式中、s1が、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1が、独立して、水素または任意に置換されたC1〜6アルキルである))であり、
各R27が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
各R28が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアルキニルであり、
各R29が、独立して、H、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたカルバモイルアルキル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたアミノである。
例示の修飾アデニンは、式(b41)〜(b43):
の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含み、
式中、
各R25が、独立して、H、ハロ、チオール、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノであり、
R26aおよびR26bの各々が、独立して、H、任意に置換されたアシル、任意に置換されたアミノ酸、任意に置換されたカルバモイルアルキル、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたヒドロキシアルキル、任意に置換されたヒドロキシアルケニル、任意に置換されたヒドロキシアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、またはポリエチレングリコール基(例えば、−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’(式中、s1が、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’が、HまたはC1〜20アルキルである))、またはアミノポリエチレングリコール基(例えば、−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1(式中、s1が、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1が、独立して、水素または任意に置換されたC1〜6アルキルである))であり、
各R27が、独立して、H、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたチオアルコキシ、または任意に置換されたアミノである。
いくつかの実施形態において、R26aは、Hであり、R26bは、任意に置換されたアルキルである。いくつかの実施形態において、R26aおよびR26bの各々は、独立して、任意に置換されたアルキルである。特定の実施形態において、R27は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたチオアルコキシである。他の実施形態では、R25は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、または任意に置換されたチオアルコキシである。
特定の実施形態において、R26a、R26b、またはR29の任意の置換基は、ポリエチレングリコール基(例えば、−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’(式中、s1が、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’が、HまたはC1〜20アルキルである))、またはアミノポリエチレングリコール基(例えば、−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1(式中、s1が、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々が、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1が、独立して、水素または任意に置換されたC1〜6アルキルである))である。
いくつかの実施形態において、Bは、式(b21):
を有し得、式中、X12は、独立して、O、S、任意に置換されたアルキレン(例えば、メチレン)、または任意に置換されたヘテロアルキレンであり、xaは、0〜3の整数であり、R12aおよびT2は、本明細書に記載の通りである。
いくつかの実施形態において、Bは、式(b22):
を有し得、式中、R10’は、独立して、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、R11、R12a、T1、およびT2は、本明細書に記載の通りである。
いくつかの実施形態において、Bは、式(b23):
を有し得、式中、R10は、任意に置換されたヘテロシクリル(例えば、任意に置換されたフリル、任意に置換されたチエニル、もしくは任意に置換されたピロリル)、任意に置換されたアリール(例えば、任意に置換されたフェニルもしくは任意に置換されたナフチル)、または本明細書に記載の任意の置換基(例えば、R10のもの)であり、R11(例えば、Hまたは本明細書に記載の任意の置換基)、R12a(例えば、Hまたは本明細書に記載の任意の置換基)、T1(例えば、オキソまたは本明細書に記載の任意の置換基)、およびT2(例えば、オキソまたは本明細書に記載の任意の置換基)は、本明細書に記載の通りである。 いくつかの実施形態において、Bは、式(b24):
を有し得、式中、R14’は、独立して、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアルキルアリール、任意に置換されたアルキルヘテロシクリル、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたアミノアルケニル、任意に置換されたアミノアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルケニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキニル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルキル、任意に置換されたアルコキシカルボニルアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルコキシ、任意に置換されたカルボキシアルキル、または任意に置換されたカルバモイルアルキルであり、R13a、R13b、R15、およびT3は、本明細書に記載の通りである。
いくつかの実施形態において、Bは、式(b25):
を有し得、式中、R14’は、任意に置換されたヘテロシクリル(例えば、任意に置換されたフリル、任意に置換されたチエニル、もしくは任意に置換されたピロリル)、任意に置換されたアリール(例えば、任意に置換されたフェニルもしくは任意に置換されたナフチル)、または本明細書に記載の任意の置換基(例えば、R14またはR14’のもの)であり、R13a(例えば、Hまたは本明細書に記載の任意の置換基)、R13b(例えば、Hまたは本明細書に記載の任意の置換基)、R15(例えば、Hまたは本明細書に記載の任意の置換基)、およびT3(例えば、オキソまたは本明細書に記載の任意の置換基)は、本明細書に記載の通りである。
いくつかの実施形態において、Bは、シトシン、グアニン、アデニン、およびウラシルからなる群から選択される核酸塩基である。いくつかの実施形態において、Bは、
であり得る。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する例示の核酸塩基およびヌクレオシドには、シュードウリジン(ψ)、ピリジン−4−オンリボヌクレオシド、5−アザ−ウリジン、6−アザ−ウリジン、2−チオ−5−アザ−ウリジン、2−チオ−ウリジン(s2U)、4−チオ−ウリジン(s4U)、4−チオ−シュードウリジン、2−チオ−シュードウリジン、5−ヒドロキシ−ウリジン(ho5U)、5−アミノアリル−ウリジン、5−ハロ−ウリジン(例えば、5−ヨード−ウリジンまたは5−ブロモ−ウリジン)、3−メチル−ウリジン(m3U)、5−メトキシ−ウリジン(mo5U)、ウリジン5−オキシ酢酸(cmo5U)、ウリジン5−オキシ酢酸メチルエステル(mcmo5U)、5−カルボキシメチル−ウリジン(cm5U)、1−カルボキシメチル−シュードウリジン、5−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン(chm5U)、5−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル(mchm5U)、5−メトキシカルボニルメチル−ウリジン(mcm5U)、5−メトキシカルボニルメチル−2−チオ−ウリジン(mcm5s2U)、5−アミノメチル−2−チオ−ウリジン(nm5s2U)、5−メチルアミノメチル−ウリジン(mnm5U)、5−メチルアミノメチル−2−チオ−ウリジン(mnm5s2U)、5−メチルアミノメチル−2−セレノ−ウリジン(mnm5se2U)、5−カルバモイルメチル−ウリジン(ncm5U)、5−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン(cmnm5U)、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオ−ウリジン(cmnm5s2U)、5−プロピニル−ウリジン、1−プロピニル−シュードウリジン、5−タウリノメチル−ウリジン(τm5U)、1−タウリノメチル−シュードウリジン、5−タウリノメチル−2−チオ−ウリジン(τm5s2U)、1−タウリノメチル−4−チオ−シュードウリジン、5−メチル−ウリジン(m5U、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有するもの)、1−メチルシュードウリジン(m1ψ)、5−メチル−2−チオ−ウリジン(m5s2U)、1−メチル−4−チオ−シュードウリジン(m1s4ψ)、4−チオ−1−メチル−シュードウリジン、3−メチル−シュードウリジン(m3ψ)、2−チオ−1−メチル−シュードウリジン、1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン(D)、ジヒドロシュードウリジン、5,6−ジヒドロウリジン、5−メチル−ジヒドロウリジン(m5D)、2−チオ−ジヒドロウリジン、2−チオ−ジヒドロシュードウリジン、2−メトキシ−ウリジン、2−メトキシ−4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−シュードウリジン、4−メトキシ−2−チオ−シュードウリジン、N1−メチル−シュードウリジン(1−メチルシュードウリジン(m1ψ)としても既知のもの)、3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)ウリジン(acp3U)、1−メチル−3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)シュードウリジン(acp3ψ)、5−(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(inm5U)、5−(イソペンテニルアミノメチル)−2−チオ−ウリジン(inm5s2U)、α−チオ−ウリジン、2’−O−メチル−ウリジン(Um)、5,2’−O−ジメチル−ウリジン(m5Um)、2’−O−メチル−シュードウリジン(ψm)、2−チオ−2’−O−メチル−ウリジン(s2Um)、5−メトキシカルボニルメチル−2’−O−メチル−ウリジン(mcm5Um)、5−カルバモイルメチル−2’−O−メチル−ウリジン(ncm5Um)、5−カルボキシメチルアミノメチル−2’−O−メチル−ウリジン(cmnm5Um)、3,2’−O−ジメチル−ウリジン(m3Um)、5−(イソペンテニルアミノメチル)−2’−O−メチル−ウリジン(inm5Um)、1−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、2’‐F‐アラ‐ウリジン、2’‐F‐ウリジン、2’‐OH‐アラ‐ウリジン、5‐(2‐カルボメトキシビニル)ウリジン、および5‐[3‐(1‐E‐プロペニルアミノ)ウリジンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する例示の核酸塩基およびヌクレオシドには、5−アザ−シチジン、6−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、3−メチル−シチジン(m3C)、N4−アセチル−シチジン(ac4C)、5−ホルミル−シチジン(f5C)、N4−メチル−シチジン(m4C)、5−メチル−シチジン(m5C)、5−ハロ−シチジン(例えば、5−ヨード−シチジン)、5−ヒドロキシメチル−シチジン(hm5C)、1−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、2−チオ−シチジン(s2C)、2−チオ−5−メチル−シチジン、4−チオ−シュードイソシチジン、4−チオ−1−メチル−シュードイソシチジン、4−チオ−1−メチル−1−デアザ−シュードイソシチジン、1−メチル−1−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、5−アザ−ゼブラリン、5−メチル−ゼブラリン、5−アザ−2−チオ−ゼブラリン、2−チオ−ゼブラリン、2−メトキシ−シチジン、2−メトキシ−5−メチル−シチジン、4−メトキシ−シュードイソシチジン、4−メトキシ−1−メチル−シュードイソシチジン、リシジン(k2C)、α−チオ−シチジン、2’−O−メチル−シチジン(Cm)、5,2’−O−ジメチル−シチジン(m5Cm)、N4−アセチル−2’−O−メチル−シチジン(ac4Cm)、N4,2’−O−ジメチル−シチジン(m4Cm)、5−ホルミル−2’−O−メチル−シチジン(f5Cm)、N4,N4,2’−O−triメチル−シチジン(m42Cm)、1−チオ−シチジン、2’‐F‐アラ‐シチジン、2’‐F‐シチジン、および2’‐OH‐アラ‐シチジンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示の核酸塩基およびヌクレオシドには、2−アミノ−プリン、2、6−ジアミノプリン、2−アミノ−6−ハロ−プリン(例えば、2−アミノ−6−クロロ−プリン)、6−ハロ−プリン(例えば、6−クロロ−プリン)、2−アミノ−6−メチル−プリン、8−アジド−アデノシン、7−デアザ−アデニン、7−デアザ−8−アザ−アデニン、7−デアザ−2−アミノ−プリン、7−デアザ−8−アザ−2−アミノ−プリン、7−デアザ−2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2,6−ジアミノプリン、1−メチル−アデノシン(m1A)、2−メチル−アデニン(m2A)、N6−メチル−アデノシン(m6A)、2−メチルチオ−N6−メチル−アデノシン(ms2m6A)、N6−イソペンテニル−アデノシン(i6A)、2−メチルチオ−N6−イソペンテニル−アデノシン(ms2i6A)、N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(io6A)、2−メチルチオ−N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(ms2io6A)、N6−グリシニルカルバモイル−アデノシン(g6A)、N6−トレオニルカルバモイル−アデノシン(t6A)、N6−メチル−N6−トレオニルカルバモイル−アデノシン(m6t6A)、2−メチルチオ−N6−トレオニルカルバモイル−アデノシン(ms2g6A)、N6,N6−ジメチル−アデノシン(m62A)、N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン(hn6A)、2−メチルチオ−N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン(ms2hn6A)、N6−アセチル−アデノシン(ac6A)、7−メチル−アデニン、2−メチルチオ−アデニン、2−メトキシ−アデニン、α−チオ−アデノシン、2’−O−メチル−アデノシン(Am)、N6,2’−O−ジメチル−アデノシン(m6Am)、N6,N6,2’−O−triメチル−アデノシン(m62Am)、1,2’−O−ジメチル−アデノシン(m1Am)、2’−O−リボシルアデノシン(ホスフェート)(Ar(p))、2−アミノ−N6−メチル−プリン、1−チオ−アデノシン、8−アジド−アデノシン、2’‐F‐アラ‐アデノシン、2’‐F‐アデノシン、2’‐OH‐アラ‐アデノシン、およびN6‐(19‐アミノ‐ペンタオキサノナデシル)−アデノシンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示の核酸塩基およびヌクレオシドには、イノシン(I)、1−メチル−イノシン(m1I)、ワイオシン(imG)、メチルワイオシン(mimG)、4−デメチル−ワイオシン(imG−14)、イソワイオシン(imG2)、ワイブトシン(yW)、ペルオキシワイブトシン(o2yW)、ヒドロキシワイブトシン(OHyW)、未修飾ヒドロキシワイブトシン(OHyW*)、7−デアザ−グアノシン、クエオシン(Q)、エポキシクエオシン(oQ)、ガラクトシル−クエオシン(galQ)、マンノシル−クエオシン(manQ)、7−シアノ−7−デアザ−グアノシン(preQ0)、7−アミノメチル−7−デアザ−グアノシン(preQ1)、アルカエオシン(G+)、7−デアザ−8−アザ−グアノシン、6−チオ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−8−アザ−グアノシン、7−メチル−グアノシン(m7G)、6−チオ−7−メチル−グアノシン、7−メチル−イノシン、6−メトキシ−グアノシン、1−メチル−グアノシン(m1G)、N2−メチル−グアノシン(m2G)、N2,N2−ジメチル−グアノシン(m22G)、N2,7−ジメチル−グアノシン(m2,7G)、N2、N2,7−ジメチル−グアノシン(m2,2,7G)、8−オキソ−グアノシン、7−メチル−8−オキソ−グアノシン、1−メチル−6−チオ−グアノシン、N2−メチル−6−チオ−グアノシン、N2,N2−ジメチル−6−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、2’−O−メチル−グアノシン(Gm)、N2−メチル−2’−O−メチル−グアノシン(m2Gm)、N2,N2−ジメチル−2’−O−メチル−グアノシン(m22Gm)、1−メチル−2’−O−メチル−グアノシン(m1Gm)、N2,7−ジメチル−2’−O−メチル−グアノシン(m2,7Gm)、2’−O−メチル−イノシン(Im)、1,2’−O−ジメチル−イノシン(m1Im)、および2’−O−リボシルグアノシン(ホスフェート)(Gr(p))が挙げられる。
ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリン、またはピリミジン類似体から独立して選択され得る。例えば、核酸塩基はそれぞれ、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、またはヒポキサンチンから独立して選択され得る。別の実施形態において、核酸塩基には、例えば、ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン、5−メチルシトシン(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2−プロピルおよび他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミンおよび2−チオシトシン、5−プロピニルウラシルおよびシトシン、6−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5−ウラシル(シュードウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ(例えば、8−ブロモ)、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシルおよび他の8−置換アデニンおよびグアニン、5−ハロ、特に、5−ブロモ、5−トリフルオロメチルおよび他の5−置換ウラシルおよびシトシン、7−メチルグアニンおよび7−メチルアデニン、8−アザグアニンおよび8−アザアデニン、デアザグアニン、7−デアザグアニン、3−デアザグアニン、デアザアデニン、7−デアザアデニン、3−デアザアデニン、ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン、イミダゾ[1,5−a]1,3,5トリアジノン、9−デアザプリン、イミダゾ[4,5−d]ピラジン、チアゾロ[4,5−d]ピリミジン、ピラジン−2−オン、1,2,4−トリアジン、ピリダジン、および1,3,5トリアジンを含む塩基の天然に存在する合成誘導体も含み得る。ヌクレオチドがA、G、C、T、またはUの略語を用いて示されるとき、各文字は、代表的な塩基および/またはその誘導体を指し、例えば、Aは、アデニン、または、例えば、7−デアザアデニンのようなアデニン類似体を含む。
ヌクレオシド間結合における修飾 ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA分子に組み込まれ得る修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合(例えば、リン酸骨格)において修飾され得る。本明細書において、ポリヌクレオチド骨格との関連で、「リン酸塩」および「ホスホジエステル」という表現は、同義に使用される。骨格リン酸基は、酸素原子のうちの1個以上を異なる置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、未修飾リン酸塩部分の別の本明細書に記載のヌクレオシド間結合との大規模な置換を含み得る。修飾リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレナート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロラミデート、ホスホロジアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオエートは、硫黄で置換された両方の非結合酸素を有する。リン酸リンカーは、結合酸素の窒素(架橋ホスホロアミデート)、硫黄(架橋ホスホロチオエート)、および炭素(架橋メチレンホスホネート)での置換によっても修飾され得る。
α−チオ置換リン酸部分は、非天然ホスホロチオエート骨格結合を介してRNAおよびDNAポリマーに安定性を付与するように提供される。ホスホロチオエートDNAおよびRNAは、ヌクレアーゼ耐性の増加、続いて細胞環境においてより長い半減期を有する。ホスホロチオエート結合ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA分子は、細胞の自然免疫分子のより弱い結合/活性化によって自然免疫応答も低下させることが見込まれている。
特定の実施形態において、修飾ヌクレオシドは、α−チオ−ヌクレオシド(例えば、5’−O−(1−チオホスフェート)−アデノシン、5’−O−(1−チオホスフェート)−シチジン(α−チオ−シチジン)、5’−O−(1−チオホスフェート)−グアノシン、5’−O−(1−チオホスフェート)−ウリジン、または5’−O−(1−チオホスフェート)−シュードウリジン)を含む。
リン原子を含有しないヌクレオシド間結合を含む本発明に従って用いられ得る他のヌクレオシド間結合は、以下の本明細書に記載される。
修飾糖、核酸塩基、およびヌクレオシド間結合の組み合わせ 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、糖、核酸塩基、および/またはヌクレオシド間結合への修飾の組み合わせを含み得る。これらの組み合わせは、本明細書に記載のいずれか1つ以上の修飾を含み得る。例えば、式(Ia)、(Ia−1)〜(Ia−3)、(Ib)〜(If)、(IIa)〜(IIp)、(IIb−1)、(IIb−2)、(IIc−1)〜(IIc−2)、(IIn−1)、(IIn−2)、(IVa)〜(IVl)、および(IXa)〜(IXr)における本明細書に記載のヌクレオチドのうちのいずれかは、本明細書に記載の核酸塩基のうちのいずれ(例えば、式(b1)〜(b43)または本明細書に記載の任意の他のもの)とも組み合わせられ得る。
ポリペプチド、一次構築物、およびmmRNA分子の合成 本発明に従って用いるポリペプチド、一次構築物、およびmmRNA分子は、本明細書に記載の任意の有用な技法に従って調製され得る。本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNA分子の合成において用いられる修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の一般的な方法および手順を用いて容易に入手可能な出発物質から調製され得る。典型的なプロセス条件または好ましいプロセス条件(例えば、反応温度、時間、反応物質のモル比、溶媒、圧力等)が提供される場合、当業者であれば、さらなるプロセス条件を最適化および開発することができるであろう。最適な反応条件は、用いる特定の反応物または溶媒によって異なり得るが、そのような条件は、日常的な最適化手順を用いて当業者によって決定され得る。
本明細書に記載のプロセスは、当技術分野で既知の任意の好適な方法に従って監視され得る。例えば、産物形成は、核磁気共鳴分光学(例えば、1Hもしくは13C)、赤外線分光学、分光測光(例えば、紫外線可視)、もしく質量分析等の分光学的手段、または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)もしくは薄層クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーによって監視され得る。
本発明のポリペプチド、一次構築物、およびmmRNA分子の調製は、様々な化学基の保護および脱保護を伴い得る。保護および脱保護の必要性、ならびに適切な保護基の選択は、当業者によって容易に決定され得る。保護基の化学は、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Greene,et al.,Protective Groups in Organic Synthesis,2d.Ed.,Wiley & Sons,1991において見出され得る。
本明細書に記載のプロセスの反応は、有機合成分野の技術者によって容易に選択され得る好適な溶媒において行われ得る。好適な溶媒は、反応が行われる温度、すなわち、溶媒の凍結温度から溶媒の沸点の範囲であり得る温度で、出発物質(反応物)、中間体、または産物とは実質的に非反応性であり得る。所与の反応は、1つの溶媒または2つ以上の溶媒の混合物において行われ得る。特定の反応ステップに応じて、特定の反応ステップに好適な溶媒が選択され得る。
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドのラセミ混合物の分解は、当技術分野で既知の多数の方法のうちのいずれかによって行われ得る。方法の例には、光学活性の塩形成有機酸である「キラル分解酸」を用いた分別再結晶が挙げられる。分別再結晶法に好適な分解酸には、例えば、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸、乳酸、または様々な光学活性カンファースルホン酸のDおよびL形態等の光学活性酸がある。ラセミ混合物の分解は、光学活性分解剤(例えば、ジニトロベンゾイルフェニルグリシン)を充填したカラム上での溶出によっても行われ得る。好適な溶出溶媒組成物は、当業者によって決定され得る。 修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド(例えば、ビルディングブロック分子)は、各々が参照によりそれらの全体が組み込まれる、Ogata et al.,J.Org.Chem.74:2585−2588(2009)、Purmal et al.,Nucl.Acids Res.22(1):72−78,(1994)、f*ckuhara et al.,Biochemistry,1(4):563−568(1962)、およびXu et al.,Tetrahedron,48(9):1729−1740(1992)に記載の合成方法に従って調製され得る。
本発明のポリペプチド、一次構築物、およびmmRNAは、分子の全長に沿って均一に修飾されてもされなくてもよい。例えば、1種類以上またはすべての種類のヌクレオチド(例えば、プリンもしくはピリミジン、またはA、G、U、Cのうちのいずか1つ以上もしくはすべて)は、本発明のポリヌクレオチドまたはその所与の既定の配列領域(例えば、図1に表される配列領域のうちの1つ以上)において均一に修飾されてもされなくてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチド(またはその所与の配列領域)におけるすべてのヌクレオチドXが修飾され、ここでXは、ヌクレオチドA、G、U、Cのうちのいずれか1つ、または組み合わせA+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U、もしくはA+G+Cのうちのいずれか1つであり得る。
異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、および/またはヌクレオシド間結合(例えば、骨格構造)は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの様々な位置で存在し得る。当業者であれば、ヌクレオチド類似体または他の修飾(複数可)が、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの機能が実質的に低下するように、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの任意の位置(複数可)に位置し得ることを認識する。修飾は、5’または3’末端修飾でもあり得る。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、約1%〜約100%の修飾ヌクレオチド(全ヌクレオチド含量または1種類以上のヌクレオチド、すなわち、A、G、U、もしくはCのうちのいずれか1つ以上のいずれかと関連したもの)または任意の中間の割合(例えば、1%〜20%、1%〜25%、1%〜50%、1%〜60%、1%〜70%、1%〜80%、1%〜90%、1%〜95%、10%〜20%、10%〜25%、10%〜50%、10%〜60%、10%〜70%、10%〜80%、10%〜90%、10%〜95%、10%〜100%、20%〜25%、20%〜50%、20%〜60%、20%〜70%、20%〜80%、20%〜90%、20%〜95%、20%〜100%、50%〜60%、50%〜70%、50%〜80%、50%〜90%、50%〜95%、50%〜100%、70%〜80%、70%〜90%、70%〜95%、70%〜100%、80%〜90%、80%〜95%、80%〜100%、90%〜95%、90%〜100%、および95%〜100%)を含有し得る。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、修飾ピリミジン(例えば、修飾ウラシル/ウリジン/Uまたは修飾シトシン/シチジン/C)を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA分子中のウラシルまたはウリジン(概して、U)は、約1%〜約100%の修飾ウラシルまたは修飾ウリジン(例えば、1%〜20%、1%〜25%、1%〜50%、1%〜60%、1%〜70%、1%〜80%、1%〜90%、1%〜95%、10%〜20%、10%〜25%、10%〜50%、10%〜60%、10%〜70%、10%〜80%、10%〜90%、10%〜95%、10%〜100%、20%〜25%、20%〜50%、20%〜60%、20%〜70%、20%〜80%、20%〜90%、20%〜95%、20%〜100%、50%〜60%、50%〜70%、50%〜80%、50%〜90%、50%〜95%、50%〜100%、70%〜80%、70%〜90%、70%〜95%、70%〜100%、80%〜90%、80%〜95%、80%〜100%、90%〜95%、90%〜100%、および95%〜100%の修飾ウラシルまたは修飾ウリジン)と置換され得る。修飾ウラシルまたはウリジンは、単一の固有の構造を有する化合物または異なる構造(例えば、本明細書に記載の2、3、4つ以上の固有の構造)を有する複数の化合物に置換され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA分子中のシトシンまたはシチジン(概して、C)は、約1%〜約100%の修飾シトシンまたは修飾シチジン(例えば、1%〜20%、1%〜25%、1%〜50%、1%〜60%、1%〜70%、1%〜80%、1%〜90%、1%〜95%、10%〜20%、10%〜25%、10%〜50%、10%〜60%、10%〜70%、10%〜80%、10%〜90%、10%〜95%、10%〜100%、20%〜25%、20%〜50%、20%〜60%、20%〜70%、20%〜80%、20%〜90%、20%〜95%、20%〜100%、50%〜60%、50%〜70%、50%〜80%、50%〜90%、50%〜95%、50%〜100%、70%〜80%、70%〜90%、70%〜95%、70%〜100%、80%〜90%、80%〜95%、80%〜100%、90%〜95%、90%〜100%、および95%〜100%の修飾シトシンまたは修飾シチジン)と置換され得る。修飾シトシンまたはシチジンは、単一の固有の構造を有する化合物または異なる構造(例えば、本明細書に記載の2、3、4つ以上の固有の構造)を有する複数の化合物に置換され得る。 いくつかの実施形態において、本開示は、式(Ia−1):
を有するn個の結合ヌクレオシドを含むポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA(例えば、第1の領域、第1の隣接領域、または第2の隣接領域)を合成する方法を提供し、この方法は、 a)式(IV−1):
のヌクレオチドを、式(V−1):
のホスホラミダイト化合物と反応させて(式中、Y9が、H、ヒドロキシ、ホスホリル、ピロリン酸塩、硫酸塩、アミノ、チオール、任意に置換されたアミノ酸、またはペプチド(例えば、2〜12個のアミノ酸を含む)であり、各P1、P2、およびP3が、独立して、好適な保護基であり、
が、固体支持体を示す)、 式(VI−1)のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを提供することと、
、および b)式(V)のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを酸化または硫化して、式(VII−1)のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを産出することと、
、および c)保護基を除去して、式(Ia)のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを産出することとを含む。
いくつかの実施形態において、ステップa)およびb)は、1〜約10,000回繰り返される。いくつかの実施形態において、この方法は、A、C、G、およびU(アデノシン、シトシン、グアノシン、およびウラシル)からなる群から選択されるヌクレオチド(例えば、mmRNA分子)をさらに含む。いくつかの実施形態において、核酸塩基は、ピリミジンまたはその誘導体であり得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、翻訳可能であり得る。
ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAの他の成分は任意であり、いくつかの実施形態において有益である。例えば、5’非翻訳領域(UTR)および/または3’UTRが提供され、これらのいずれか、または両方ともに、独立して、1つ以上の異なるヌクレオチド修飾を含有し得る。そのような実施形態において、ヌクレオチド修飾は、翻訳可能な領域においても存在し得る。コザック配列を含有するポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAも提供される。
修飾核酸またはmmRNA、例えば、RNAまたはmRNAに組み込まれる修飾ヌクレオチドの例示の合成は、以下のスキーム1〜スキーム11で提供される。スキーム1は、修飾ヌクレオシドを含むヌクレオシドのリン酸化の一般的な方法を提供する。 スキーム1
様々な保護基を用いて、反応を制御することができる。例えば、スキーム2は、2’および3’ヒドロキシル基ではなく、糖の5’位のリン酸化を促進するための複数の保護ステップおよび脱保護ステップの使用を提供する。 スキーム2
修飾ヌクレオチドは、任意の有用な方法で合成され得る。スキーム3、4、および7は、修飾プリン核酸塩基を有する修飾ヌクレオチドを合成するための例示の方法を提供し、スキーム5および6は、それぞれ、修飾シュードウリジンまたはシュードイソシチジンを有する修飾ヌクレオチドを合成するための例示の方法を提供する。 スキーム3
スキーム4
スキーム5
スキーム6
スキーム7
スキーム8および9は、修飾ヌクレオチドの例示の合成を提供する。スキーム10は、ヌクレオチドを産生するための非限定的な生体触媒方法を提供する。 スキーム8
スキーム9
スキーム10
スキーム11は、修飾ウラシルの例示の合成を提供し、そこでは、N1位は、他の箇所で提供されるように、R12bで修飾され、リボースの5’位は、リン酸化される。T1、T2、R12a、R12b、およびrは、本明細書に提供される通りである。この合成ならびにその最適化されたバージョンを用いて、他のピリミジン核酸塩基およびプリン核酸塩基(例えば、式(b1)〜(b43)を参照のこと)を修飾し、かつ/または1個以上のリン酸基を(例えば、糖の5’位に)導入することができる。このアルキル化反応を用いて、本明細書に記載の任意の核酸塩基における任意の反応基(例えば、アミノ基)(例えば、シトシン、ウラシル、アデニン、およびグアニンのワトソン・クリック塩基対合面のアミノ基)に1個以上の任意に置換されたアルキル基を含むこともできる。 スキーム11
mmRNAにおけるヌクレオチドの組み合わせ 修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドの組み合わせのさらなる例が以下の表9に提供される。修飾ヌクレオチドのこれらの組み合わせを用いて、本発明のポリペプチド、一次構築物、またはmmRNAを形成することができる。別途述べられない限り、修飾ヌクレオチドは、本発明の修飾核酸またはmmRNAの天然ヌクレオチドと完全に置換され得る。非限定的な例として、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドで置換され得る。別の非限定的な例において、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に開示の修飾ヌクレオシドのうちの少なくとも1つで部分的に置換され得る(例えば、約0.1%、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99.9%)。 表9
修飾ヌクレオチドの組み合わせのさらなる例が以下の表10に提供される。修飾ヌクレオチドのこれらの組み合わせを用いて、本発明のポリペプチド、一次構築物、またはmmRNAを形成することができる。 表10
いくつかの実施形態において、シトシンの少なくとも25%は、式(b10)〜(b14)の化合物に置換される(例えば、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または約100%)。
いくつかの実施形態において、ウラシルの少なくとも25%は、式(b1)〜(b9)の化合物に置換される(例えば、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または約100%)。
いくつかの実施形態において、シトシンの少なくとも25%は、式(b10)〜(b14)に化合物に置換され、ウラシルの少なくとも25%は、式(b1)〜(b9)の化合物に置換される(例えば、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または約100%)。
IV.薬学的組成物 製剤化、投与、送達、および投薬 本発明は、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせたポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAの組成物および複合体を提供する。薬学的組成物は、任意に、1つ以上のさらなる活性物質、例えば、治療上および/または予防上活性物質を含んでもよい。医薬品の製剤および/または製造における一般の考慮事項は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Remington:The Science and Practice of Pharmacy 21st ed.,Lippincott Williams&Wilkins,2005において見出され得る。
いくつかの実施形態において、組成物は、ヒト、すなわちヒト患者または対象に投与される。本開示の目的のために、「活性成分」という表現は、一般に、本明細書に記載の送達対象のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAを指す。
本明細書に提供される薬学的組成物の説明は、原則的に、ヒトへの投与に好適である薬学的組成物を対象とするが、そのような組成物は一般に、任意の他の動物への、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に好適であることが当業者によって理解されるであろう。組成物を種々の動物への投与に好適であるようにするための、ヒトへの投与に好適な薬学的組成物の修飾は、よく理解されており、獣医薬理学の専門家は、たとえ用いるとしても単なる通常の実験法を用いて、そのような修飾を設計および/または実施することができる。薬学的組成物の投与が企図される対象には、ヒトおよび/もしくは他の霊長類;ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および/もしくはラット等の商業的に関連性のある哺乳動物を含む哺乳動物;ならびに/または家禽類、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および/もしくはシチメンチョウ等の商業的に適切な鳥類を含む鳥類が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学の技術分野で既知であるか今後開発される、任意の方法によって調製されて得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および/または1つ以上の他の副成分と混合し、次いで、必要かつ/または望ましい場合、生成物を所望の単回または複数回用量単位へと分割、成形、および/またはパッケージ化するステップを含む。
本発明に従う薬学的組成物は、バルクで、1つの単回単位用量として、および/または複数の単回単位用量として、調製され、パッケージ化され、かつ/または販売され得る。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、既定量の活性成分を含む、薬学的組成物の個別的な量である。活性成分の量は一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投薬量、および/または例えば、そのような投薬量の2分の1もしくは3分の1等の、そのような投薬量の好都合な分率に等しい。
本発明に従う薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、および/または任意のさらなる成分の相対的な量は、治療される対象の素性、大きさ、および/または状態に応じて変化し、組成物が投与されるべき経路に応じてさらに変化するあろう。例として、組成物は、0.1%〜100w/w%、例えば、0.5〜50w/w%、1〜30w/w%、5〜80w/w%、少なくとも80w/w%の活性成分を含み得る。
製剤化 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、:(1)安定性を増加させ、(2)細胞トランスフェクションを増加させ、(3)(例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのデポー製剤からの)持続放出もしくは遅延放出を可能にし、(4)生体分布を変化させ(例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの標的を特定の組織または細胞型に定める)、(5)コードされたタンパク質の翻訳をインビボで増加させ、かつ/または(6)コードされたタンパク質の放出プロファイルをインビボで変化させるために、1つ以上の賦形剤を用いて製剤化することができる。ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤等の伝統的な賦形剤に加えて、本発明の賦形剤は、制限なく、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNA(例えば、対象への移植のために)でトランスフェクトされた細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、およびこれらの組み合わせを含むことができる。したがって、本発明の製剤は、1つ以上の賦形剤を含むことができ、各々は一緒にポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAの安定性を増加させる、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAによる細胞トランスフェクションを増加させる、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAによりコードされるタンパク質の発現を増加させる、および/またはポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAによりコードされるタンパク質の放出プロファイルを変化させる量である。さらに、本発明の一次構築物およびmmRNAは、自己集合性核酸ナノ粒子を用いて製剤化されてもよい。
本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学の技術分野で既知であるか今後開発される、任意の方法によって調製され得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および/または1つ以上の他の副成分と混合するステップを含む。
本開示による薬学的組成物は、バルクで、1つの単回単位用量として、および/または複数の単回単位用量として、調製され、パッケージ化され、かつ/または販売されてもよい。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、既定量の活性成分を含む、薬学的組成物の個別的な量を指す。活性成分の量は一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投薬量、および/または例えば、そのような投薬量の2分の1もしくは3分の1を含むが、これらに限定されない、そのような投薬量の好都合な分率に等しい。
本開示による薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、および/または任意のさらなる成分の相対的な量は、治療されている対象の素性、サイズ、および/または状態に応じて変化し、組成物が投与されるべき経路に応じてさらに変化するであろう。例えば、組成物は、0.1w/w%〜99%の活性成分を含み得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の製剤は、少なくとも1つのmmRNAを含有し得る。非限定的な例として、製剤は、1、2、3、4、または5つのmmRNAを含有してもよい。一実施形態において、製剤は、ヒトタンパク質、獣医学的タンパク質(veterinary proteins)、細菌タンパク質、生体タンパク質、抗体、免疫原性タンパク質、治療的ペプチドおよびタンパク質、分泌タンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質および細胞骨格タンパク質、細胞内(intrancellular)膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連したタンパク質および/または非ヒト疾患に関連したタンパク質等であるが、これらに限定されないカテゴリーから選択されるタンパク質をコードする修飾mRNAを含有し得る。一実施形態において、製剤は、少なくとも3つの修飾mRNAがコードするタンパク質を含有する。一実施形態において、製剤は、少なくとも5つの修飾mRNAがコードするタンパク質を含有する
薬学的製剤は、所望される特定の剤形に適している、本明細書で使用されるときにありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤等を含むが、これらに限定されない、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。薬学的組成物を製剤化するための種々の賦形剤および組成物を調製するための技法は、当技術分野で知られている(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006を参照のこと)。任意の従来の賦形剤媒体が任意の望ましくない生体影響を引き起こすか、またはさもなければ薬学的組成物の任意の他の構成成分(複数可)と有害な様態で相互作用するといった、物質またはその誘導体と不適合性である場合を除いて、その使用が本開示の範囲内で企図され得る。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子の粒径は、増加および/または減少し得る。粒径の変化は、炎症等であるが、これらに限定されない生体反応に対抗する一助となることが可能であり得るか、または哺乳動物に送達される修飾mRNAの生体効果を増加させ得る。
薬学的組成物の製造に使用される薬学的に許容される賦形剤には、不活性希釈剤、界面活性剤および/もしくは乳化剤、防腐剤、緩衝剤、滑沢剤、ならびに/または油が含まれるが、これらに限定されない。そのような賦形剤が任意に本発明の薬学的製剤に含まれてもよい。
リピドイド リピドイドの合成が詳細に記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの送達に特に適している(これらすべてが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Mahon et al.,Bioconjug Chem.2010 21:1448−1454、Schroeder et al.,J Intern Med.2010 267:9−21、Akinc et al.,Nat Biotechnol.2008 26:561−569、Love et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2010 107:1864−1869、Siegwart et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2011108:12996−3001を参照のこと)。
これらのリピドイドを用いて、齧歯類および非ヒト霊長類において2本鎖低分子干渉RNAが有効に送達されているが(これらすべて、それらの全体が本明細書に組み込まれる、Akinc et al.,Nat Biotechnol.2008 26:561−569、Frank−Kamenetsky et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2008 105:11915−11920、Akinc et al.,Mol Ther.2009 17:872−879、Love et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2010 107:1864−1869、Leuschner et al.,Nat Biotechnol.2011 29:1005−1010を参照のこと)、本開示は、1本鎖ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを送達することにおけるそれらの製剤化および使用を記載する。これらのリピドイドを含有する複合体、ミセル、リポソーム、または粒子が調製され得、したがって、局所および/または全身投与経路を介したリピドイド製剤の注入後に、コードされたタンパク質の産生によって判定するとき、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの有効な送達をもたらすことができる。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのリピドイド複合体は、静脈内、筋肉内、または皮下経路を含むが、これらに限定されない、種々の手段によって投与することができる。
核酸のインビボ送達は、製剤組成、粒子PEG化の性質、負荷の程度、オリゴヌクレオチド対脂質比を含むが、これらに限定されない多くのパラメータ、および粒径等であるが、これらに限定されない生物物理学的パラメータによって影響を受け得る(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Akinc et al.,Mol Ther.2009 17:872−879)。例として、ポリ(エチレングリコール)(PEG)脂質のアンカー鎖長のわずかな変化が、インビボ有効性に対する大きな効果をもたらし得る。ペンタ[3−(1−ラウリルアミノプロピオニル)]−トリエチレンテトラミン塩酸塩(TETA−5LAP(98N12−5としても知られる)、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Murugaiah et al.,Analytical Biochemistry,401:61(2010)を参照のこと)、C12−200(誘導体および変異形を含む)、およびMD1を含むが、これらに限定されない、異なるリピドイドを有する製剤がインビボ活性について試験され得る。
本明細書において「98N12−5」と称されるリピドイドは、参照によりその全体が組み込まれる、Akinc et al.,Mol Ther.2009 17:872−879(図2を参照のこと)によって開示されている(図2を参照のこと)。
本明細書において「C12−200」と称されるリピドイドは、両方ともに参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Love et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2010 107:1864−1869(図2を参照のこと)およびLiu and Huang,Molecular Therapy.2010 669−670(図2を参照のこと)によって開示されている。リピドイド製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに加えて、3つもしくは4つのいずれかまたはそれよりも多い構成成分を含む粒子を含むことができる。例として、ある特定のリピドイドを有する製剤は、98N12−5を含むが、これらに限定されず、42%リピドイド、48%コレステロール、および10%PEG(C14アルキル鎖長)を含有してもよい。別の例として、ある特定のリピドイドを有する製剤は、C12−200を含むが、これらに限定されず、50%リピドイド、10%ジステアロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン、38.5%コレステロール、および1.5%PEG−DMGを含有してもよい。
一実施形態において、全身静脈内投与のためにリピドイドとともに製剤化されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、肝臓を標的とすることができる。例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを使用し、42%の98N12−5、48%のコレステロール、および10%のPEG−脂質の脂質モル組成を含み、約7.5〜1の総脂質対ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの最終重量比、およびPEG脂質上のC14アルキル鎖長を有し、概ね50〜60nmの平均粒径を有する、最終的な最適化された静脈内製剤は、肝臓への90%超の製剤の分布をもたらし得る(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Akinc et al.,Mol Ther.2009 17:872−879を参照のこと)。別の例において、C12−200(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国仮出願第61/175,770号および公開された国際出願第WO2010129709号を参照のこと)リピドイドを使用し、50/10/38.5/1.5のC12−200/ジステアロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン/コレステロール/PEG−DMGのモル比を有し得、7対1の総脂質対ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの重量比、および80nmの平均粒径を有する静脈内製剤が、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを肝細胞に送達するのに有効であり得る(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Love et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2010 107:1864−1869を参照のこと)。別の実施形態において、MD1リピドイド含有製剤を用いて、インビボでポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを肝細胞に有効に送達し得る。筋肉内または皮下経路のために最適化されたリピドイド製剤の特性は、標的細胞型、および製剤が細胞外マトリックスを介して血流中に拡散する能力に応じて大きく異なり得る。内皮窓(fenestrae)のサイズに起因して、150nm未満の粒径が有効な肝細胞送達のために所望され得るが(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Akinc et al.,Mol Ther.2009 17:872−879を参照のこと)、製剤を、内皮細胞、骨髄細胞、および筋肉細胞を含むが、これらに限定されない他の細胞型に送達するためのリピドイド製剤化ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの使用は、同様にサイズ制限されない場合がある。siRNAをインビボで骨髄細胞および内皮等の他の非肝細胞細胞に送達するためのリピドイド製剤の使用が報告されている(各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、Akinc et al.,Nat Biotechnol.2008 26:561−569、Leuschner et al.,Nat Biotechnol.2011 29:1005−1010、Cho et al.Adv.Funct.Mater.2009 19:3112−3118、8th International Judah Folkman Conference,Cambridge,MA October 8−9,2010を参照のこと)。単球等の骨髄細胞への有効な送達、リピドイド製剤は、同様の構成成分モル比を有し得る。リピドイドと、ジステアロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン、コレステロール、およびPEG−DMGを含むが、これらに限定されない他の構成成分との異なる比率を用いて、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの製剤を、肝細胞、骨髄細胞、筋肉細胞等を含むが、これらに限定されない異なる細胞型への送達のために最適化し得る。例えば、構成成分モル比は、50%のC12−200、10%のジステアロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン、38.5%のコレステロール、および1.5%のPEG−DMGを含み得るが、これらに限定されない(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Leuschner et al.,Nat Biotechnol 2011 29:1005−1010を参照のこと)。皮下送達または筋肉内送達のいずれかを介した、核酸の細胞(脂肪細胞および筋肉細胞等であるが、これらに限定されない)への局所送達のためのリピドイド製剤の使用は、全身送達に所望される製剤構成成分のすべてを必要とするわけではない場合があり、したがって、リピドイドおよびポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのみを含んでもよい。
リピドイドは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによる細胞トランスフェクションを増加させ、かつ/またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させることが可能であり得るため、異なるリピドイドの組み合わせを用いて、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの指示によるタンパク質産生の有効性を改善し得る(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Whitehead et al.,Mol.Ther.2011,19:1688−1694を参照のこと)。
リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、1つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を用いて製剤化することができる。一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの薬学的組成物は、リポソームを含む。リポソームは、主に脂質二重層から構成され得、栄養素および薬学的製剤の投与のための送達ビヒクルとして使用され得る、人工的に調製された小胞である。リポソームは、直径数百ナノメートルであり得、かつ狭い水性の区画によって分離される一連の同心状二重層を含有し得る多層小胞(MLV)、直径50nmよりも小さい場合がある小さい単細胞小胞(SUV)、および直径50〜500nmであり得る大きい単層小胞(LUV)等であるが、これらに限定されない、異なるサイズのものであり得る。リポソーム設計は、不健康な組織へのリポソームの結合を改善するため、またはエンドサイトーシス等であるが、これらに限定されない事象を活性化するための、オプソニンまたはリガンドを含むが、これらに限定されない。リポソームは、薬学的製剤の送達を改善するために低pHまたは高pHを含有してもよい。
リポソームの形成は、封入される薬学的製剤およびリポソーム成分、脂質小胞が分散される媒体の性質、封入される物質の有効濃度およびその潜在的な毒性、小胞の適用および/または送達中に伴われる任意のさらなるプロセス、意図される適用のための小胞の最適化サイズ、多分散性、および貯蔵寿命、ならびに安全かつ効率的なリポソーム生成物のバッチ間の再現性および大規模産生の可能性等であるが、これらに限定されない、物理化学特性に依存し得る。
一実施形態において、本明細書に記載の薬学的組成物は、制限なく、1,2−ジオレイルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DODMA)リポソーム、Marina Biotech(Bothell,WA)によるDiLa2リポソーム、1,2−ジリノレイルオキシ(dilinoleyloxy)−3−ジメチルアミノプロパン(DLin−DMA)、2,2−ジリノレイル−4−(2−ジメチルアミノエチル)−[1,3]−ジオキソラン(DLin−KC2−DMA)、およびMC3(参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第20100324120号)から形成されるもの等のリポソーム、ならびにJanssen Biotech,Inc.(Horsham、PA)によるDOXIL(登録商標)等であるが、これらに限定されない小分子薬物を送達し得るリポソームを含んでもよい。
一実施形態において、本明細書に記載の薬学的組成物は、制限なく、以前に記載されており、インビトロおよびインビボでのオリゴヌクレオチド送達に好適であることが示された、安定化プラスミド−脂質粒子(SPLP)または安定化核酸脂質粒子(SNALP)の合成から形成されるもの等のリポソームを含んでもよい(これらすべてが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Wheeler et al.Gene Therapy.1999 6:271−281、Zhang et al.Gene Therapy.1999 6:1438−1447、Jeffs et al.Pharm Res.2005 22:362−372、Morrissey et al.,Nat Biotechnol.2005 2:1002−1007、Zimmermann et al.,Nature.2006 441:111−114、Heyes et al.J Contr Rel.2005 107:276−287、Semple et al.Nature Biotech.2010 28:172−176、Judge et al.J Clin Invest.2009 119:661−673、deFougerollesHum Gene Ther.2008 19:125−132を参照のこと)。Wheelerらによる元の製造方法は、洗浄剤透析法(detergent dialysis method)であり、それは後にJeffsらによって改善され、自発的小胞形成法(spontaneous vesicle formation method)と称される。リポソーム製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに加えて、3〜4つの脂質構成成分から構成される。例としてリポソームは、Jeffsらによって記載されるように、55%のコレステロール、20%のジステアロイルホスファチジル(disteroylphosphatidyl)コリン(DSPC)、10%のPEG−S−DSG、および15%の1,2−ジオレイルオキシ−N,N−ジメチルアミノプロパン(DODMA)を含有することができるが、これらに限定されない。別の例として、ある特定のリポソーム製剤は、Heyesらによって記載されるように、48%のコレステロール、20%のDSPC、2%のPEG−c−DMA、および30%のカチオン性脂質を含有してもよいが、これらに限定されず、このカチオン性脂質は、1,2−ジステアリルオキシ(distearloxy)−N,N−ジメチルアミノプロパン(DSDMA)、DODMA、DLin−DMA、または1,2−ジリノレニルオキシ−3−ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)であり得る。
一実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも1つの免疫原をコードし得るmmRNAを送達するために形成され得る、リポソームを含んでもよい。mmRNAは、リポソームによってカプセル封入されてもよく、かつ/またはそれは、水性コアに含有されてもよく、それが次いでリポソームによってカプセル封入されてもよい(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012031046号、同第WO2012031043号、同第WO2012030901号、および同第WO2012006378号を参照のこと)。別の実施形態において、免疫原をコードし得るmmRNAは、カチオン性水中油型エマルション中で製剤化されてもよく、そのエマルション粒子は、mmRNAと相互作用して分子をエマルション粒子に固着させることができる油中子およびカチオン性脂質を含む(参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012006380号を参照のこと)。さらに別の実施形態において、脂質製剤は、トランスフェクションを向上させ得る脂質である少なくともカチオン性脂質、および脂質部分に連結された親水性頭頂基を含有する少なくとも1つの脂質を含んでもよい(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2011076807号および米国公開第20110200582号を参照のこと)。別の実施形態において、免疫原をコードするポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、官能化脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質小胞中に製剤化されてもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20120177724号を参照のこと)。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、官能化脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質小胞中に製剤化されてもよい。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、カチオン性脂質を含むリポソーム中に製剤化されてもよい。リポソームは、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2013006825号に記載されるように、1:1〜20:1のカチオン性脂質中の窒素原子:RNA中のリン酸塩(N:P比)のモル比を有し得る。別の実施形態において、リポソームは、20:1超または1:1未満のN:P比を有し得る。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化されてもよい。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、当技術分野で既知の方法によって、および/または参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第20120178702号に記載されるように遂行されてもよい。非限定的な例として、ポリカチオンには、ポリリジン、ポリオルニチン、および/またはポリアルギニン等であるが、これらに限定されないカチオン性ペプチドまたはポリペプチド、ならびに参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2012013326号に記載のカチオン性ペプチドが含まれてもよい。別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)等であるが、これらに限定されない中性脂質をさらに含み得る、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化されてもよい。
リポソーム製剤は、カチオン性脂質構成成分の選択、カチオン性脂質飽和の程度、PEG化の性質、すべての構成成分の比率、およびサイズ等の生物物理学的パラメータによって影響を受け得るが、これらに限定されない。Sempleら(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Semple et al.Nature Biotech.2010 28:172−176)による一例において、リポソーム製剤は、57.1%のカチオン性脂質、7.1%のジパルミトイルホスファチジルコリン、34.3%のコレステロール、および1.4%のPEG−c−DMAから構成された。別の例として、カチオン性脂質の組成を変化させることにより、siRNAを種々の抗原提示細胞により有効に送達することができた(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Basha et al.Mol Ther.2011 19:2186−2200)。
いくつかの実施形態において、脂質ナノ粒子(LNP)製剤中のPEGの比率は、増加もしくは減少し得、かつ/またはPEG脂質の炭素鎖長がC14からC18に修飾されて、LNP製剤の薬物動態および/もしくは生体分布を変化させ得る。非限定的な例として、LNP製剤は、カチオン性脂質、DSPC、およびコレステロールと比較して、1〜5%の脂質モル比のPEG−c−DOMGを含有してもよい。別の実施形態において、PEG−c−DOMGは、PEG−DSG(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール)またはPEG−DPG(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール)等であるが、これらに限定されないPEG脂質と置き換えられてもよい。カチオン性脂質は、DLin−MC3−DMA、DLin−DMA、C12−200、およびDLin−KC2−DMA等であるが、これらに限定されない、当技術分野で既知の任意の脂質から選択されてもよい。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2012170930号に記載の脂質ナノ粒子等に製剤化されてもよい。
一実施形態において、カチオン性脂質は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012040184号、同第WO2011153120号、同第WO2011149733号、同第WO2011090965号、同第WO2011043913号、同第WO2011022460号、同第WO2012061259号、同第WO2012054365号、同第WO2012044638号、同第WO2010080724号、同第WO201021865号、および同第WO2008103276号、米国特許第7,893,302号、同第7,404,969号、および同第8,283,333号、ならびに米国特許公開第US20100036115号、および同第US20120202871号に記載のカチオン性脂質から選択されてもよいが、これらに限定されない。別の実施形態において、カチオン性脂質は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012040184号、同第WO2011153120号、同第WO2011149733号、同第WO2011090965号、同第WO2011043913号、同第WO2011022460号、同第WO2012061259号、同第WO2012054365号、および同第WO2012044638号に記載の式Aから選択されてもよいが、これらに限定されない。さらに別の実施形態において、カチオン性脂質は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2008103276号の式CLI−CLXXIX、米国特許第7,893,302号の式CLI−CLXXIX、米国特許第7,404,969号の式CLI−CLXXXXII、および米国特許公開第US20100036115号の式I−VIから選択されてもよいが、これらに限定されない。非限定的な例として、カチオン性脂質は、(20Z,23Z)−N,N−ジメチルノナコサ−20,23−ジエン−10−アミン、(17Z,20Z)−N,N−ジメチルヘキサコサ(dimemylhexacosa)−17,20−ジエン−9−アミン、(1Z,19Z)−N5N−ジメチルペンタコサ−16,19−ジエン−8−アミン、(13Z,16Z)−N,N−ジメチルドコサ−13,16−ジエン−5−アミン、(12Z,15Z)−N,N−ジメチルヘニコサ−12,15−ジエン−4−アミン、(14Z,17Z)−N,N−ジメチルトリコサ−14,17−ジエン−6−アミン、(15Z,18Z)−N,N−ジメチルテトラコサ−15,18−ジエン−7−アミン、(18Z,21Z)−N,N−ジメチルヘプタコサ−18,21−ジエン−10−アミン、(15Ζ,18Ζ)−Ν,Ν−ジメチルテトラコサ−15,18−ジエン−5−アミン、(14Z,17Z)−N,N−ジメチルトリコサ−14,17−ジエン−4−アミン、(19Z,22Z)−N,N−ジメチルオクタコサ(dimeihyloctacosa)−19,22−ジエン−9−アミン、(18Z,21 Z)−N,N−ジメチルヘプタコサ−18,21−ジエン−8−アミン、(17Z,20Z)−N,N−ジメチルヘキサコサ−17,20−ジエン−7−アミン、(16Z,19Z)−N,N−ジメチルペンタコサ−16,19−ジエン−6−アミン、(22Z,25Z)−N,N−ジメチルヘントリアコンタ−22,25−ジエン−10−アミン、(21Z,24Z)−N,N−ジメチルトリアコンタ−21,24−ジエン−9−アミン、(18Z)−N,N−ジメチルヘプタコサ(dimetylheptacos)−18−エン−10−アミン、(17Z)−N,N−ジメチルヘキサコサ−17−エン−9−アミン、(19Z,22Z)−N,N−ジメチルオクタコサ−19,22−ジエン−7−アミン、N,N−ジメチルヘプタコサン−10−アミン、(20Z,23Z)−N−エチル−N−メチルノナコサ−20,23−ジエン−10−アミン、1−[(11Z,14Z)−1−ノニルイコサ−11,14−ジエン−1−イル]ピロリジン、(20Z)−N,N−ジメチルヘプタコサ−20−エン−10−アミン、(15Z)−N,N−ジメチルエプタコサ(eptacos)−15−エン−10−アミン、(14Z)−N,N−ジメチルノナコサ−14−エン−10−アミン、(17Z)−N,N−ジメチルノナコサ−17−エン−10−アミン、(24Z)−N,N−ジメチルトリトリアコンタ−24−エン−10−アミン、(20Z)−N,N−ジメチルノナコサ−20−エン−10−アミン、(22Z)−N,N−ジメチルヘントリアコンタ−22−エン−10−アミン、(16Z)−N,N−ジメチルペンタコサ−16−エン−8−アミン、(12Z,15Z)−N,N−ジメチル−2−ノニルヘニコサ−12,15−ジエン−1−アミン、(13Z,16Z)−N,N−ジメチル−3−ノニルドコサ−13,16−ジエン−1−アミン、N,N−ジメチル−1−[(lS,2R)−2−オクチルシクロプロピル]エプタデカン(eptadecan)−8−アミン、1−[(1S,2R)−2−ヘキシルシクロプロピル]−N,N−ジメチルノナデカン−10−アミン、Ν,Ν−ジメチル−1−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ノナデカン−10−アミン、N,N−ジメチル−21−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ヘニコサン−10−アミン,Ν,Ν−ジメチル−1−[(1S,2S)−2−{[(1R,2R)−2−ペンチルシクロプロピル]メチル}シクロプロピル]ノナデカン−10−アミン,Ν,Ν−ジメチル−1−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ヘキサデカン−8−アミン、Ν,Ν−ジメチル−[(1R,2S)−2−ウンデシルシクロプロピル]テトラデカン−5−アミン、N,N−ジメチル−3−{7−[(1S,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ヘプチル}ドデカン−1−アミン、1−[(1R,2S)−2−ヘプチルシクロプロピル]−Ν,Ν−ジメチルオクタデカン−9−アミン、1−[(1S,2R)−2−デシルシクロプロピル]−N,N−ジメチルペンタデカン−6−アミン、N,N−ジメチル−1−[(lS,2R)−2−オクチルシクロプロピル]ペンタデカン−8−アミン、R−N,N−ジメチル−1−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、S−N,N−ジメチル−1−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、1−{2−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−1−[(オクチルオキシ)メチル]エチル}ピロリジン、(2S)−N,N−ジメチル−1−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−3−[(5Z)−オクタ−5−エン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、1−{2−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]−1−[(オクチルオキシ)メチル]エチル}アゼチジン、(2S)−1−(ヘキシルオキシ)−N,N−ジメチル−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、(2S)−1−(ヘプチルオキシ)−N,N−ジメチル−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、Ν,Ν−ジメチル−1−(ノニルオキシ)−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、Ν,Ν−ジメチル−1−[(9Z)−オクタデカ−9−エン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン;(2S)−N,N−ジメチル−1−[(6Z,9Z,12Z)−オクタデカ−6,9,12−トリエン−1−イルオキシ]−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2S)−1−[(11Z,14Z)−イコサ−11,14−ジエン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(ペンチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2S)−1−(ヘキシルオキシ)−3−[(11Z,14Z)−イコサ−11,14−ジエン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチルプロパン−2−アミン、1−[(11Z,14Z)−イコサ−11,14−ジエン−1−イルオキシ]−Ν,Ν−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、1−[(13Z,16Z)−ドコサ−l3,16−ジエン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2S)−1−[(13Z,16Z)−ドコサ−13,16−ジエン−1−イルオキシ]−3−(ヘキシルオキシ)−N,N−ジメチルプロパン−2−アミン、(2S)−1−[(13Z)−ドコサ−13−エン−1−イルオキシ]−3−(ヘキシルオキシ)−N,N−ジメチルプロパン−2−アミン、1−[(13Z)−ドコサ−13−エン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、1−[(9Z)−ヘキサデカ−9−エン−1−イルオキシ]−N,N−ジメチル−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、(2R)−N,N−ジメチル−H(1−メトイルオクチル)オキシ]−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、(2R)−1−[(3,7−ジメチルオクチル)オキシ]−N,N−ジメチル−3−[(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イルオキシ]プロパン−2−アミン、N,N−ジメチル−1−(オクチルオキシ)−3−({8−[(1S,2S)−2−{[(1R,2R)−2−ペンチルシクロプロピル]メチル}シクロプロピル]オクチル}オキシ)プロパン−2−アミン、N,N−ジメチル−1−{[8−(2−オクチルシクロプロピル)オクチル]オキシ}−3−(オクチルオキシ)プロパン−2−アミン、および(11E,20Z,23Z)−N,N−ジメチルノナコサ−11,20,2−トリエン−10−アミン、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは立体異性体から選択されてもよい。
一実施形態において、脂質は、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2012170889号に記載の脂質等の切断可能な脂質であってもよい。
一実施形態において、カチオン性脂質は、当技術分野で既知の方法によって、かつ/または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012040184号、同第WO2011153120号、同第WO2011149733号、同第WO2011090965号、同第WO2011043913号、同第WO2011022460号、同第WO2012061259号、同第WO2012054365号、同第WO2012044638号、同第WO2010080724号、および同第WO201021865号に記載されるように合成されてもよい。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAのLNP製剤は、3%脂質モル比でPEG−c−DOMGを含有してもよい。別の実施形態において、LNP製剤ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、1.5%脂質モル比でPEG−c−DOMGを含有してもよい。
一実施形態において、薬学的の組成物ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2012099755号に記載のPEG化脂質のうちの少なくとも1つを含んでもよい。
一実施形態において、LNP製剤は、PEG−DMG 2000(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−2000)を含有してもよい。一実施形態において、LNP製剤は、当技術分野で既知のカチオン性脂質であるPEG−DMG 2000および少なくとも1つの他の構成成分を含有してもよい。別の実施形態において、LNP製剤は、当技術分野で既知のカチオン性脂質であるPEG−DMG 2000、DSPC、およびコレステロールを含有してもよい。非限定的な例として、LNP製剤は、PEG−DMG 2000、DLin−DMA、DSPC、およびコレステロールを含有してもよい。別の非限定的な例として、LNP製剤は、2:40:10:48のモル比で、PEG−DMG 2000、DLin−DMA、DSPC、およびコレステロールを含有してもよい(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Geall et al.,Nonviral delivery of self−amplifying RNA vaccines,PNAS 2012;PMID:22908294を参照のこと)。別の非限定的な例として、本明細書に記載の修飾RNAは、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第20120207845号に記載されるように、非経口経路によって送達されるナノ粒子中に製剤化されてもよい。 一実施形態において、LNP製剤は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2011127255号または同第WO2008103276号に記載の方法によって製剤化されてもよい。非限定的な例として、本明細書に記載の修飾RNAは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2011127255号および/または同第WO2008103276号に記載されるように、LNP製剤中にカプセル封入されてもよい。 一実施形態において、本明細書に記載のLNP製剤は、ポリカチオン性組成物を含んでもよい。非限定的な例として、ポリカチオン性組成物は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第US20050222064号の式1〜60から選択されてもよい。別の実施形態において、ポリカチオン性組成物を含むLNP製剤は、本明細書に記載の修飾RNAのインビボおよび/またはインビトロでの送達に使用されてもよい。
一実施形態において、本明細書に記載のLNP製剤は、透過性促進剤分子をさらに含んでもよい。非限定的な透過性促進剤分子は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第US20050222064号に記載されている。
一実施形態において、薬学的組成物は、DiLa2リポソーム(Marina Biotech,Bothell,WA)、SMARTICLES(登録商標)(Marina Biotech,Bothell,WA)、中性DOPC(1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)系リポソーム(例えば、卵巣癌に対するsiRNA送達(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Landen et al.Cancer Biology&Therapy 2006 5(12)1708−1713))、およびヒアルロナンコーティングリポソーム(Quiet Therapeutics,Israel)等であるが、これらに限定されないリポソーム中に製剤化されてもよい。
ナノ粒子製剤は、炭水化物担体および修飾核酸分子(例えば、mmRNA)を含む、炭水化物ナノ粒子であってもよい。非限定的な例として、炭水化物担体は、無水物で修飾された植物グリコーゲンまたはグリコーゲン型材料、植物グリコーゲン(phtoglycogen)オクテニルコハク酸塩、植物グリコーゲンβ−デキストリン、無水物で修飾された植物グリコーゲンβ−デキストリンを含んでもよいが、これらに限定されない。(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012109121号を参照のこと)。
脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質を、急速排出(rapidly eliminated)脂質ナノ粒子(reLNP)として知られている生分解性カチオン性脂質と置き換えることによって改善されてもよい。DLinDMA、DLin−KC2−DMA、およびDLin−MC3−DMA等であるが、これらに限定されない、イオン化できるカチオン性脂質は、時間とともに血漿および組織中に蓄積することが示されてきており、潜在的な毒性の源であり得る。急速排出脂質の急速な代謝は、ラットにおいて1mg/kg用量〜10mg/kg用量の1桁分、脂質ナノ粒子の耐性および治療指数を改善することができる。酵素的に分解されるエステル結合の組み込みは、reLNP製剤の活性を依然として維持しながら、カチオン性構成成分の分解および代謝プロファイルを改善することができる。エステル結合は、脂質鎖の内部に位置することができるか、またはそれは、脂質鎖の末端において末端に位置してもよい。内部エステル結合は、脂質鎖内の任意の炭素を置き換えてもよい。
一実施形態において、内部エステル結合は、飽和炭素のいずれの側に位置してもよい。reLNPの非限定的な例としては、
が挙げられる。
一実施形態において、免疫応答が、ナノ化学種、ポリマー、および免疫原を含み得る脂質ナノ粒子を送達することによって、誘発され得る。(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20120189700号および国際公開第WO2012099805号)。ポリマーは、ナノ化学種をカプセル封入しても、ナノ化学種を部分的にカプセル封入してもよい。免疫原は、本明細書に記載の組換えタンパク質、修飾RNA、および/または一次構築物であってもよい。一実施形態において、脂質ナノ粒子は、病原体に対するもの等であるが、これらに限定されないワクチンにおいて使用するために製剤化されてもよい。
脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子が粘膜関門を透過するように、粒子の表面特性を変化させるように操作されてもよい。粘液は、口腔(例えば、周口膜および食道膜ならびに扁桃組織)、眼、胃腸(例えば、胃、小腸、大腸、結腸、直腸)、鼻、呼吸器(例えば、経鼻、咽頭、気管、および気管支膜)、生殖器(例えば、膣内、子宮頚部、および尿道膜)上に位置する粘膜組織等であるが、これらに限定されない。より高い薬物カプセル封入効率および幅広い薬物の持続送達を提供する能力のために好ましい10〜200nmよりも大きいナノ粒子、は、粘膜関門を通って急速に拡散するには大きすぎると考えられている。粘液は、継続的に分泌され、脱落し、破棄されるかまたは消化され、再生されるため、捕捉された粒子のほとんどは、数秒または数時間以内に粘膜(mucosla)組織から除去され得る。低分子量ポリエチレングリコール(PEG)で密にコーティングされた大きいポリマーナノ粒子(直径200nm〜500nm)は、水中で拡散している同じ粒子よりもわずか4〜6倍低く、粘液を通って拡散した(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Lai et al.PNAS 2007 104(5):1482−487、Lai et al.Adv Drug Deliv Rev.2009 61(2):158−171)。ナノ粒子の輸送は、蛍光退色後回復測定(FRAP)および高解像度多数粒子追跡(MPT)を含むが、これらに限定されない、透過速度および/または蛍光顕微鏡技法を用いて決定され得る。非限定的な例として、粘膜関門を透過し得る組成物は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第8,241,670号に記載されるように作製されてもよい。
粘液を透過するように操作された脂質ナノ粒子は、ポリマー材料(すなわちポリマーコア)および/またはポリマー−ビタミン複合体および/またはトリブロックコポリマーを含んでもよい。ポリマー材料には、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリ(スチレン)、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、およびポリアリレートが含まれてもよいが、これらに限定されない。ポリマー材料は、生分解性および/または生体適合性であってもよい。ポリマー材料は、さらに照射されてもよい。非限定的な例として、ポリマー材料は、γ照射されてもよい(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際出願第WO201282165号を参照のこと)。具体的なポリマーの非限定的な例としては、ポリ(カプロラクトン)(PCL)、エチレン酢酸ビニルポリマー(EVA)、ポリ(乳酸)(PLA)、ポリ(L−乳酸)(PLLA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、ポリ(乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)、ポリ(L−乳酸−co−グリコール酸)(PLLGA)、ポリ(D,L−ラクチド)(PDLA)、ポリ(L−ラクチド)(PLLA)、ポリ(D,L−ラクチド−co−カプロラクトン)、ポリ(D,L−ラクチド−co−カプロラクトン−co−グリコリド)、ポリ(D,L−ラクチド−co−PEO−co−D,L−ラクチド)、ポリ(D,L−ラクチド−co−PPO−co−D,L−ラクチド)、ポリアルキルシアノアクリレート(acralate)、ポリウレタン、ポリ−L−リジン(PLL)、ヒドロキシプロピルメタクリレート(HPMA)、ポリエチレングリコール、ポリ−L−グルタミン酸、ポリ(ヒドロキシ酸)、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ(エステルアミド)、ポリアミド、ポリ(エステルエーテル)、ポリカーボネート、ポリエチレンおよびポリプロピレン等のポリアルキレン、ポリ(エチレングリコール)(PEG)、ポリアルキレンオキシド(PEO)等のポリアルキレングリコール、ポリ(エチレンテレフタレート)等のポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルエーテル、ポリ(酢酸ビニル)等のポリビニルエステル、ポリ(塩化ビニル)(PVC)等のハロゲン化ポリビニル、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン(PS)、ポリウレタン、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等の誘導体化セルロース、ポリ(メチル(メタ)アクリレート)(PMMA)、ポリ(エチル(メタ)アクリレート)、ポリ(ブチル(メタ)アクリレート)、ポリ(イソブチル(メタ)アクリレート)、ポリ(ヘキシル(メタ)アクリレート)、ポリ(イソデシル(メタ)アクリレート)、ポリ(ラウリル(メタ)アクリレート)、ポリ(フェニル(メタ)アクリレート)、ポリ(メチルアクリレート)、ポリ(イソプロピルアクリレート)、ポリ(イソブチルアクリレート)、ポリ(オクタデシルアクリレート)等のアクリル酸のポリマー、ならびにそのコポリマーおよび混合物、ポリジオキサノンおよびそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマル酸塩、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ(オルト)エステル、ポリ(酪酸)、ポリ(吉草酸)、ポリ(ラクチド−co−カプロラクトン)、およびトリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドンが挙げられる。脂質ナノ粒子は、ブロックコポリマー(参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2013012476号に記載の分岐状ポリエーテル−ポリアミドブロックコポリマー等)、および(ポリ(エチレングリコール)−(ポリ(プロピレンオキシド)−(ポリ(エチレングリコール)トリブロックコポリマー(例えば、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20120121718号および米国公開20100003337号ならびに米国特許第8,263,665号を参照のこと)等であるが、これらに限定されない、コポリマーでコーティングされるか、またはそれと会合されてもよい。コポリマーは、一般に安全と認められる(GRAS)ポリマーであってもよく、脂質ナノ粒子の形成は、新たな化学実体が何ら作り出されないような方式であってもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、新たな化学実体を形成することなく、依然としてヒト粘液に急速に透過可能である、ポロキサマーコーティングPLGAナノ粒子を含んでもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Yang et al.Angew.Chem.Int.Ed.2011 50:2597−2600)。
ポリマー−ビタミン複合体のビタミンは、ビタミンEであってもよい。この複合体のビタミン部分は、ビタミンA、ビタミンE、他のビタミン、コレステロール、他の界面活性剤の疎水性部分または疎水性構成成分(例えば、ステロール鎖、脂肪酸、炭化水素鎖、およびアルキレンオキシド鎖)等であるが、これらに限定されない他の好適な構成成分で置換されてもよい。
粘液に透過するように操作された脂質ナノ粒子には、mmRNA、アニオン性タンパク質(例えば、ウシ血清アルブミン)、界面活性剤(例えば、ジメチルジオクタデシル−アンモニウムブドミド等の、例えば、カチオン性界面活性剤)、糖または糖誘導体(例えば、シクロデキストリン)、核酸、ポリマー(例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、およびポロキサマー)、粘液溶解剤(例えば、N−アセチルシステイン、餅草、ブロメライ、パパイン、クレロデンドロン、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、サイモシンβ4ドルナーゼα、ネルテネキシン、エルドステイン)、およびrhDNaseを含む種々のDNase等であるが、これらに限定されない表面変質剤が含まれてもよい。表面変質薬剤は、粒子の表面に包埋されるもしくは絡ませられるか、または脂質ナノ粒子の表面上に(例えば、コーティング、吸着、共有結合、または他のプロセスによって)配置されてもよい。(例えば、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開20100215580号および米国公開20080166414号を参照のこと)。
粘液透過性脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の少なくとも1つのmmRNAを含んでもよい。mmRNAは、脂質ナノ粒子中にカプセル封入され、かつ/または粒子の表面上に配置されてもよい。mmRNAは、脂質ナノ粒子に共有結合されてもよい。粘液透過性脂質ナノ粒子の製剤は、複数のナノ粒子を含んでもよい。さらに、製剤は、粘液と相互作用し、周囲の粘液の構造特性および/または付着特性を、粘膜付着を減少させるように変質させ得、それにより粘液透過性脂質ナノ粒子の粘膜組織への送達を増加させ得る、粒子を含有してもよい。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、制限なく、Silence Therapeutics(London,United Kingdom)によるATUPLEX(商標)系、DACC系、DBTC系、および他のsiRNA−リポプレックス技術、STEMGENT(登録商標)(Cambridge,MA)によるSTEMFECT(商標)、ならびにポリエチレンイミン(PEI)またはプロタミンベースの標的を定めたおよび標的を定めない核酸送達等の、リポプレックスとして製剤化される(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Aleku et al.Cancer Res.2008 68:9788−9798、Strumberg et al.Int J Clin Pharmacol Ther 2012 50:76−78、Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1222−1234、Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1360−1370、Gutbier et al.,Pulm Pharmacol.Ther.2010 23:334−344、Kaufmann et al.Microvasc Res 2010 80:286−293Weide et al.J Immunother.2009 32:498−507、Weide et al.J Immunother.2008 31:180−188、Pascolo Expert Opin.Biol.Ther.4:1285−1294、Fotin−Mleczek et al.,2011 J.Immunother.34:1−15、Song et al.,Nature Biotechnol.2005,23:709−717、Peer et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2007 6;104:4095−4100、deFougerollesHum Gene Ther.2008 19:125−132)。
一実施形態において、そのような製剤は、それらが受動的または能動的に、肝細胞、免疫細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、抗原提示細胞、および白血球を含むが、これらに限定されない異なる細胞型をインビボで指向するようにも構築され得るか、または組成を変化し得る(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Akinc et al.Mol Ther.2010 18:1357−1364、Song et al.,Nat Biotechnol.2005 23:709−717、Judge et al.,J Clin Invest.2009 119:661−673、Kaufmann et al.,Microvasc Res 2010 80:286−293、Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1222−1234、Santel et al.,Gene Ther 2006 13:1360−1370、Gutbier et al.,Pulm Pharmacol.Ther.2010 23:334−344、Basha et al.,Mol.Ther.2011 19:2186−2200、Fenske and Cullis,Expert Opin Drug Deliv.2008 5:25−44、Peer et al.,Science.2008 319:627−630、Peer and Lieberman,Gene Ther.2011 18:1127−1133)。肝臓細胞に対する製剤の受動的な標的化の一例としては、DLin−DMA、DLin−KC2−DMA、およびDLin−MC3−DMAベースの脂質ナノ粒子製剤が挙げられ、それらはアポリポタンパク質Eに結合し、インビボでこれらの製剤の結合および肝細胞中への取り込みを促進することが示されている(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Akinc et al.Mol Ther.2010 18:1357−1364)。製剤は、葉酸塩、トランスフェリン、N−アセチルガラクトサミン(GalNAc)、および抗体で標的を定めるアプローチにより例として示されるが、これらによって限定されない、それらの表面上の異なるリガンドの発現を介して選択的に標的を定めることもできる(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Kolhatkar et al.,Curr Drug Discov Technol.2011 8:197−206、Musacchio and Torchilin,Front Biosci.2011 16:1388−1412、Yu et al.,Mol Membr Biol.2010 27:286−298、Patil et al.,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.2008 25:1−61、Benoit et al.,Biomacromolecules.2011 12:2708−2714、Zhao et al.,Expert Opin Drug Deliv.2008 5:309−319、Akinc et al.,Mol Ther.2010 18:1357−1364、Srinivasan et al.,Methods Mol Biol.2012 820:105−116、Ben−Arie et al.,Methods Mol Biol.2012 757:497−507、Peer 2010 J Control Release.20:63−68、Peer et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2007 104:4095−4100、Kim et al.,Methods Mol Biol.2011 721:339−353、Subramanya et al.,Mol Ther.2010 18:2028−2037、Song et al.,Nat Biotechnol.2005 23:709−717、Peer et al.,Science.2008 319:627−630、Peer and Lieberman,Gene Ther.2011 18:1127−1133)。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、固体脂質ナノ粒子として製剤化される。固体脂質ナノ粒子(SLN)は、平均直径が10〜1000nmの球状であり得る。SLNは、親油性分子を可溶化することができ、界面活性剤および/または乳化剤により安定化され得る、固体脂質コアマトリックスを有する。さらなる実施形態において、脂質ナノ粒子は、自己集合性脂質−ポリマーナノ粒子であってもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Zhang et al.,ACS Nano,2008,2(8),pp 1696−1702を参照のこと)。
リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、これらの製剤が、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAによる細胞トランスフェクションを増加させ、かつ/またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させることが可能であり得るため、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの指示によるタンパク質産生の有効性を改善するために使用されてもよい。1つのそのような例は、ポリプレックスプラスミドDNAの有効な全身送達を可能にするための脂質カプセル封入の使用を伴う(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Heyes et al.,Mol Ther.2007 15:713−720)。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの安定性を増加させるためにも使用され得る。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、制御放出および/または標的を定めた送達のために製剤化することができる。本明細書で使用されるとき、「制御放出」は、特定の放出パターンに適合して治療成果をもたらす、薬学的組成物または化合物放出プロファイルを指す。一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、制御放出および/または標的を定めた送達のために、本明細書に記載され、かつ/または当技術分野で既知の送達剤中にカプセル封入されてもよい。本明細書で使用されるとき、「カプセル封入」という用語は、封入する、包囲する、または包み込むことを意味する。それが本発明の化合物の製剤に関するとき、カプセル封入は、実質的、完全、または部分的であってもよい。「実質的にカプセル封入される」という用語は、本発明の薬学的組成物または化合物の少なくとも50%超、60%超、70%超、80%超、85%超、90%超、95%超、96%超、97%超、98%超、99%超、99.9%超、99.9%超、または99.999%超が、送達剤内に封入される、包囲される、または包み込まれることを意味する。「部分的カプセル封入」は、本発明の薬学的組成物または化合物の10未満、10、20、30、40、50以下が、送達剤内に封入される、包囲される、または包み込まれることを意味する。有利なことに、カプセル封入は、蛍光および/または電子顕微鏡写真を用いて、本発明の薬学的組成物または化合物の脱出または活性を測定することによって決定されてもよい。例えば、本発明の薬学的組成物または化合物の少なくとも1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99、または99.99%超が、送達剤中にカプセル封入される。
一実施形態において、制御放出製剤は、トリブロックコポリマーを含んでもよいが、これらに限定されない。非限定的な例として、製剤は、2つの異なる種類のトリブロックコポリマーを含んでもよい(各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012131104号および同第WO2012131106号)。
別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、脂質ナノ粒子または急速排出脂質ナノ粒子中にカプセル封入されてもよく、脂質ナノ粒子または急速排出脂質ナノ粒子は次いで、本明細書に記載され、かつ/または当技術分野で既知のポリマー、ヒドロゲル、および/または手術用シーリング材中にカプセル封入されてもよい。非限定的な例として、ポリマー、ヒドロゲル、または手術用シーリング材は、PLGA、エチレン酢酸ビニル(EVAc)、ポロキサマー、GELSITE(登録商標)(Nanotherapeutics,Inc.Alachua,FL)、HYLENEX(登録商標)(Halozyme Therapeutics,San Diego CA)、フィブリノーゲンポリマー(Ethicon Inc.Cornelia、GA)、TISSELL(登録商標)(Baxter International、Inc Deerfield、IL)、PEGベースのシーリング材、およびCOSEAL(登録商標)(Baxter International,Inc Deerfield,IL)等の手術用シーリング材であってもよい。
別の実施形態において、脂質ナノ粒子は、対象に注入されるとゲルを形成し得る、当技術分野で既知の任意のポリマー中にカプセル封入されてもよい。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、生分解性であり得るポリマーマトリックス中にカプセル封入されてもよい。
一実施形態において、制御放出および/または標的を定めた送達のためのポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA製剤は、少なくとも1つの制御放出コーティング剤も含んでもよい。制御放出コーティング剤には、OPADRY(登録商標)、ポリビニルピロリドン/酢酸ビニルコポリマー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、EUDRAGIT RL(登録商標)、EUDRAGIT RS(登録商標)、およびエチルセルロース水性分散液(AQUACOAT(登録商標)およびSURELEASE(登録商標))等のセルロース誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、制御放出および/または標的を定めた送達製剤は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも1つの分解性ポリエステルを含んでもよい。分解性(Degradeable)ポリエステルには、ポリ(セリンエステル)、ポリ(L−ラクチド−co−L−リジン)、ポリ(4−ヒドロキシ−L−プロリンエステル)、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、分解性ポリエステルは、PEG化ポリマーを形成するためのPEG複合体化を含んでもよい。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、治療的ナノ粒子中にカプセル封入されてもよい。治療的ナノ粒子は、本明細書に記載の方法、ならびに各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2010005740号、同第WO2010030763号、同第WO2010005721号、同第WO2010005723号、同第WO2012054923号、米国公開第第US20110262491号、同第US20100104645号、同第US20100087337号、同第US20100068285号、同第US20110274759号、同第US20100068286号、および同第US20120288541、ならびに米国特許第8,206,747号、同第8,293,276号、同第8,318,208号、および同第8,318,211号等であるが、これらに限定されない当技術分野で既知の方法によって製剤化されてもよい。別の実施形態において、治療的ポリマーナノ粒子は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第US20120140790号に記載の方法によって特定されてもよい。
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、持続放出のために製剤化されてもよい。本明細書で使用されるとき、「持続放出」は、特定の一定期間にわたる放出速度に適合する薬学的組成物または化合物を指す。一定期間は、数時間、数日間、数週間、数ヶ月間、および数年間を含んでもよいが、これらに限定されない。非限定的な例として、持続放出ナノ粒子は、ポリマー、ならびに本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNA等であるが、それらに限定されない治療剤を含んでもよい(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第2010075072号、ならびに米国公開第US20100216804号、同第US20110217377号、および同第US20120201859号を参照のこと)。
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、標的特異的となるように製剤化されてもよい。非限定的な例として、治療的(thereapeutic)ナノ粒子は、コルチコステロイドを含んでもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2011084518号を参照のこと)。一実施形態において、治療的ナノ粒子は、癌特異的となるように製剤化されてもよい。非限定的な例として、治療的ナノ粒子は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2008121949号、同第WO2010005726号、同第WO2010005725号、同第WO2011084521号、ならびに米国公開第US20100069426号、同第US20120004293号、および同第US20100104655号に記載のナノ粒子に製剤化されてもよい。
一実施形態において、本発明のナノ粒子は、ポリマーマトリックスを含んでもよい。非限定的な例として、ナノ粒子は、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート(fumerate)、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ(オルトエステル)、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(セリンエステル)、ポリ(L−ラクチド−co−L−リジン)、ポリ(4−ヒドロキシ−L−プロリンエステル)またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない2つ以上のポリマーを含んでもよい。
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、ジブロックコポリマーを含む。一実施形態において、ジブロックコポリマーには、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート(fumerate)、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ(オルトエステル)、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(セリンエステル)、ポリ(L−ラクチド−co−L−リジン)、ポリ(4−ヒドロキシ−L−プロリンエステル)またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されないポリマーと組み合わせたPEGが含まれてもよい。
非限定的な例として、治療的ナノ粒子は、PLGA−PEGブロックコポリマーを含む(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第US20120004293号および米国特許第8,236,330号を参照のこと)。別の非限定的な例において、治療的ナノ粒子は、PEGとPLAまたはPEGとPLGAのジブロックコポリマーを含む、ステルスナノ粒子である(各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,246,968号および国際公開第WO2012166923号を参照のこと)。
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、マルチブロックコポリマーを含んでもよい(例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,263,665号および同第8,287,910号を参照のこと)。
一実施形態において、本明細書に記載のブロックコポリマーは、非ポリマーミセルおよびブロックコポリマーを含む、ポリイオン複合体に含まれてもよい。(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20120076836号を参照のこと)。
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、少なくとも1つのアクリルポリマーを含んでもよい。アクリルポリマーには、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、ポリシアノアクリレート、ならびにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、本明細書に記載され、かつ/または当技術分野で既知の少なくとも1つのカチオン性ポリマーを含んでもよい。
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ(アミドアミン)デンドリマー、ポリ(β−アミノエステル)(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,287,849号を参照のこと)、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない少なくとも1つのアミン含有ポリマーを含んでもよい。
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも1つの分解性ポリエステルを含んでもよい。分解性(Degradeable)ポリエステルには、ポリ(セリンエステル)、ポリ(L−ラクチド−co−L−リジン)、ポリ(4−ヒドロキシ−L−プロリンエステル)、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、分解性ポリエステルは、PEG化ポリマーを形成するためのPEG複合体化を含んでもよい。
別の実施形態において、治療的ナノ粒子は、少なくとも1つの標的化リガンドの複合体化を含んでもよい。標的化リガンドは、モノクローナル抗体等であるが、これらに限定されない、当技術分野で既知の任意のリガンドであってもよい。(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Kirpotin et al,Cancer Res.2006 66:6732−6740)。
一実施形態において、治療的ナノ粒子は、水溶液中で製剤化されてもよく、それを用いて癌を標的としてもよい(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2011084513号および米国公開第US20110294717号を参照のこと)。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、合成ナノ担体中にカプセル封入され、それと連結され、かつ/またはそれと会合されてもよい。合成ナノ担体には、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2010005740号、同第WO2010030763号、同第WO201213501号、同第WO2012149252号、同第WO2012149255号、同第WO2012149259号、同第WO2012149265号、同第WO2012149268号、同第WO2012149282号、同第WO2012149301号、同第WO2012149393号、同第WO2012149405号、同第WO2012149411号、同第WO2012149454号、および同第WO2013019669号、ならびに米国公開第US20110262491号、同第US20100104645号、同第US20100087337号、および同第US20120244222号に記載の合成ナノ担体が含まれるが、これらに限定されない。合成ナノ担体は、当技術分野で既知のおよび/または本明細書に記載の方法を用いて製剤化され得る。非限定的な例として、合成ナノ担体は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2010005740号、同第WO2010030763号、および同第WO201213501号、ならびに米国公開第US20110262491号、同第US20100104645号、同第US20100087337号、および同第US2012024422号に記載の方法によって製剤化され得る。別の実施形態において、合成ナノ担体製剤は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2011072218号および米国特許第8,211,473号に記載の方法によって凍結乾燥させ得る。
一実施形態において、合成ナノ担体は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAを放出するための反応性基を含有してもよい(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO20120952552号および米国公開第US20120171229号を参照のこと)。
一実施形態において、合成ナノ担体は、合成ナノ担体の送達による免疫応答を向上させるための免疫刺激性薬剤を含有してもよい。非限定的な例として、合成ナノ担体は、免疫系のTh1ベースの応答を向上させ得るTh1免疫刺激性薬剤を含んでもよい(各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2010123569号および米国公開第US20110223201号を参照のこと)。
一実施形態において、合成ナノ担体は、標的を定めた放出のために製剤化されてもよい。一実施形態において、合成ナノ担体は、指定されるpHで、かつ/または所望の時間間隔の後にポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAを放出するように製剤化される。非限定的な例として、合成ナノ粒子は、24時間後にかつ/または4.5のpHでポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAを放出するように製剤化されてもよい(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2010138193号、および同第WO2010138194号、ならびに米国公開第US20110020388号、および同第US20110027217号を参照のこと)。
一実施形態において、合成ナノ担体は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAの制御放出および/または持続放出のために製剤化されてもよい。非限定的な例として、持続放出のための合成ナノ担体は、当技術分野で既知であり、本明細書に記載され、かつ/または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2010138192および米国公開第20100303850号に記載の方法によって製剤化されてもよい。
一実施形態において、合成ナノ担体は、ワクチンとして使用するために製剤化されてもよい。一実施形態において、合成ナノ担体は、少なくとも1つの抗原をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAをカプセル封入してもよい。非限定的な例として、合成ナノ担体は、少なくとも1つの抗原およびワクチン剤形のため賦形剤を含んでもよい(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2011150264号および米国公開第US20110293723号を参照のこと)。別の非限定的な例として、ワクチン剤形が、同じまたは異なる抗原を有する少なくとも2つの合成ナノ担体、および賦形剤を含んでもよい(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2011150249号および米国公開第US20110293701号を参照のこと)。ワクチン剤形は、本明細書に記載され、当技術分野で既知であり、かつ/または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2011150258号および米国公開第US20120027806号に記載の方法によって、選択されてもよい。
一実施形態において、合成ナノ担体は、少なくとも1つのアジュバントをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAを含んでもよい。非限定的な例として、アジュバントは、ジメチルジオクタデシルアンモニウム−ブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウム−クロリド、ジメチルジオクタデシルアンモニウム−リン酸塩、またはジメチルジオクタデシルアンモニウム−酢酸塩(DDA)、およびマイコバクテリウム属の総脂質抽出物の無極性画分または該無極性画分の一部を含んでもよい(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,241,610号を参照のこと)。別の実施形態において、合成ナノ担体は、少なくとも1つのポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNA、ならびにアジュバントを含んでもよい。非限定的な例として、アジュバントを含む合成ナノ担体は、各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2011150240号および米国公開第US20110293700号に記載の方法によって製剤化されてもよい。
一実施形態において、合成ナノ担体は、ウイルス由来のペプチド、断片、または領域をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAをカプセル封入してもよい。非限定的な例として、合成ナノ担体には、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012024621号、同第WO201202629号、同第WO2012024632号、ならびに米国公開第US20120064110号、同第US20120058153号、および同第US20120058154号に記載のナノ担体が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、合成ナノ担体は、体液性応答および/または細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を触発することが可能であり得るポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに連結されてもよい(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2013019669号を参照のこと)。
一実施形態において、ナノ粒子は、経口投与のために最適化されてもよい。ナノ粒子は、キトサンまたはその誘導体等であるが、これらに限定されない少なくとも1つのカチオン性バイオポリマーを含んでもよい。非限定的な例として、ナノ粒子は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20120282343号に記載の方法によって製剤化されてもよい。
ポリマー、生分解性ナノ粒子、およびコア−シェルナノ粒子 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、天然および/または合成ポリマーを用いて製剤化することができる。送達に使用され得るポリマーの非限定的な例としては、MIRUS(登録商標)Bio(Madison,WI)およびRoche Madison(Madison,WI)によるDYNAMIC POLYCONJUGATE(登録商標)(Arrowhead Reasearch Corp.,Pasadena,CA)製剤、制限なく、SMARTT POLYMER TECHNOLOGY(商標)(PHASERX(登録商標)、Seattle,WA)等のPHASERX(商標)ポリマー製剤、DMRI/DOPE、ポロキサマー、Vical(San Diego,CA)によるVAXFECTIN(登録商標)アジュバント、キトサン、Calando Pharmaceuticals(Pasadena,CA)によるシクロデキストリン、デンドリマーおよびポリ(乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)ポリマー、RONDEL(商標)(RNAi/オリゴヌクレオチドナノ粒子送達)ポリマー(Arrowhead Research Corporation,Pasadena,CA)、ならびにPHASERX(登録商標)(Seattle,WA)等であるが、これらに限定されないpH応答性ブロックコポリマー(co−block polymers)が挙げられる。
キトサン製剤の非限定的な例としては、正電荷性のキトサンのコア、ならびに負電荷性の基質の外側部分が挙げられる(参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20120258176号)。キトサンには、N−トリメチルキトサン、モノ−N−カルボキシメチルキトサン(MCC)、N−パルミトイルキトサン(NPCS)、EDTA−キトサン、低分子量キトサン、キトサン誘導体、またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、本発明において使用されるポリマーは、細菌等であるが、これらに限定されない望ましくない物質のポリマーの表面への結合を低減し、かつ/または阻害するためのプロセシングを経ている。ポリマーは、当技術分野で既知であり、かつ/または当技術分野で記載され、かつ/または参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012150467号に記載の方法によって処理されてもよい。
PLGA製剤の非限定的な例としては、PLGA注入用デポーが挙げられるが、これらに限定されない(例えば、PLGAを、66%のN−メチル−2−ピロリドン(NMP)中に溶解させることによって形成され、残りの部分が水性溶媒およびロイプロリドである、ELIGARD(登録商標)。一旦注入されると、PLGAおよびロイプロリドペプチドは、皮下腔に沈殿する)。
これらのポリマーアプローチのうちの多くは、インビボでオリゴヌクレオチドを細胞の細胞質中に送達することにおいて有効性を実証している(参照により全体が本明細書に組み込まれる、deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125−132において概説される)。核酸(この実例では小分子干渉RNA(siRNA)を用いて)の強固なインビボ送達をもたらした2つのポリマーアプローチは、動的ポリ複合体(polyconjugate)およびシクロデキストリンベースのナノ粒子である。これらの送達アプローチのうちの第1のアプローチは、動的ポリ複合体を使用し、マウスにおいてインビボでsiRNAを有効に送達し、肝細胞内で内因性標的mRNAをサイレンシングすることが示されている(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Rozema et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2007 104:12982−12887)。この特定のアプローチは、多成分ポリマー系であり、その主要な特長として、核酸(この実例ではsiRNA)がジスルフィド結合を介して共有結合され、PEG(電荷遮蔽のため)基およびN−アセチルガラクトサミン(肝細胞標的化のため)基の両方がpH感受性結合を介して連結される、膜活性ポリマーが含まれる(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Rozema et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2007 104:12982−12887)。肝細胞に結合し、エンドソームに進入すると、ポリマー複合体は、低pH環境において解体し、このポリマーがその陽電荷を露出して、エンドソームからの脱出、およびポリマーから細胞質へのsiRNAの放出をもたらす。N−アセチルガラクトサミン基の、マンノース基との置き換えを介して、アシアロ糖タンパク質受容体を発現する肝細胞から、類洞内皮細胞およびクッパー細胞へと標的合わせを変化させ得ることが示された。別のポリマーアプローチは、トランスフェリンを標的とするシクロデキストリン含有ポリカチオンナノ粒子を使用することを伴う。これらのナノ粒子は、トランスフェリン受容体を発現するユーイング肉腫腫瘍細胞において、EWS−FLI1遺伝子産物の標的を定めたサイレンシングを実証してきており(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Hu−Lieskovan et al.,Cancer Res.2005 65:8984−8982)、これらのナノ粒子中に製剤化されたsiRNAは、非ヒト霊長類において耐性が良好であった(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Heidelet al.,Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:5715−21)。これらの送達戦略の両方は、標的を定めた送達機構およびエンドソームからの脱出機構の両方を用いた合理的なアプローチを組み込む。
ポリマー製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの持続放出または遅延放出を可能にし得る(例えば、筋肉内または皮下注入後に)。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAについての変化した放出プロファイルは、例えば、長期間にわたってコードされたタンパク質の翻訳をもたらすことができる。ポリマー製剤をまた使用して、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの安定性を増加させ得る。生分解性ポリマーが、mmRNA以外の核酸を分解から保護するために以前に使用されており、インビボでペイロードの持続放出をもたらすことが示されている(各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Rozema et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2007 104:12982−12887、Sullivan et al.,Expert Opin Drug Deliv.2010 7:1433−1446、Convertine et al.,Biomacromolecules.2010 Oct 1、Chu et al.,Acc Chem Res.2012 Jan 13、Manganiello et al.,Biomaterials.2012 33:2301−2309、Benoit et al.,Biomacromolecules.2011 12:2708−2714、Singha et al.,Nucleic Acid Ther.2011 2:133−147、deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125−132、Schaffert and Wagner,Gene Ther.2008 16:1131−1138、Chaturvedi et al.,Expert Opin Drug Deliv.2011 8:1455−1468、Davis、Mol Pharm.2009 6:659−668、Davis,Nature 2010 464:1067−1070)。
一実施形態において、薬学的組成物は、持続放出製剤であってもよい。さらなる実施形態において、持続放出製剤は、皮下送達のためであってもよい。持続放出製剤には、PLGAミクロスフェア、エチレン酢酸ビニル(EVAc)、ポロキサマー、GELSITE(登録商標)(Nanotherapeutics,Inc.Alachua,FL)、HYLENEX(登録商標)(Halozyme Therapeutics,San Diego CA)、フィブリノーゲンポリマー(Ethicon Inc.Cornelia,GA)、TISSELL(登録商標)(Baxter International,Inc Deerfield,IL)、PEGベースのシーリング材、およびCOSEAL(登録商標)(Baxter International,Inc Deerfield,IL)等の手術用シーリング材が含まれ得る。
非限定的な例として、修飾mRNAは、調整可能な放出速度を有する(例えば、数日間および数週間)PLGAミクロスフェアを調製し、修飾mRNAを、カプセル封入プロセス中に修飾mRNAの完全性を維持しながら、PLGAミクロスフェア中にカプセル封入することによって、PLGAミクロスフェア中に製剤化されてもよい。EVAcは、前臨床の持続放出埋込物適用において広範に使用される、非生分解性(non−biodegradeable)の、生体適合性ポリマーである(例えば、緑内障に対するピロカルピン眼内挿入物である持続放出製品Ocusertまたは持続放出プロゲステロン子宮内器具であるProgestasert;経皮送達系Testoderm、Duragesic、およびSelegiline;カテーテル)。ポロキサマー F−407 NFは、5℃未満の温度で低粘度を有する、親水性の非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンのトリブロックコポリマーであり、15℃を超える温度で固体ゲルを形成する。PEGベースの手術用シーリング材は、1分間で調製することができ、3分間でシーリングし、30日以内に再吸収される、送達デバイスにおいて混合された2つの合成PEG構成成分を含む。GELSITE(登録商標)および天然ポリマーは、投与部位におけるインサイツのゲル化が可能である。それらは、イオン性相互作用(ineraction)を介してタンパク質およびペプチド治療候補と相互作用して、安定化効果を提供することが示されている。
ポリマー製剤は、葉酸塩、トランスフェリン、およびN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)により例として示されるが、これらによって限定されない異なるリガンドの発現を介して選択的に標的を定めることもできる(各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、Benoit et al.,Biomacromolecules.2011 12:2708−2714、Rozema et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2007 104:12982−12887、Davis,Mol Pharm.2009 6:659−668、Davis,Nature 2010 464:1067−1070)。
本発明の修飾核酸、およびmmRNAは、ポリマー化合物とともにまたはポリマー化合物中に製剤化されてもよい。ポリマーには、ポリエテン(polyethenes)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ(l−リジン)(PLL)、PLLにグラフトされたPEG、カチオン性リポポリマー、生分解性カチオン性リポポリマー、ポリエチレンイミン(PEI)、架橋分岐状ポリ(アルキレンイミン)、ポリアミン誘導体、修飾ポロキサマー、生分解性ポリマー、弾力のある生分解性ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルブロックランダムコポリマー、マルチブロックコポリマー、線状生分解性コポリマー、ポリ[α−(4−アミノブチル)−L−グリコール酸)(PAGA)、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマレート(fumerate)、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ(オルトエステル)、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン、ポリリジン、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(セリンエステル)、ポリ(L−ラクチド−co−L−リジン)、ポリ(4−ヒドロキシ−L−プロリンエステル)、アクリルポリマー、アミン含有ポリマー、デキストランポリマー、デキストランポリマー誘導体またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない少なくとも1つのポリマーが含まれてもよい。
非限定的な例として、本発明の修飾核酸またはmmRNAは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第6,177,274号に記載のPLLでグラフトされたPEGのポリマー化合物とともに製剤化されてもよい。製剤は、インビトロで細胞をトランスフェクトするため、または修飾核酸およびmmRNAのインビボ送達のために使用されてもよい。別の例において、修飾核酸およびmmRNAは、カチオン性ポリマーを含む溶液もしくは媒体中に、乾燥した薬学的組成物中に、または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる米国公開第20090042829号および同第20090042825号に記載の乾燥させることができる溶液中に懸濁させてもよい。
別の非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、PLGA−PEGブロックコポリマー(参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第US20120004293号および米国特許第8,236,330号を参照のこと)またはPLGA−PEG−PLGAブロックコポリマー(参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,004,573号を参照のこと)とともに製剤化されてもよい。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、PEGとPLAまたはPEGとPLGAのジブロックコポリマーとともに製剤化されてもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,246,968号を参照のこと)。
ポリアミン誘導体を用いて、核酸を送達するか、または疾患を治療および/もしくは予防するか、または埋込型もしくは注入型デバイスに含めてもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20100260817号)。非限定的な例として、薬学的組成物は、修飾核酸およびmmRNA、ならびに内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国公開第20100260817号に記載のポリアミン誘導体を含んでもよい。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、炭水化物ジアジドモノマーを、オリゴアミンを含むジルキン(dilkyne)単位と組み合わせることによって調製される1,3−双極性付加ポリマーを含むポリマー等であるが、これらに限定されない、ポリアミドポリマーを用いて送達されてもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,236,280号)。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2011115862号、同第WO2012082574号、および同第WO2012068187号、ならびに米国公開第20120283427号に記載の少なくとも1つのポリマーおよび/またはその誘導体とともに製剤化されてもよい。別の実施形態において、本発明の修飾核酸またはmmRNAは、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2011115862号に記載の式Zのポリマーとともに製剤化されてもよい。さらに別の実施形態において、修飾核酸またはmmRNAは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012082574号または同第WO2012068187号および米国公開第2012028342号に記載の式Z、Z’、またはZ’’のポリマーとともに製剤化されてもよい。本発明の修飾RNAとともに製剤化されるポリマーは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012082574号または同第WO2012068187号に記載の方法によって合成されてもよい。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、少なくとも1つのアクリルポリマーとともに製剤化されてもよい。アクリルポリマーには、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、ポリシアノアクリレート、ならびにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの製剤は、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリ(アミドアミン)デンドリマー、またはこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない少なくとも1つのアミン含有ポリマーを含んでもよい。
例えば、本発明の修飾核酸またはmmRNAは、ポリ(アルキレンイミン)、生分解性カチオン性リポポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ポリマー、もしくは生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、生分解性ポリエステルランダムコポリマー、線状生分解性コポリマー、PAGA、生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマー、またはこれらの組み合わせを含む薬学的化合物中に製剤化されてもよい。生分解性カチオン性リポポリマーは、当技術分野で既知の方法、ならびに/または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,696,038号、米国出願第20030073619号、および同第20040142474号に記載の方法によって作製されてもよい。ポリ(アルキレンイミン)は、当技術分野で既知の方法、および/または参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第20100004315号に記載の方法を用いて作製されてもよい。生分解性(biodegradabale)ポリマー、生分解性ブロックコポリマー、生分解性ランダムコポリマー、生分解性ポリエステルブロックコポリマー、生分解性ポリエステルポリマー、または生分解性ポリエステルランダムコポリマーは、当技術分野で既知の方法、ならびに/または内容がそれぞれ参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,517,869号および同第6,267,987号に記載の方法を用いて作製されてもよい。線状生分解性コポリマーは、当技術分野で既知であり、かつ/または米国特許第6,652,886号に記載の方法を用いて作製されてもよい。PAGAポリマーは、当技術分野で既知の方法、ならびに/または参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第6,217,912号に記載の方法を用いて作製されてもよい。PAGAポリマーは、共重合して、ポリ−L−リジン、ポリアルギン(polyargine)、ポリオルニチン、ヒストン、アビジン、プロタミン、ポリラクチド、およびポリ(ラクチド−co−グリコリド)等であるが、これらに限定されないポリマーとともにコポリマーまたはブロックコポリマーを形成してもよい。生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマーは、当技術分野で既知の方法、ならびに/または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,057,821もしくは米国公開第2012009145号に記載の方法によって作製されてもよい。例えば、マルチブロックコポリマーは、分岐状ポリエチレンイミンと比較して明確に異なるパターンを有する線状ポリエチレンイミン(LPEI)ブロックを用いて合成されてもよい。さらに、組成物または薬学的組成物は、当技術分野で既知の方法、本明細書に記載の方法、または各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20100004315号もしくは米国特許第6,267,987号および同第6,217,912号に記載の方法によって作製されてもよい。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、ポリカチオン性側鎖を含有し得る少なくとも1つの分解性ポリエステルとともに製剤化されてもよい。分解性(Degradeable)ポリエステルには、ポリ(セリンエステル)、ポリ(L−ラクチド−co−L−リジン)、ポリ(4−ヒドロキシ−L−プロリンエステル)、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、分解性ポリエステルは、PEG化ポリマーを形成するためのPEG複合体化を含んでもよい。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、mmRNAは、少なくとも1つの架橋性ポリエステルとともに製剤化されてもよい。架橋性ポリエステルは、当技術分野で既知であり、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第20120269761号に記載の架橋性ポリエステルを含む。
一実施形態において、本明細書に記載のポリマーは、脂質末端を有する(lipid−terminating)PEGに複合体化されてもよい。非限定的な例として、PLGAは、脂質末端を有するPEGに複合体化されて、PLGA−DSPE−PEGを形成してもよい。別の非限定的な例として、本発明とともに使用するためのPEG複合体は、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2008103276号に記載されている。ポリマーは、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第8,273,363号に記載の複合体等であるが、これらに限定されないリガンド複合体を用いて接合されてもよい。
一実施形態において、本明細書に記載の修飾RNAは、別の化合物と複合体化されてもよい。複合体の非限定的な例は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第7,964,578号および同第7,833,992号に記載されている。別の実施形態において、本発明の修飾RNAは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第7,964,578号および同第7,833,992号に記載の式1〜122の複合体と複合体化されてもよい。本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、金等であるが、これらに限定されない金属と複合体化されてもよい。(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Giljohann et al.Journ.Amer.Chem.Soc.2009 131(6):2072−2073を参照のこと)。別の実施形態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、金ナノ粒子中と複合体化および/またはカプセル封入されてもよい。(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO201216269号および米国公開第20120302940号)。
参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第20100004313号に記載されるように、遺伝子送達組成物は、ヌクレオチド配列およびポロキサマーを含んでもよい。例えば、本発明(present inveition)の修飾核酸およびmmRNAは、米国公開第20100004313号に記載のポロキサマーを含む遺伝子送達組成物において使用されてもよい。
一実施形態において、本発明のポリマー製剤は、カチオン性担体を含み得るポリマー製剤を、コレステロール基およびポリエチレングリコール基に共有結合され得るカチオン性リポポリマーと接触させることによって、安定化されてもよい。ポリマー製剤は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国公開第20090042829号に記載の方法を用いてカチオン性リポポリマーと接触させてもよい。カチオン性担体には、ポリエチレンイミン、ポリ(トリメチレンイミン)、ポリ(テトラメチレンイミン)、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド−ポリアミン、ジデオキシ−ジアミノ−b−シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ(2−ジメチルアミノ)エチルメタクリレート、ポリ(リジン)、ポリ(ヒスチジン)、ポリ(アルギニン)、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン(DOTAP)、N−[1−(2,3−ジオレオイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、1−[2−(オレオイルオキシ)エチル]−2−オレイル−3−(2−ヒドロキシエチル)イミダゾリニウムクロリド(DOTIM)、2,3−ジオレイルオキシ−N−[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]−N,N−ジメチル−1−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸塩(DOSPA)、3B−[N-(N’,N’−ジメチルアミノエタン)−カルバモイル]コレステロール塩酸塩(DC−コレステロールHCl)ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン(DOGS)、N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、N−(1,2−ジミリスチルオキシプロパ−3−イル)−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、N,N−ジオレイル−N,N−ジメチル塩化アンモニウムDODAC)、およびこれらの組み合わせが含まれてもよいが、これらに限定されない。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、1つ以上のポリマーのポリプレックス中に製剤化されてもよい(各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20120237565号および同第20120270927号)。一実施形態において、ポリプレックスは、2つ以上のカチオン性ポリマーを含む。カチオン性(catioinic)ポリマーは、線状PEI等のポリ(エチレンイミン)(PEI)を含んでもよい。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、ポリマー、脂質、および/またはリン酸カルシウム等であるが、これらに限定されない他の生分解性薬剤の組み合わせを用いてナノ粒子として製剤化することもできる。構成成分は、ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAの送達が向上し得るようにナノ粒子の微調整を可能にするために、コア−シェル、ハイブリッド、および/または交互積層アーキテクチャとして組み合わされてもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Wang et al.,Nat Mater.2006 5:791−796、Fuller et al.,Biomaterials.2008 29:1526−1532、DeKoker et al.,Adv Drug Deliv Rev.2011 63:748−761、Endres et al.,Biomaterials.2011 32:7721−7731、Su et al.,Mol Pharm.2011 Jun 6;8(3):774−87)。非限定的な例として、ナノ粒子は、親水性−疎水性ポリマー(例えば、PEG−PLGA)、疎水性ポリマー(例えば、PEG)、および/または親水性ポリマー等であるが、これらに限定されない複数のポリマーを含んでもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO20120225129号)。
脂質および/またはポリマーと組み合わせた生分解性リン酸カルシウムナノ粒子は、インビボでポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAを送達することが示されている。一実施形態において、アニスアミド等の標的化リガンドもまた含有し得る、脂質でコーティングされたリン酸カルシウムナノ粒子を用いて、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAを送達してもよい。例えば、マウス転移性肺モデルにおいてsiRNAを有効に送達するために、脂質でコーティングされたリン酸カルシウムナノ粒子が使用された(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Li et al.,J Contr Rel.2010 142:416−421、Li et al.,J Contr Rel.2012 158:108−114、Yang et al.,Mol Ther.2012 20:609−615)。この送達系は、siRNAの送達を改善するために、標的を定めたナノ粒子と、エンドソームからの脱出を向上させるための構成成分リン酸カルシウムとの両方を組み合わせる。
一実施形態において、PEG−ポリアニオンブロックコポリマーとともにリン酸カルシウムを用いて、ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAを送達してもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Kazikawa et al.,J Contr Rel.2004 97:345−356、Kazikawa et al.,J Contr Rel.2006 111:368−370)。
一実施形態において、PEG電荷変換型ポリマー(Pitella et al.,Biomaterials.2011 32:3106−3114)を用いて、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAを送達するためのナノ粒子を形成してもよい。PEG電荷変換型ポリマーは、酸性pHでポリカチオンへと切断され、それ故に、エンドソームからの脱出を向上させることによって、PEG−ポリアニオンブロックコポリマーを改善し得る。
コア−シェルナノ粒子の使用は、カチオン性架橋ナノゲルコアおよび種々のシェルを合成するための高処理アプローチにさらに焦点を当てている(Siegwart et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2011 108:12996−13001)。ポリマーナノ粒子の複合体形成、送達、および内在化は、ナノ粒子のコア構成成分およびシェル構成成分の両方の化学組成を変化させることによって精密に制御することができる。例えば、コア−シェルナノ粒子は、コレステロールをナノ粒子に共有結合させた後に、siRNAをマウス肝細胞に効率的に送達し得る。
一実施形態において、中間のPLGA層およびPEGを含有する外側の中性脂質層を含む、中空の脂質コアを用いて、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAを送達してもよい。非限定的な例として、ルシフェラーゼ(luciferease)発現腫瘍を担持するマウスにおいて、脂質−ポリマー−脂質ハイブリッドナノ粒子が、従来のリポプレックスと比較して、ルシフェラーゼ発現を有意に抑制することが確認された(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Shi et al,Angew Chem Int Ed.2011 50:7027−7031)。
一実施形態において、脂質ナノ粒子は、本明細書に開示の修飾核酸分子のコア、およびポリマーシェルを含み得る。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、かつ当技術分野で既知のポリマーのうちのいずれでもあり得る。さらなる実施形態において、ポリマーシェルを用いて、コアにおける修飾核酸を保護し得る。
本発明の修飾核酸分子とともに使用するためのコア−シェルナノ粒子が記載されており、これは、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第8,313,777号に記載の方法によって形成されてもよい。
一実施形態において、コア−シェルナノ粒子は、本明細書に開示の修飾核酸分子のコア、およびポリマーシェルを含み得る。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、かつ当技術分野で既知のポリマーのうちのいずれでもあり得る。さらなる実施形態において、ポリマーシェルを用いて、コアにおける修飾核酸分子を保護し得る。非限定的な例として、コア−シェルナノ粒子を用いて、眼疾患または障害を治療し得る(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20120321719号を参照のこと)。
一実施形態において、本明細書に記載の製剤とともに使用されるポリマーは、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2011120053号に記載の修飾ポリマー(修飾ポリアセタール等であるが、これらに限定されない)であってもよい。
ペプチドおよびタンパク質 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによる細胞のトランスフェクションを増加させるために、ペプチドおよび/またはタンパク質とともに製剤化することができる。一実施形態において、細胞透過性ペプチドならびに細胞内送達を可能にするタンパク質およびペプチド等であるが、これらに限定されないペプチドを用いて、薬学的製剤を送達してもよい。本発明の薬学的製剤とともに使用され得る細胞透過性ペプチドの非限定的な例としては、細胞内空間への送達を容易にする、ポリカチオンに結合した細胞透過性ペプチド配列、例えば、HIV由来TATペプチド、ペネトラチン、トランスポータン、またはhCT由来細胞透過性ペプチドである(例えば、すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Caron et al.,Mol.Ther.3(3):310−8(2001)、Langel,Cell−Penetrating Peptides:Processes and Applications(CRC Press,Boca Raton FL,2002)、El−Andaloussi et al.,Curr.Pharm.Des.11(28):3597−611(2003)、およびDeshayes et al.,Cell.Mol.Life Sci.62(16):1839−49(2005)を参照のこと)。組成物は、組成物の細胞内空間への送達を向上させる細胞透過性薬剤、例えば、リポソームを含むように製剤化することもできる。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、細胞内送達を可能にするために、Aileron Therapeutics(Cambridge,MA)およびPermeon Biologics(Cambridge,MA)によるペプチドおよび/またはタンパク質等であるが、これらに限定されない、ペプチドおよび/またはタンパク質に複合体形成されてもよい(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Cronican et al.,ACS Chem.Biol.2010 5:747−752、McNaughton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2009 106:6111−6116、Sawyer,Chem Biol Drug Des.2009 73:3−6、Verdine and Hilinski,Methods Enzymol.2012;503:3−33)。
一実施形態において、細胞透過性ポリペプチドは、第1のドメインおよび第2のドメインを含み得る。第1のドメインは、超荷電ポリペプチドを含み得る。第2のドメインは、タンパク質結合パートナーを含み得る。本明細書で使用されるとき、「タンパク質結合パートナー」には、抗体およびその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドが含まれるが、これらに限定されない。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーのための細胞内結合パートナーをさらに含み得る。細胞透過性ポリペプチドは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが導入され得る細胞から分泌されることが可能であり得る。
ペプチドまたはタンパク質を含む製剤を用いて、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAによる細胞トランスフェクションを増加させ、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAの生体分布を変化させ(例えば、具体的な組織または細胞型を標的とすることによって)、かつ/またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させることができる。(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012110636号を参照のこと)。
細胞 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、エクスビボで細胞中にトランスフェクトすることができ、それがその後、対象に移植される。非限定的な例として、薬学的組成物は、修飾RNAを肝臓および骨髄細胞に送達するための赤血球、修飾RNAをウイルス様粒子(VLP)中で送達するためのビロソーム、ならびにMAXCYTE(登録商標)(Gaithersburg,MD)による細胞、およびERYTECH(登録商標)(Lyon,France)による細胞等であるが、これらに限定されない、修飾RNAを送達するためのエレクトロポレーション処理された細胞を含んでもよい。mmRNA以外のペイロードを送達するための赤血球、ウイルス粒子、およびエレクトロポレーション処理された細胞の使用例が、文書化されている(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Godfrin et al.,Expert Opin Biol Ther.2012 12:127−133、Fang et al.,Expert Opin Biol Ther.2012 12:385−389、Hu et al.,Proc Natl Acad Sci USA.2011 108:10980−10985、Lund et al.,Pharm Res.2010 27:400−420、Huckriede et al.,J Liposome Res.2007;17:39−47、Cusi,Hum Vaccin.2006 2:1−7、de Jonge et al.,Gene Ther.2006 13:400−411)。
ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2011085231号および米国公開第20110171248号に記載の方法によって合成される合成VLP中で送達されてもよい。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAの細胞ベースの製剤を用いて、細胞トランスフェクションを確実にし(例えば、細胞担体中の)、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAの生体分布を変化させ(例えば、細胞担体の標的を具体的な組織または細胞型に定めることによって)、かつ/またはコードされたタンパク質の翻訳を増加させてもよい。
ウイルスおよび非ウイルス媒介性技法を含む、核酸の細胞内への導入に好適である多様な方法が当技術分野で知られている。典型的な非ウイルス媒介性技法の例としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介性移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソーム媒介性移入、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル媒介性移入(ナノ粒子)、カチオン性ポリマー媒介性移入(DEAE−デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール(PEG)等)、または細胞融合が挙げられるが、これらに限定されない。
ソノポレーション、または細胞超音波処理の技法は、細胞原形質膜の透過性修飾するために音(例えば、超音波周波数)を使用するものである。ソノポレーション法は、当業者に知られており、インビボで核酸を送達するために使用される(すべて参照により全体が本明細書に組み込まれる、Yoon and Park,Expert Opin Drug Deliv.2010 7:321−330、Postema and Gilja,Curr Pharm Biotechnol.2007 8:355−361、Newman and Bettinger,Gene Ther.2007 14:465−475)。ソノポレーション法は、当技術分野で知られており、また、例えば、それが細菌に関する場合には、米国特許公開第20100196983号において、それが他の細胞型に関する場合には、例えば、米国特許公開20100009424号において教示され、これらの各々は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
エレクトロポレーション技法もまた、当技術分野で周知であり、インビボでおよび臨床的に核酸を送達するために使用される(すべて参照により全体が本明細書に組み込まれる、Andre et al.,Curr Gene Ther.2010 10:267−280、Chiarella et al.,Curr Gene Ther.2010 10:281−286、Hojman,Curr Gene Ther.2010 10:128−138)。一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、実施例8に記載されるようにエレクトロポレーションによって送達され得る。
ヒアルロニダーゼ 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの筋肉内または皮下局所注入は、ヒアルロナンの加水分解を触媒する、ヒアルロニダーゼを含むことができる。介在性の関門の構成物質であるヒアルロナンの加水分解を触媒することによって、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナンの粘度を低下させて、それによって組織透過性を増加させる(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Frost,Expert Opin.Drug Deliv.(2007)4:427−440)。それらの分散およびトランスフェクトされた細胞によって産生されるコードされたタンパク質の全身への分布を加速することが有用である。あるいは、ヒアルロニダーゼを用いて、筋肉内にまたは皮下に投与された本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに曝露される細胞の数を増加させることができる。
ナノ粒子模倣体 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、ナノ粒子模倣体内にカプセル封入されかつ/またはそれに吸収され得る。ナノ粒子模倣体は、病原体、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、プリオン、および細胞等であるが、これらに限定されない、生物または粒子の送達機能を模倣することができる。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、ウイルスの送達機能を模倣することができる非バイロン(viron)粒子中にカプセル封入されてもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012006376号を参照のこと)。
ナノチューブ 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、ロゼットナノチューブ、リンカーを用いたツイン塩基(twin bases)を有するロゼットナノチューブ、カーボンナノチューブおよび/または単層カーボンナノチューブ等であるが、これらに限定されない、少なくとも1つのナノチューブに付着または結合され得る。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、立体(steric)力、イオン力、共有結合力、および/または他の力等であるが、これらに限定されない力を介してナノチューブに結合され得る。
一実施形態において、ナノチューブは、1つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを細胞内に放出することができる。少なくとも1つのナノチューブのサイズおよび/または表面構造を、体内でナノチューブの相互作用を制御し、かつ/または本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAに付着または結合するように変化させることができる。一実施形態において、少なくとも1つのナノチューブのビルディングブロックおよび/またはそのビルディングブロックに結合される官能基を、ナノチューブの寸法および/または特性を調整するように変化させることができる。非限定的な例として、ナノチューブの長さは、ナノチューブが正常な血管の壁の穴を通過するのを妨害するが、依然として腫瘍組織の血管におけるより大きい穴を通過するのに十分に小さくあるように変化させてもよい。
一実施形態において、少なくとも1つのナノチューブは、ポリエチレングリコール等であるが、これらに限定されないポリマーを含む送達向上化合物でコーティングされてもよい。別の実施形態において、少なくとも1つのナノチューブおよび/またはポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、薬学的に許容される賦形剤および/または送達ビヒクルと混合されてもよい。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、少なくとも1つのロゼットナノチューブに付着および/または結合される。ロゼットナノチューブは、当技術分野で既知のプロセスによって、かつ/または参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2012094304号に記載のプロセスによって形成され得る。少なくとも1つのポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2012094304号に記載のプロセスによって、少なくとも1つのロゼットナノチューブに付着および/または結合されてもよく、ここでロゼットナノチューブまたはロゼットナノチューブを形成するモジュールは、水性媒体中で、少なくとも1つのポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAがロゼットナノチューブに付着または結合するようになり得る条件下で、少なくとも1つのポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAと混合される。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、少なくとも1つのカーボンナノチューブに付着および/または結合されてもよい。非限定的な例として、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、連結剤に結合されてもよく、この連結された薬剤が、カーボンナノチューブに結合されてもよい(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,246,995号を参照のこと)。カーボンナノチューブは、単層ナノチューブであってもよい(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,246,995号を参照のこと)。
複合体 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、担体もしくは標的化基に共有結合された、または一緒に融合タンパク質を産生する2つのコード領域を含む(例えば、標的化基および治療的タンパク質またはペプチドを担持する)、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA等の複合体を含む。
本発明の複合体は、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、低比重リポタンパク質(LDL)、高比重リポタンパク質(HDL)、またはグロブリン)、炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸)、または脂質等の、天然に生じる物質を含む。リガンドは、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド(例えば、アプタマー)等の組換えまたは合成分子であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリアミノ酸は、ポリリジン(PLL)、ポリL−アスパラギン酸、ポリL−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ(L−ラクチド−co−グリコリド(glycolied))コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン無水物コポリマー、N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(HMPA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリウレタン、ポリ(2−エチルアクリル(acryllic)酸)、N−イソプロピルacrylアミドポリマー、またはポリホスファゼン(polyphosphazine)が挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン(PLL)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、αヘリックスペプチドが挙げられる。
ポリヌクレオチド複合体の調製、特にRNAへのの調製を教示する、代表的な米国特許には、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第4,828,979号、同第4,948,882号、同第5,218,105号、同第5,525,465号、同第5,541,313号、同第5,545,730号、同第5,552,538号、同第5,578,717号、5,580,731号、同第5,591,584号、同第5,109,124号、同第5,118,802号、同第5,138,045号、同第5,414,077号、同第5,486,603号、同第5,512,439号、同第5,578,718号、同第5,608,046号、同第4,587,044号、同第4,605,735号、同第4,667,025号、同第4,762,779号、同第4,789,737号、同第4,824,941号、同第4,835,263号、同第4,876,335号、同第4,904,582号、同第4,958,013号、同第5,082,830号、同第5,112,963号、同第5,214,136号、同第5,082,830号、同第5,112,963号、同第5,214,136号、同第5,245,022号、同第5,254,469号、同第5,258,506号、同第5,262,536号、同第5,272,250号、同第5,292,873号、同第5,317,098号、同第5,371,241号、同第5,391,723号、同第5,416,203号、同第5,451,463号、同第5,510,475号、同第5,512,667号、同第5,514,785号、同第5,565,552号、同第5,567,810号、同第5,574,142号、同第5,585,481号、同第5,587,371号、同第5,595,726号、同第5,597,696号、同第5,599,923号、同第5,599,928号および同第5,688,941号、同第6,294,664号、同第6,320,017号、同第6,576,752号、同第6,783,931号、同第6,900,297号、同第7,037,646号が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、本発明の複合体は、本発明の修飾核酸およびmmRNAのための担体として機能し得る。複合体は、ポリ(エチレングリコール)でグラフトされ得る、ポリアミン、ポリリジン、ポリアルキレンイミン、およびポリエチレンイミン等であるが、これらに限定されないカチオン性ポリマーを含んでもよい。非限定的な例として、複合体は、ポリマー複合体と同様であってもよく、ポリマー複合体を合成する方法は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第6,586,524号に記載されている。
複合体は、標的化基、例えば、細胞または組織標的化薬剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば、腎臓細胞等の指定される細胞型に結合する抗体も含み得る。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質A、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、N−アセチル−ガラクトサミン、N−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンB12、ビオチン、RGDペプチド、RGDペプチド模倣体、またはアプタマーであり得る。
標的化基は、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンド(co−ligand)に対する特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞等の指定される細胞型に結合する抗体であり得る。標的化基には、ホルモンおよびホルモン受容体も含まれ得る。それらには、等の脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、N−アセチル−ガラクトサミン、N−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、またはアプタマー等の非ペプチド種も含まれ得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、またはp38 MAPキナーゼの活性化因子であり得る。
標的化基は、具体的な受容体を標的とすることが可能な任意のリガンドであり得る。例としては、制限なく、葉酸塩、GalNAc、ガラクトース、マンノース、マンノース−6P、アプタマー(apatamers)、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、PSMA、エンドセリン、GCPII、ソマトスタチン、LDL、およびHDLリガンドが挙げられる。特定の実施形態において、標的化基は、アプタマーである。アプタマーは、修飾されていないことも、本明細書に開示の修飾の任意の組み合わせを有することもあり得る。
一実施形態において、本発明の薬学的組成物は、ロックト核酸と同様の修飾等であるが、これらに限定されない化学修飾を含んでもよい。
Santarisによるもの等のロックト核酸(LNA)の調製を教示する、代表的な米国特許には、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,268,490号、同第6,670,461号、同第6,794,499号、同第6,998,484号、同第7,053,207号、同第7,084,125号、および同第7,399,845号が含まれるが、これらに限定されない。
PNA化合物の調製を教示する、代表的な米国特許には、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,539,082号、同第5,714,331号、および同第5,719,262号が含まれるが、これらに限定されない。PNA化合物のさらなる教示は、例えば、Nielsen et al.,Science,1991,254,1497−1500において見出すことができる。
本発明の特色をなすいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA、ならびに他の修飾骨格、特に、上に参照される米国特許第5,489,677号の−−CH2−−NH−−CH2−−、−−CH2−−N(CH3)−−O−−CH2−−[メチレン(メチルイミノ)またはMMI骨格として知られている]、−−CH2−−O−−N(CH3)−−CH2−−、−−CH2−−N(CH3)−−N(CH3)−−CH2−−、および−−N(CH3)−−CH2−−CH2−−[式中、天然ホスホジエステル骨格は、−−O-P(O)2−−O−−CH2−−として表される]、および上に参照される米国特許第5,602,240号のアミド骨格を有する、オリゴヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、本明細書の特色をなすポリヌクレオチド(polynucletotides)は、上に参照される米国特許第5,034,506号のモルホリノ骨格構造を有する。
2’位における修飾もまた、送達を補助し得る。好ましくは、2’位における修飾は、ポリペプチドコード配列には位置しない、すなわち、翻訳可能領域にない。2’位における修飾は、5’UTR、3’UTR、および/または尾部領域に位置してもよい。2’位における修飾は、2’位において次のうちの1つを含むことができる:H(すなわち、2’−デオキシ);F;O−、S−、もしくはN−アルキル;O−、S−、もしくはN−アルケニル;O−、S−、もしくはN−アルキニル;またはO−アルキル−O−アルキル(式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換C1〜C10アルキルまたはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルであってもよい。例示の好適な修飾には、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2が含まれ、式中、nおよびmは、1〜約10である。他の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、2’位において次のうちの1つを含む:C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、O−アルカリールもしくはO−アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、薬物動態特性を改善するための基、または薬力学特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。いくつかの実施形態において、修飾は、2’−メトキシエトキシ(2’−O−−CH2CH2OCH3(2’−O−(2−メトキシエチル)または2’−MOE)としても知られている)(Martinet al.,Helv.Chim.Acta,1995,78:486−504)すなわち、アルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示の修飾は、本明細書の以下の実施例に記載の2’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、O(CH2)2ON(CH3)2基(2’−DMAOEとしても知られている)、および同様に本明細書の以下の実施例に記載の2’−ジメチルアミノエトキシ(当技術分野で2’−O−ジメチルアミノエトキシエチルまたは2’−DMAEOEとしても知られる)、すなわち、2’−O−−CH2−−O−−CH2−−N(CH2)2である。他の修飾は、2’−メトキシ(2’−OCH3)、2’−アミノプロポキシ(2’−OCH2CH2CH2NH2)、および2’−フルオロ(2’−F)を含む。同様の修飾は、他の位置、特に3’末端ヌクレオチド上の糖の3’位で、または2’−5’結合dsRNAにおいて、および5’末端ヌクレオチドの5’位で行われてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模倣体を有してもよい。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,981,957号、同第5,118,800号、同第5,319,080号、同第5,359,044号、同第5,393,878号、同第5,446,137号、同第5,466,786号、同第5,514,785号、同第5,519,134号、同第5,567,811号、同第5,576,427号、同第5,591,722号、同第5,597,909号、同第5,610,300号、同第5,627,053号、同第5,639,873号、同第5,646,265号、同第5,658,873号、同第5,670,633号、および同第5,700,920号が含まれるが、これらに限定されない。
依然として他の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、細胞透過性ポリペプチドに共有結合的に複合体化される。細胞透過性ペプチドは、シグナル配列も含み得る。本発明の複合体は、増加した安定性、増加した細胞トランスフェクション、および/または変化した生体分布(例えば、具体的な組織または細胞型に標的を定められる)を有するように設計することができる。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、送達を向上させるための薬剤に複合体化されてもよい。非限定的な例として、薬剤は、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2011062965号に記載の標的化ブロックを有する標的化モノマーまたはポリマー等のモノマーまたはポリマーであってもよい。別の非限定的な例において、薬剤は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに共有結合された輸送剤であってもよい(例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,835.393号および同第7,374,778号を参照のこと)。さらに別の非限定的な例において、薬剤は、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第7,737,108号および同第8,003,129号に記載される薬剤等の膜関門輸送向上剤であってもよい。
別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、SMARTT POLYMER TECHNOLOGY(登録商標)(PHASERX(登録商標),Inc.Seattle,WA)に複合体化されてもよい。
自己集合性ナノ粒子 核酸自己集合性ナノ粒子 自己集合性ナノ粒子は、核酸鎖が容易にリプログラミング可能であり得るように精密に制御され得る、明確に定義されたサイズを有する。例えば、20nm超の直径が、向上した透過性および保持効果により腎クリアランスを回避し、ある特定の腫瘍への送達を向上させるため、癌標的化ナノ送達担体のために最適な粒径は、20〜100nmである。自己集合性核酸ナノ粒子を用いて、向上した送達のために癌標的化リガンドの精密に制御された空間定位および密度を有する、サイズおよび形が均一な単一の集団。非限定的な例として、オリゴヌクレオチドナノ粒子が、短いDNA断片および治療的siRNAのプログラミング可能な自己集合を用いて調製された。これらのナノ粒子は、制御可能な粒径ならびに標的リガンド箇所および密度を有して、分子的に同一である。DNA断片およびsiRNAは、1ステップ反応へと自己集合して、標的を定めたインビボ送達のためにDNA/siRNA四面体ナノ粒子を生成した。(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Lee et al.,Nature Nanotechnology 2012 7:389−393)。
一実施形態において、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、自己集合性ナノ粒子として製剤化され得る。非限定的な例として、核酸を用いて、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAのための送達系に使用され得るナノ粒子を作製してもよい(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012125987号を参照のこと)。
一実施形態において、核酸自己集合性ナノ粒子は、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのコア、およびポリマーシェルを含んでもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、かつ当技術分野で既知のポリマーのうちのいずれかであり得る。さらなる実施形態において、ポリマーシェルを用いて、コアにおけるポリヌクレオチド、一次構築物(contructs)、およびmmRNAを保護してもよい。
ポリマーベースの自己集合性ナノ粒子 ポリマーを用いて、ナノ粒子へと自己集合したシートを形成してもよい。これらのナノ粒子を用いて、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAを送達してもよい。一実施形態において、これらの自己集合性ナノ粒子は、マイクロスポンジへと自己集合する前に結晶質の「ひだ状」のシートを形成するRNAヘアピンの長いポリマーで形成される、マイクロスポンジであってもよい。これらのマイクロスポンジは、効率的な担体として機能し得、積荷を細胞に送達することが可能であり得る、密に充填されたスポンジ様の微粒子である。マイクロスポンジは、直径1μm〜300nmであり得る。マイクロスポンジは、当技術分野で既知の他の薬剤と複合体形成されて、より大きいマイクロスポンジを形成することができる。非限定的な例として、マイクロスポンジは、ポリカチオンポリエチレンイミン(polyethyleneime)(PEI)等の、細胞取り込みを促進するための外側層を形成する薬剤と複合体形成され得る。この複合体は、高温(150℃)で安定したままであり得る、250nm直径の粒子を形成することができる(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Grabow and Jaegar,Nature Materials 2012,11:269−269)。さらにこれらのマイクロスポンジは、リボヌクレアーゼによる分解からの並外れた保護度を示すことが可能であり得る。
別の実施形態において、マイクロスポンジ等であるが、これらに限定されないポリマーベースの自己集合性ナノ粒子は、完全にプログラミング可能なナノ粒子であり得る。ナノ粒子の形状、サイズ、および化学量を、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNA等であるが、これらに限定されない積荷の送達に最適なナノ粒子を作り出すために、精密に制御することができる。
一実施形態において、ポリマーベースのナノ粒子は、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAのコア、ならびにポリマーシェルを含み得る。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、かつ当技術分野で既知のポリマーのうちのいずれかであり得る。さらなる実施形態において、ポリマーシェルを用いて、コアにおけるポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAを保護してもよい。
さらに別の実施形態において、ポリマーベースのナノ粒子は、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2013009736号に記載されるモノマー等の複数の不均一なモノマーを含む非核酸ポリマーを含んでもよい。
無機ナノ粒子 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、無機ナノ粒子中に製剤化されてもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第8,257,745号)。無機ナノ粒子は、水膨潤性である粘土物質を含んでもよいが、これらに限定されない。非限定的な例として、無機ナノ粒子は、単純なケイ酸塩から作製される合成スメクタイト粘土を含んでもよい(例えば、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第5,585,108号および同第8,257,745号を参照のこと)。
一実施形態において、無機ナノ粒子は、本明細書に開示の修飾核酸のコア、およびポリマーシェルを含んでもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、かつ当技術分野で既知のポリマーのうちのいずれかであり得る。さらなる実施形態において、ポリマーシェルを用いて、コアにおける修飾核酸を保護してもよい。
半導性および金属性ナノ粒子 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、半導性または金属性材料を含む水分散性ナノ粒子中に製剤化されるか(参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20120228565号)、または磁性ナノ粒子中に形成されてもよい(各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20120265001号および同第20120283503号)。水分散性ナノ粒子は、疎水性ナノ粒子であっても親水性ナノ粒子であってもよい。
一実施形態において、半導性および/または金属性ナノ粒子は、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAのコア、ならびにポリマーシェルを含んでもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、かつ当技術分野で既知のポリマーのうちのいずれかであり得る。さらなる実施形態において、ポリマーシェルを用いて、コアにおけるポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAを保護してもよい。
ゲルおよびヒドロゲル 一実施形態において、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、対象に注入されるとゲルを形成し得る、当技術分野で既知の任意のヒドロゲル中にカプセル封入されてもよい。ヒドロゲルは、親水性であり、ときには、水が分散媒体であるコロイド状ゲルとして見出される、ポリマー鎖のネットワークである。ヒドロゲルは、高度に吸収性の(それらは、99%超の水を含有することができる)天然または合成ポリマーである。ヒドロゲルは、それらのかなりの含水量のため、天然組織と非常に類似した柔軟度も有する。本明細書に記載のヒドロゲルを用いて、生体適合性、生分解性、かつ/または多孔質である脂質ナノ粒子をカプセル封入してもよい。
非限定的な例として、ヒドロゲルは、アプタマー官能化ヒドロゲルであってもよい。アプタマー官能化ヒドロゲルは、核酸ハイブリダイゼーションを用いて1つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAを放出するようにプログラミングされてもよい。(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Battig et al.,J.Am.Chem.Society.2012 134:12410−12413)。
別の非限定的な例として、ヒドロゲルは、反転オパールとして成形されてもよい。オパールヒドロゲルは、より高い膨潤率を示し、その膨潤速度もまた1桁分より速い。オパールヒドロゲルを生成する方法およびオパールヒドロゲルの説明は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2012148684号に記載されている。
さらに別の非限定的な例において、ヒドロゲルは、抗菌性ヒドロゲルであってもよい。抗細菌性ヒドロゲルは、医薬品等級および/または医療等級の銀塩およびアロエベラゲルもしくは抽出物等であるが、これらに限定されない、薬学的許容される塩または有機材料を含んでもよい。(参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012151438号)。
一実施形態において、修飾mRNAは、脂質ナノ粒子中にカプセル封入されてもよく、次いでこの脂質ナノ粒子が、ヒドロゲル(hyrdogel)中にカプセル封入されてもよい。
一実施形態において、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、当技術分野で既知の任意のゲル中にカプセル封入されてもよい。非限定的な例として、ゲルは、フルオロウラシル注入用ゲル、または当技術分野で既知の化学化合物および/もしくは薬物を含有するフルオロウラシル注入用ゲルであってもよい。別の例として、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、エピネフリンを含有するフルオロウラシルゲル中にカプセル封入されてもよい(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Smith et al.Cancer Chemotherapty and Pharmacology,1999 44(4):267−274を参照のこと)。
一実施形態において、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、またはフィブリン糊中にカプセル封入されてもよい。別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、フィブリンゲル、フィブリンヒドロゲル、またはフィブリン糊中にカプセル封入される前に、脂質ナノ粒子または急速排出脂質ナノ粒子中に製剤化されてもよい。さらに別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、フィブリンゲル、ヒドロゲル、またはフィブリン糊中にカプセル封入される前に、リポプレックスとして製剤化されてもよい。フィブリンゲル、ヒドロゲル、および糊は、2つの構成成分、すなわちフィブリノーゲン溶液およびカルシウムが豊富であるトロンビン溶液を含む(例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Spicer and Mikos,Journal of Controlled Release 2010.148:49−55、Kidd et al.Journal of Controlled Release 2012.157:80−85を参照のこと)。フィブリンゲル、ヒドロゲル、および/または糊の構成成分の濃度は、フィブリンゲル、ヒドロゲル、および/または糊の放出特性を変更すること等であるが、これらに限定されない、ゲル、ヒドロゲル、および/または糊の特性、ネットワークメッシュサイズ、および/または分解特性を変更するように変化させることができる。(例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Spicer and Mikos,Journal of Controlled Release 2010.148:49−55、Kidd et al.Journal of Controlled Release 2012.157:80−85、Catelas et al.Tissue Engineering 2008.14:119−128を参照のこと)。この特長は、本明細書に開示の修飾mRNAを送達するために使用されるときに有利であり得る。(例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Kidd et al.Journal of Controlled Release 2012.157:80−85、Catelas et al.Tissue Engineering 2008.14:119−128を参照のこと)。
カチオンおよびアニオン 本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAの製剤は、カチオンまたはアニオンを含んでもよい。一実施形態において、製剤は、Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mg+、およびこれらの組み合わせ等であるが、これらに限定されない金属カチオンを含む。非限定的な例として、製剤は、ポリマー、ならびに金属カチオンと錯化されたポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAを含んでもよい(例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第6,265,389号および同第6,555,525号を参照のこと)。
成形されたナノ粒子および微粒子 本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、ナノ粒子および/または微粒子中に製剤化されてもよい。これらのナノ粒子および/または微粒子は、任意のサイズ形および化学組成へと成形され得る。例として、ナノ粒子および/または微粒子は、LIQUIDA TECHNOLOGIES(登録商標)(Morrisville,NC)によるPRINT(登録商標)技術を用いて作製することができる(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2007024323号を参照のこと)。
一実施形態において、成形されたナノ粒子は、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAのコア、ならびにポリマーシェルを含んでもよい。ポリマーシェルは、本明細書に記載され、かつ当技術分野で既知のポリマーのうちのいずれかであり得る。さらなる実施形態において、ポリマーシェルを用いて、コアにおけるポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAを保護してもよい。
ナノジャケット(NanoJackets)およびナノリポソーム(NanoLiposomes) 本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、Keystone Nano(State College,PA)によるナノジャケットおよびナノリポソーム中に製剤化されてもよい。ナノジャケットは、体内で自然に見つけられ、カルシウム、リン酸塩を含み、また少量のケイ酸塩も含み得る、化合物で作製される。ナノジャケットは、サイズが5〜50nmの範囲であり得、これを用いて、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNA等であるが、これらに限定されない親水性および疎水性化合物を送達することができる。
ナノリポソームは、体内で天然に生じる脂質等であるが、これらに限定されない脂質で作製される。ナノリポソームは、サイズが60〜80nmの範囲であり得、これを用いて、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNA等であるが、これらに限定されない親水性および疎水性化合物を送達することができる。一態様において、本明細書に開示のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、セラミドナノリポソーム等であるが、これらに限定されないナノリポソーム中に製剤化される。
賦形剤 薬学的製剤は、本明細書で使用されるとき、所望される特定の剤形に適している、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤等を含む、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。参照により全体が本明細書に組み込まれる、Remington’s The Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,A.R.Gennaro(Lippincott,Williams & Wilkins,Baltimore,MD,2006は、薬学的組成物を製剤化するのに使用される種々の賦形剤およびこれらの調製のための既知の技法を開示する。任意の従来の賦形剤媒体が任意の望ましくない生体影響を引き起こすか、またはさもなければ薬学的組成物の任意の他の構成成分(複数可)と有害な様態で相互作用するといった、物質またはその誘導体と不適合性である場合を除いて、その使用が本開示の範囲内で企図される。
いくつかの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%純粋である。いくつかの実施形態において、賦形剤は、ヒトにおける使用および獣医学的使用に対して認可されている。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国食品医薬品局(United States Food and Drug Administration)によって認可されている。いくつかの実施形態において、賦形剤は、医薬品等級である。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国薬局方(United States Pharmacopoeia(USP))、欧州薬局方(European Pharmacopoeia(EP))、英国薬局方(British Pharmacopoeia)、および/または国際薬局方(International Pharmacopoeia)の基準を満たしている。
薬学的組成物の製造に使用される薬学的に許容される賦形剤には、不活性希釈剤、分散化剤および/もしくは造粒剤、界面活性剤および/もしくは乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、滑沢剤、ならびに/または油が含まれるが、これらに限定されない。そのような賦形剤が任意に薬学的組成物中に含まれてもよい。
例示の希釈剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、ショ糖、セルロース、微小結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉糖等、および/またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
例示の造粒剤および/または分散化剤には、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘パルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木質製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ(ビニル−ピロリドン)(クロスポビドン)、ナトリウムカルボキシメチルデンプン(デンプングリコール酸ナトリウム)、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム(クロスカルメロース)、メチルセルロース、α化デンプン(デンプン1500)、微小結晶デンプン、水不溶性デンプン、カルシウムカルボキシメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム(VEEGUM(登録商標))、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物等、ならびに/またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
例示の界面活性剤および/または乳化剤には、天然乳化剤(例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガント、コンドラックス(chondrux)、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン)、コロイド状粘土(例えば、ベントナイト[ケイ酸アルミニウム]およびVEEGUM(登録商標)[ケイ酸アルミニウムマグネシウム])、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール(例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン(triacetin monostearate)、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、およびモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール)、カルボマー(例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー)、カラギーナン、セルロース誘導体(例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末化セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース)、ソルビタン脂肪酸エステル(例えば、モノラウリル酸ポリオキシエチレンソルビタン[TWEEN(登録商標)20]、ポリオキシエチレンソルビタン[TWEENn(登録商標)60]、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン[TWEEN(登録商標)80]、モノパルミチン酸ソルビタン[SPAN(登録商標)40]、モノステアリン酸ソルビタン[SPAN(登録商標)60]、トリステアリン酸ソルビタン[SPAN(登録商標)65]、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン[SPAN(登録商標)80])、ポリオキシエチレンエステル(例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレン[MYRJ(登録商標)45]、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化(polyethoxylated)ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシメチレン、およびSOLUTOL(登録商標))、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル(例えば、CREMOPHOR(登録商標))、ポリオキシエチレンエーテル、(例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル[BRIJ(登録商標)30])、ポリ(ビニル−ピロリドン)、モノラウリル酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、PLUORINC(登録商標)F 68、POLOXAMER(登録商標)188、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウム等、ならびに/またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
例示の結合剤には、デンプン(例えば、トウモロコシデンプンおよびデンプンペースト);ゼラチン;糖類(例えば、ショ糖、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール、);天然および合成ガム(例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュ・モスの抽出物、パンワールガム(panwar gum)、ガッチガム(ghatti gum)、イサポール皮(isapol husk)の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微小結晶セルロース、酢酸セルロース、ポリ(ビニル−ピロリドン)、ケイ酸アルミニウムマグネシウム(Veegum(登録商標))、およびカラマツアラビノガラクタン(larch arabogalactan));アルギン酸塩;ポリエチレンオキシド;ポリエチレングリコール;無機カルシウム塩;ケイ酸;ポリメタクリレート;ワックス;水;アルコール等;ならびにこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
例示の防腐剤には、酸化防止剤、キレート剤、抗菌性防腐剤、抗真菌性防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤、および/または他の防腐剤が含まれ得るが、これらに限定されない。例示の酸化防止剤には、αトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル(ascorbic)、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および/または硫酸ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。例示のキレート剤には、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、および/またはエデト酸三ナトリウムが含まれる。例示の抗菌性防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール(chloroxylenol)、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジ、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および/またはチメロサールが含まれるが、これらに限定されない。例示の抗真菌性防腐剤には、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および/またはソルビン酸が含まれるが、これらに限定されない。例示のアルコール防腐剤には、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール系化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸塩、および/またはフェニルエチルアルコールが含まれるが、これらに限定されない。例示の酸性防腐剤には、ビタミンA、ビタミンC、ビタミンE、β−カロテン、クエン酸、酢酸、ジヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および/またはフィチン酸が含まれるが、これらに限定されない。他の防腐剤には、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム(deteroxime mesylate)、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(hydroxytoluened)(BHT)、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム(SLS)、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム(SLES)、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、GLYDANT PLUS(登録商標)、PHENONIP(登録商標)、メチルパラベン、GERMALL(登録商標)115、GERMABEN(登録商標)II、NEOLONE(商標)、KATHON(商標)、および/またはEUXYL(登録商標)が含まれるが、これらに限定されない。
例示の緩衝剤には、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプチン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、d−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、第二リン酸カリウム、第一リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、二炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱性物質除去水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール等、および/またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
例示の滑沢剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸(behanate)グリセリル、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム等、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
例示の油には、アーモンド油、杏仁油、アボカド油、ババス油、ベルガモット油、ブラックカラント種子油、カデ油、カモミール油、キャノーラ油、キャラウェイ油、カルナウバ油、ヒマシ油、桂皮油、ココアバター油、ココナッツ油、タラの肝油、コーヒー油、トウモロコシ油、綿実油、エミュー油、ユーカリ油、月見草油、魚油、亜麻仁油、ゲラニオール油、ヒョウタン油、ブドウ種子油、ヘーゼルナッツ油、ヒソップ油、ミリスチン酸イソプロピル油、マンゴー種子油、メドウフォーム種子油、ミンク油、ナツメグ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラフィー油、パーム油、パーム核油、桃仁油、ピーナッツ油、ケシ油、カボチャ種子油、菜種油、コメヌカ油、ローズマリー油、ベニバナ油、ビャクダン油、サスクアナ(sasquana)油、セボリー、シーバックソーン油、ゴマ油、シアバター油、シリコーン油、大豆油、ヒマワリ油、ティーツリー油、アザミ油、ツバキ油、ベチバー油、胡桃油、および小麦胚芽油が含まれるが、これらに限定されない。例示の油には、ブチルステアリン酸、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン360、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、および/またはこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
調合者の判断に従って、ココアバターおよび坐剤ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、ならびに/または芳香剤等の賦形剤が、組成物中に存在し得る。
送達 本開示は、薬物送達の科学進展の見込みを考慮した任意の適切な経路による、治療目的、薬学目的、診断目的、または撮像目的のうちのいずれのためのポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの送達をも包含する。送達は、ネイキッドであっても製剤化されてもよい。
ネイキッド送達 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、ネイキッドで細胞に送達されてもよい。本明細書で使用されるとき、「ネイキッド」とは、トランスフェクションを促進する薬剤を用いずにポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを送達することを指す。例えば、細胞に送達されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、修飾を全く含有しない場合がある。ネイキッドポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、細胞に、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載の投与経路を用いて送達されてもよい。
製剤化された送達 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、本明細書に記載の方法を用いて製剤化されてもよい。製剤は、修飾されているかつ/または修飾されていない場合があるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含有してもよい。製剤は、細胞透過剤、薬学的に許容される担体、送達剤、生崩壊性または生体適合性ポリマー、溶媒、および持続放出送達デポーをさらに含むことができるが、これらに限定されない。製剤化されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、細胞に、当技術分野で既知であり、かつ本明細書に記載の投与経路を用いて送達されてもよい。
組成物は、直接浸水または浸漬、カテーテルを介して、ゲル、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、および/または液滴によって、組成物でコーティングまたは含浸された織物または生分解性材料等の基質を使用することによって等を含むが、これらに限定されない当技術分野におけるいくつかの方法のうちのいずれかにおける器官または組織への直接送達のためにも製剤化され得る。
投与 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、治療上有効成果をもたらす任意の経路によって投与されてもよい。これらには、経腸、経胃腸、硬膜外、経口、経皮、硬膜外(硬膜上)、脳内(大脳の中へ)、脳室内(脳室の中へ)、皮膚上(皮膚上への適用)、皮内、(皮膚自体の中へ)、皮下(皮膚の下)、経鼻投与(鼻を介して)、静脈内(静脈の中へ)、動脈内(動脈の中へ)、筋肉内(筋肉の中へ)、心臓内(心臓の中へ)、骨内輸注(骨髄の中へ)、髄腔内(脊柱管の中へ)、腹腔内(腹腔の中への輸注または注入)、膀胱内輸注、硝子体内(眼を介して)、空洞内注入(陰茎基部の中へ)、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮(全身への分布のための無傷の皮膚(intact skin)を介した拡散)、経粘膜(粘膜を介した拡散)、ガス注入(鼻からの吸引)、舌下、口唇下、浣腸、点眼(結膜上に)、または点耳におけるもの含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、組成物は、それらが血液−脳関門、血管関門、または他の上皮関門を横断することを可能にするような方式で投与されてもよい。本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのための非限定的な投与経路が以下に記載される。
非経口および注入による投与 非経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および/またはエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸塩、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(具体的には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル等の可溶化剤および乳化剤、ならびにこれらの混合物等の、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、および/または芳香剤等のアジュバントを含むことができる。非経口投与のためのある特定の実施形態において、組成物は、CREMOPHOR(登録商標)、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および/またはこれらの組み合わせ等の可溶化剤と混合される。
注入用調製物、例えば、滅菌注入用水性または油性懸濁液は、既知の技術に従って、好適な分散化剤、湿潤剤、および/または懸濁化剤を用いて製剤化されてもよい。滅菌注入用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤および/または溶媒中の、滅菌注入用溶液、懸濁液、および/またはエマルション、例えば、1,3−ブタンジオール中の溶液としてのものであってもよい。用いられ得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液、U.S.P.、および等張塩化ナトリウム溶液がある。無刺激の固定油が溶媒または懸濁化媒体として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の無菌性の固定油が用いられ得る。オレイン酸等の脂肪酸が注入物の調製において使用され得る。
注入用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、かつ/または使用前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体中に溶解もしくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。
活性成分の効果を延長するために、皮下または筋肉内注入からの活性成分の吸収を緩徐化することがしばしば望ましい。これは、水への溶解度が低い結晶質または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって遂行されてもよい。薬物の吸収速度は次いで、その溶解速度に依存し、溶解速度が今度は、結晶サイズおよび結晶形に依存し得る。あるいは、非経口的に投与される薬物形態の遅延吸収は、薬物を油性ビヒクル中に溶解させるまたは懸濁させることによって遂行される。注入用デポー形態は、薬物のマイクロカプセルマトリックス(microencapsule matrices)を、ポリラクチド−ポリグリコライド等の生分解性ポリマー中に形成することによって作製される。薬物対ポリマーの比および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ(オルトエステル)およびポリ(無水物)が挙げられる。デポー注入用製剤は、薬物を、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に封入することによって調製される。
直腸および膣内投与 直腸または膣内投与のための組成物は、典型的に坐剤であり、それは組成物を、周囲温度では固体であるが、体温では液体であり、したがって直腸または膣腔で溶解して活性成分を放出する、ココアバター、ポリエチレングリコール、または坐剤ワックス等の好適な非刺激性賦形剤と混合することによって調製することができるる。
経口投与 経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および/またはエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒等、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸塩、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンのポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル等の可溶化剤および乳化剤、ならびにこれらの混合物等の、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、および/または芳香剤等のアジュバントを含むことができる。非経口投与のためのある特定の実施形態において、組成物は、CREMOPHOR(登録商標)、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および/またはこれらの組み合わせ等の可溶化剤と混合される。
経口投与のための固体剤形には、カプセル、錠剤、丸薬、粉剤、および顆粒が含まれる。そのような固体剤形において、活性成分は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム等の少なくとも1つの不活性な薬学的に許容される賦形剤、および/または充填剤もしくは増量剤(例えば、デンプン、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトール、およびケイ酸)、結合剤(例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、ショ糖、およびアカシア)、保水剤(例えば、グリセロール)、崩壊剤(例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム)、溶解遅延剤(solution retarding agents)(例えば、パラフィン)、吸収促進剤(例えば、第四級アンモニウム化合物)、湿潤剤(例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール)、吸収剤(例えば、カオリンおよびベントナイト粘土)、ならびに滑沢剤(例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム)、ならびにこれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤、および丸薬の場合、剤形は、緩衝剤も含んでもよい。
局所または経皮投与 本明細書に記載されるように、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含有する組成物は、局所的な投与のために製剤化されてもよい。皮膚は、それが容易に接触可能であるため、送達に理想的な標的であり得る。遺伝子発現は、皮膚に対してのみ制限され、非特異的な毒性を回避する可能性があるだけでなく、皮内の特定の層および細胞型にも制限され得る。
送達された組成物の皮膚発現の部位は、核酸送達の経路に依存する。次の3つの経路がポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを皮膚へと送達するために考慮される:(i)局所適用(例えば、局所/局部治療および/または美容用途のため)、(ii)経皮注入(例えば、局所/局部治療および/または美容用途のため)、ならびに(iii)全身送達(例えば、皮膚領域および皮膚外領域の両方を侵す皮膚疾患の治療のため)。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、当技術分野で既知のいくつかの異なるアプローチによって皮膚に送達することができる。非カチオン性リポソーム−DNA複合体、カチオン性リポソーム−DNA複合体の局所適用、粒子媒介性(遺伝子銃)、穿刺媒介性遺伝子トランスフェクション、およびウイルス送達アプローチ等であるが、これらに限定されない、ほとんどの局所送達アプローチが、DNAの送達に有効であることが示されている。核酸の送達後に、遺伝子産物が、基底角化細胞、皮脂腺細胞、真皮線維芽細胞、および真皮マクロファージを含むが、これらに限定されない、いくつかの異なる皮膚細胞型において検出されている。
一実施形態において、本発明は、本発明の方法を好都合にかつ/または有効に行うための多様なドレッシング(例えば、創傷ドレッシング)または包帯(例えば、粘着包帯)を提供する。典型的に、ドレッシングまたは包帯は、使用者が対象(複数可)の複数の治療を行うことを可能にするために、本明細書に記載の十分な量の薬学的組成物および/またはポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAを含むことができる。
一実施形態において、本発明は、1回を超える注入で送達されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA組成物を提供する。
一実施形態において、局所および/または経皮投与の前に、皮膚等の少なくとも1つの組織の領域が、透過性を増加させ得るデバイスおよび/または溶液に供されてもよい。一実施形態において、組織は、皮膚の透過性を増加させるために、研磨デバイスに供されてもよい(参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第20080275468号を参照のこと)。別の実施形態において、組織は、超音波強化デバイスに供されてもよい。超音波強化デバイスには、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20040236268号ならびに米国特許第6,491,657号および同第6,234,990号に記載のデバイスが含まれてもよいが、これらに限定されない。組織の透過性を向上させる方法は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20040171980号および同第20040236268号ならびに米国特許第6,190,315号に記載されている。
一実施形態において、デバイスを用いて、本明細書に記載の修飾mRNA製剤を送達する前に組織の透過性を増加させてもよい。皮膚の透過性は、当技術分野で既知の方法、および/または参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第6,190,315号に記載の方法によって測定することができる。非限定的な例として、修飾mRNA製剤は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第6,190,315号に記載の薬物送達方法によって送達されてもよい。
別の非限定的な例において、組織は、透過性を増加させ得るデバイスに組織が供され得る前、その間および/またはその後に、局所麻酔薬の共融混合物(EMLA)クリームで処理されてもよい。Katzら(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Anesth Analg(2004);98:371−76)は、EMLAクリームを低エネルギーと組み合わせて使用して、表在性皮膚鎮痛の発生が低エネルギー超音波での前処理の早くも5分後に見られたことを示した。
一実施形態において、透過性を増加させるために組織が処理される前、その間、および/またはその後に、促進剤が組織に適用されてもよい。促進剤には、輸送促進剤、物理的促進剤、および空洞形成(cavitation)促進剤が含まれるが、これらに限定されない。促進剤の非限定的な例は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第6,190,315号に記載されている。
一実施形態において、デバイスを用いて、免疫応答を呼び起こす物質をさらに含有し得る、本明細書に記載の修飾mRNAの製剤を送達する前に、組織の透過性を増加させてもよい。別の非限定的な例において、免疫応答を呼び起こす物質を含有する製剤は、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20040171980号および同第20040236268号に記載の方法によって送達されてもよい。
組成物の局所および/または経皮投与のための剤形には、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、および/またはパッチが含まれてもよい。一般に、活性成分は、滅菌条件下で、必要とされ得る通りに薬学的に許容される賦形剤ならびに/または任意の必要とされる防腐剤および/もしくは緩衝液と混和される。
さらに、本発明は、経皮パッチの使用を企図し、それはしばしば、身体への化合物の制御送達を提供するという追加の利点を有し得る。そのような剤形は、例えば、化合物を適正な媒体中に溶解させるおよび/または分与することによって、調製することができる。あるいは、またはさらに、速度は、速度制御膜を提供することかつ/または化合物をポリマーマトリックスおよび/もしくはゲル中に分散させることによってのいずれかで制御することができる。
局所投与に好適な製剤には、リニメント剤、ローション等の液体および/もしくは半液体調製物、クリーム、軟膏、および/もしくはペースト等の水中油型および/もしくは油中水型エマルション、ならびに/または溶液および/もしくは懸濁液が含まれるが、これらに限定されない。
局所的に投与可能な製剤は、例えば、約0.1w/w%〜約10w/w%の活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、最大で溶媒中の活性成分の可溶性の限度まで高くてもよい。局所投与のための製剤は、本明細書に記載のさらなる成分のうちの1つ以上をさらに含んでもよい。
デポー投与 本明細書に記載されるように、いくつかの実施形態において、組成物は、持続放出のためのデポー中に製剤化される。一般に、具体的な器官または組織(「標的組織」)が、投与のための標的とされる。
本発明のいくつかの態様において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、標的組織内またはその近位で空間的に保持される。標的組織(1つ以上の標的細胞を含有する)を組成物と、組成物、特に組成物の核酸構成成分(複数可)が標的組織内に実質的に保持される、つまり、組成物の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99、または99.99%超が標的組織内に保持されるような条件下で接触させることによって、組成物を哺乳類対象の標的組織に提供する方法が提供される。有利なことに、保持は、1つ以上の標的細胞に進入する、組成物中に存在する核酸の量を測定することによって決定される。例えば、投与の一定期間後に、対象に投与される核酸の少なくとも1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99、または99.99%超が、細胞内に存在する。例えば、哺乳類対象への筋肉内注入が、リボ核酸およびトランスフェクション試薬を含有する水性組成物を用いて行われ、組成物の保持は、筋肉細胞内に存在するリボ核酸の量を測定することによって決定される。
本発明の態様は、標的組織(1つ以上の標的細胞を含有する)を組成物と、組成物が標的組織内に実質的に保持されるような条件下で接触させることによって、組成物を哺乳類対象の標的組織に提供する方法を対象とする。組成物は、目的とするポリペプチドが少なくとも1つの標的細胞内で産生されるように、有効量のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含有する。組成物は一般に、細胞透過剤、および薬学的に許容される担体を含有するが、「ネイキッド」核酸(細胞透過剤または他の薬剤を含まない核酸等)もまた企図される。
いくつかの状況において、組織内の細胞によって産生されるタンパク質の量は、望ましくは増加される。好ましくは、タンパク質産生のこの増加は、標的組織内の細胞に空間的に制限される。したがって、哺乳類対象の組織内における目的とするタンパク質の産生を増加させる方法が提供される。標的組織の既定体積内に含有される細胞の実質的な割合(%)において目的とするポリペプチドを産生するように組成物の単位量が決定されていることで特徴付けられる、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含有する組成物が提供される。
いくつかの実施形態において、組成物は、複数の異なるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含み、このポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのうちの1つ以上が目的とするポリペプチドをコードする。任意に、組成物は、組成物の細胞内送達を補助するための細胞透過剤も含有する。標的組織の既定体積内に含有される細胞のかなりの割合(%)において目的とするポリペプチドを産生する(一般に、既定体積に隣接した、または標的組織に遠位の組織において、目的とするポリペプチドの大幅な産生を誘導することなく)のに必要とされる組成物の用量の決定が行われる。この決定に次いで、決定された用量が哺乳類対象の組織に直接導入される。
一実施形態において、本発明は、1回を超える注入でまたは分割用量注入によって送達される対象となるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを提供する。
一実施形態において、本発明は、小型の使い捨て薬物リザーバ、パッチポンプ、または浸透圧ポンプを用いて、標的組織の付近で保持されてもよい。パッチポンプの非限定的な例としては、BD(登録商標)(Franklin Lakes,NJ)、Insulet Corporation(Bedford,MA)、SteadyMed Therapeutics(San Francisco,CA)、Medtronic(Minneapolis,MN)(例えば、MiniMed)、UniLife(York,PA)、Valeritas(Bridgewater,NJ)、およびSpringLeaf Therapeutics(Boston,MA)によって製造および/または販売されるものが挙げられる。浸透圧ポンプの非限定的な例としては、DURECT(登録商標)(Cupertino,CA)(例えば、DUROS(登録商標)およびALZET(登録商標))によって製造されるものが挙げられる。
肺投与 薬学的組成物は、口腔を介した肺投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ/または販売されてもよい。そのような製剤は、活性成分を含み、かつ約0.5nm〜約7nmまたは約1nm〜約6nmの範囲の直径を有する、乾燥粒子を含んでもよい。そのような組成物は、好適には、噴射剤の流れが粉末を分散するようにそこに向けられ得る乾燥粉末リザーバを含むデバイスを用い、かつ/または密封容器中の低沸点噴射剤中に溶解および/もしくは懸濁させた活性成分を含むデバイス等の自己噴射溶媒/粉末分与容器を用いた投与のために、乾燥粉末の形態にある。そのような粉末は、粒子の少なくとも98重量%が0.5nm超の直径を有し、粒子の少なくとも95%(数量)が7nm未満の直径を有する、粒子を含む。あるいは、粒子の少なくとも95重量%は、1nm超の直径を有し、粒子の少なくとも90%(数量)は、6nm未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖等の固体微粉末希釈剤を含んでもよく、それは単位用量形態で好都合に提供される。
低沸点噴射剤には一般に、大気圧で65°F(約18.3℃)を下回る融点を有する液体噴射剤が含まれる。一般に、噴射剤は、組成物の50w/wv%〜99.9w/wv%を構成し得、活性成分は、組成物の0.1w/w%〜20w/w%を構成し得る。噴射剤は、液体非イオン性および/もしくは固体アニオン性界面活性剤ならびに/または固体希釈剤(活性成分を含む粒子と同じ規模の粒径を有し得る)等のさらなる成分をさらに含んでもよい。
非限定的な例として、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第8,257,685号に記載の方法によって肺送達のために製剤化されてもよい。
肺送達のために製剤化される薬学的組成物は、溶液および/または懸濁液の液滴の形態で活性成分を提供してもよい。そのような製剤は、任意に滅菌された、活性成分を含む、水性および/または希釈アルコール溶液および/または懸濁液として調製され、パッケージ化され、かつ/または販売されてもよく、好都合に、任意の噴霧および/または微粒化デバイスを用いて投与され得る。そのような製剤は、サッカリンナトリウム等の香味剤、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、および/または安息香酸メチルヒドロキシ等の防腐剤を含むが、これらに限定されない1つ以上のさらなる成分をさらに含んでもよい。この投与経路によって提供される液滴は、約0.1nm〜約200nmの範囲の平均直径を有し得る。
鼻腔内、経鼻、および頬側投与 肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、薬学的組成物の鼻腔内送達に有用である。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約0.2μm〜500μmの平均粒子を有する、粗粉である。そのような製剤は、鼻からの吸入が行われる様態で、すなわち、鼻に近接して保持された粉末の容器からの鼻孔を通じた急速な吸入によって、投与される。
経鼻投与に好適な製剤は、例えば、最少約0.1w/w%〜最大100w/wv%の活性成分を含んでもよく、本明細書に記載のさらなる成分のうちの1つ以上を含んでもよい。薬学的組成物は、頬側投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ/または販売されてもよい。そのような製剤は、例えば、従来の方法を用いて作製される錠剤および/またはロゼンジの形態にあってもよく、また、例えば、0.1w/w%〜20w/w%の活性成分であってもよく、残りが経口的に溶解性および/または分解性の組成物、ならびに任意に、本明細書に記載のさらなる成分のうちの1つ以上を含む。代わりに、頬側投与に好適な製剤は、活性成分を含む、粉末ならびに/またはエアロゾル化および/もしくは微粒化溶液および/もしくは懸濁液を含んでもよい。そのような粉末化、エアロゾル化、および/またはエアロゾル化製剤は、分散されるとき、約0.1nm〜約200nmの範囲の平均粒径および/または液滴径を有し得、本明細書に記載の任意のさらなる成分のうちの1つ以上をさらに含んでもよい。
眼内投与 薬学的組成物は、眼内投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ/または販売されてもよい。そのような製剤は、例えば、水性または油性液体賦形剤中に、例えば、0.1/1.0w/w%の活性成分の溶液および/または懸濁液を含む、点眼の形態にあってもよい。そのような液滴は、緩衝剤、塩、および/または本明細書に記載の任意のさらなる成分のうちのもう1つ以上をさらに含んでもよい。有用である他の眼内投与可能な製剤には、微小結晶形態でおよび/またはリポソーム調製物中に活性成分を含むものが含まれる。点耳および/または点眼は、本発明の範囲内にあるものとして企図される。眼および/または包囲組織への送達のために、多層薄膜デバイスが、薬学的組成物を含有するように調製されてもよい。
ペイロード投与:検出可能な薬剤および治療剤 本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、物質(「ペイロード」)の生体標的への送達、例えば、標的の検出のための検出可能な物質の送達、または治療剤の送達が所望される、いくつかの異なるシナリオにおいて使用することができる。検出方法には、インビトロ画像法およびインビボ画像法の両方、例えば、免疫組織化学、生物発光画像法(BLI)、磁気共鳴画像法(MRI)、ポジトロン放出断層撮影法(PET)、電子顕微鏡法、X線コンピュータ断層撮影法、ラマン画像法、光干渉断層撮影法、吸収画像法、熱画像法、蛍光反射画像法、蛍光顕微鏡法、蛍光分子トモグラフィー画像法、核磁気共鳴画像法、X線画像法、超音波画像法、光音響画像法、研究室アッセイ、またはタギング/染色/画像法が必要とされる任意の状況における方法が含まれ得るが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、任意の有用な定位でリンカーおよびペイロードの両方を含むように設計することができる。例えば、2つの末端を有するリンカーを用いて、デアザ−アデノシンもしくはデアザ−グアノシンのC−7もしくはC−8位において、またはシトシンもしくはウラシルのN−3もしくはC−5位に等、一方の末端がペイロードに、および他方の末端が核酸塩基に結合される。本発明のポリヌクレオチドは、1つを超えるペイロード(例えば、標識および転写阻害剤)、ならびに切断可能リンカーを含むことができる。一実施形態において、修飾ヌクレオチドは、切断可能リンカーの一方の末端が7−デアザ−アデニンのC7位に結合され、リンカーの他方の末端が阻害剤(例えば、シチジン上の核酸塩基のC5位)に結合され、標識(例えば、Cy5)がリンカーの中心に結合される、修飾7−デアザ−アデノシン三リン酸塩である(例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,994,304号の図5におけるA*pCp C5 Parg Caplessの化合物1ならびに第9および10欄を参照のこと)。修飾7−デアザ−アデノシン三リン酸塩がコード領域へと組み込まれると、結果として生じる切断可能リンカーを有するポリヌクレオチドは、標識および阻害剤(例えば、ポリメラーゼ阻害剤)に結合される。リンカーが切断されると(例えば、切断可能ジスルフィド部分を有するリンカーを還元するための還元条件により)、標識および阻害剤が放出される。さらなるリンカーおよびペイロード(例えば、治療剤、検出可能な標識、および細胞透過性ペイロード)が本明細書に記載される。
下記のスキーム12は、核酸塩基であるアデニンが7−デアザアデニンのC−7炭素においてリンカーに結合される、例示の修飾ヌクレオチドを描写する。さらに、スキーム12は、リンカーおよびペイロード、例えば、検出可能な薬剤がmRNAの3’末端上に組み込まれた、修飾ヌクレオチドを描写する。ジスルフィド切断およびプロパルギルエステル上へのチオール基の1,2−付加により、検出可能な薬剤が放出される。残りの構造(例えば、スキーム12におけるpApC5Pargとして描写される)は、阻害剤である。修飾ヌクレオチドの構造に対する理論的根拠は、係留された阻害剤が、第2の塩基を組み込むポリメラーゼの能力を立体的に干渉することである。したがって、係留物がこの機能に影響を及ぼすのに十分に長いこと、および阻害剤(inhibiter)が、第2かつ後続のヌクレオチドが伸長しているポリヌクレオチド鎖へと加わることを阻害するまたは禁止する立体化学的定位にあることが必要不可欠である。 スキーム12
例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、人工多能性幹細胞(iPS細胞)を再プログラミングするのに使用することができ、それによりクラスター中の総細胞と比較して、トランスフェクトされる細胞を直接追跡することができる。別の例において、リンカーを介してポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに結合され得、また蛍光標識され得る薬物を用いて、薬物をインビボで、例えば、細胞内で追跡することができる。他の例としては、細胞内への可逆的な薬物送達におけるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの使用が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、ペイロード、例えば、検出可能な薬剤または治療剤の、特定の細胞小器官への細胞内標的化において使用することができる。例示の細胞内標的には、高度なmRNAプロセシングのための核局在化、または阻害剤を含有するmRNAに連結された核局在化配列(NLS)が含まれ得るが、これらに限定されない。
さらに、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを用いて、例えば、生存動物において、治療剤を細胞または組織に送達することができる。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを用いて、癌細胞を死滅させるために高極性化学療法剤を送達することができる。リンカーを介して治療剤に結合されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、部材の透過を容易にすることにより、治療剤が細胞内に移動して細胞内標的に到達することを可能にし得る。
一例において、リンカーは、リボース環の2’位においてならびに/またはポリヌクレオチド、一次構築物mmRNAの3’および/もしくは5’位において結合される(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012030683号を参照のこと)。リンカーは、本明細書に開示され、当技術分野で既知であり、かつ/または参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2012030683号に開示の任意のリンカーであってもよい。
別の例において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、切断可能リンカーを介してポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAウイルス阻害性ペプチド(VIP)に結合され得る。切断可能リンカーは、VIPおよび色素を細胞内に放出することができる。別の例において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、リンカーを介して、コレラ毒素、ジフテリア毒素、および百日咳毒素等のいくつかの細菌毒素の作用に関与する、ADP−リボシレートに結合され得る。これらの毒素タンパク質は、ヒト細胞において標的タンパク質を修飾するADP−リボシルトランスフェラーゼである。例えば、コレラ毒素ADP−リボシレートGタンパク質は、致命的な下痢をもたらす、小腸の内壁からの大量の体液分泌を引き起こすことによって、ヒト細胞を変性させる。
いくつかの実施形態において、ペイロードは、細胞毒、放射性イオン、化学療法剤、または他の治療剤等の治療剤であってもよい。細胞毒または細胞傷害性薬剤には、細胞に有害であり得るいずれの薬剤も含まれる。例としては、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン(dihydroxyanthracinedione)、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン(dehydrotestosterone)、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、マイタンシノイド、例えば、マイタンシノール(参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第5,208,020号)、ラケルマイシン(CC−1065、すべてが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,475,092号、同第5,585,499号、および同第5,846,545号を参照のこと)、ならびにこれらの類似体または相同体が挙げられるが、これらに限定されない。放射性イオンには、ヨウ素(例えば、ヨウ素125またはヨウ素131)、ストロンチウム89、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、リン酸塩、コバルト、イットリウム90、サマリウム153、およびプラセオジミウムが含まれるが、これらに限定されない。他の治療剤には、代謝拮抗薬(例えば、メトトレキサート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フルオロウラシルダカルバジン(decarbazine))、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、ラケルマイシン(CC−1065)、メルファラン、カルムスチン(BSNU)、ロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびcis−ジクロロジアミン白金(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(かつてはダウノマイシン)およびdオキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(かつてはアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、および抗有糸分裂剤(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、およびマイタンシノイド)が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ペイロードは、種々の有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素もしくは酵素基質、蛍光物質、発光物質(例えば、ルミノール)、生物発光物質(例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびイクオリン)、化学発光物質、放射性物質(例えば、18F、67Ga、81mKr、82Rb、111In、123I、133Xe、201Tl、125I、35S、14C、3H、またはr99mTc(例えば、過テクネチウム酸塩(テクネチウム酸塩(VII)、TcO4−として)、および造影剤(例えば、金(例えば、金ナノ粒子)、ガドリニウム(例えば、キレート化Gd)、酸化鉄(例えば、超常磁性酸化鉄(SPIO)、単結晶酸化鉄ナノ粒子(MION)、および極小超常磁性酸化鉄(USPIO)、マンガンキレート(例えば、Mn−DPDP)、硫酸バリウム、ヨード系造影剤媒体(イオヘキソール(Iohexol))、微小気泡、またはペルフルオロ炭素)等の検出可能な薬剤であり得る。そのような光検出可能な標識には、例えば、制限なく、4−アセトアミド−4’−イソチオシアン酸スチルベン−2,2’ジスルホン酸;アクリジンおよび誘導体(例えば、アクリジンおよびアクリジンイソチオシアネート);5−(2’−アミノエチル)アミノナフタレン−1−スルホン酸(EDANS);4−アミノ−N−[3−ビニルスルホニル)フェニル]ナフタルイミド−3,5ジスルホン酸塩;N−(4−アニリノ−1−ナフチル)マレイミド;アントラニルアミド;BODIPY;ブリリアントイエロー;クマリンおよび誘導体(例えば、クマリン、7−アミノ−4−メチルクマリン(AMC、クマリン120)、および7−アミノ−4−トリフルオロメチルクマリン(クマリン151);シアニン色素;シアノシン;4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI);5’5”−ジブロモピロガロール−スルホナフタレン(naphthalein)(ブロモピロガロールレッド);7−ジエチルアミノ−3−(4’−イソチオシアン酸フェニル)−4−メチルクマリン;ジエチレントリアミン五酢酸塩;4,4’−ジイソチオシアン酸ジヒドロ−スチルベン−2,2’−ジスルホン酸;4,4’−ジイソチオシアン酸スチルベン−2,2’−ジスルホン酸;5−[ジメチルアミノ]−ナフタレン−1−スルホニルクロリド(DNS、ダンシルクロリド);4−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−4’−イソチオシアネート(DABITC);エオシンおよび誘導体(例えば、エオシンおよびエオシンイソチオシアネート);エリスロシンおよび誘導体(例えば、エリスロシンBおよびエリスロシンイソチオシアネート);エチジウム;フルオロセインおよび誘導体(例えば、5−カルボキシフルオロセイン(FAM)、5−(4,6−ジクロロトリアジン−2−イル)アミノフルオロセイン(DTAF)、2’,7’−ジメトキシ−4’5’−ジクロロ−6−カルボキシフルオロセイン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、X−ローダミン−5−(および−6)−イソチオシアネート(QFITCまたはXRITC)、およびフルオレスカミン);2−[2−[3−[[1,3−ジヒドロ−1,1−ジメチル−3−(3−スルホプロピル)−2H−ベンズ[e]インドール−2−イリデン]エチリデン]−2−[4−(エトキシカルボニル)−1−ピペラジニル]−1−シクロペンテン−1−イル]エテニル]−1,1−ジメチル−3−(3−スルホプロピル(sulforpropyl))−1H−ベンズ[e]インドリウム水酸化物、分子内塩、n,n−ジエチルエタンアミン(1:1)(IR144)との化合物;5−クロロ−2−[2−[3−[(5−クロロ−3−エチル−2(3H)−ベンゾチアゾール−イリデン)エチリデン]−2−(ジフェニルアミノ)−1−シクロペンテン−1−イル]エテニル]−3−エチルベンゾチアゾリウム過塩素酸塩(IR140);マラカイトグリーンイソチオシアネート;4−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン;ニトロチロシン;パラローザニリン;フェノールレッド;B−フィコエリトリン;o−フタルジアルデヒド;ピレンおよび誘導体(例えば、ピレン、酪酸ピレン、およびスクシンイミジル1−ピレン);酪酸塩量子ドット;リアクティブレッド4(CIBACRON(商標)ブリリアントレッド3B−A);ローダミンおよび誘導体(例えば、6−カルボキシ−X−ローダミン(ROX)、6−カルボキシローダミン(R6G)、リサミンローダミンBスルホニルクロリドローダミン(rhodarnine)(Rhod)、ローダミンB、ローダミン123、ローダミンXイソチオシアネート、スルホローダミンB、スルホローダミン101、スルホローダミン101のスルホニルクロリド誘導体(テキサスレッド)、N,N,N’,N’テトラメチル−6−カルボキシローダミン(TAMRA)テトラメチルローダミン、およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC);リボフラビン;ロゾール酸;テルビウムキレート誘導体;シアニン−3(Cy3);シアニン−5(Cy5);シアニン−5.5(Cy5.5)、シアニン−7(Cy7);IRD 700;IRD 800;Alexa 647;La Jolta Blue;フタロシアニン;ならびにナフタロシアニンが含まれる。
いくつかの実施形態において、検出可能な薬剤は、活性化されると検出可能となる、検出不可能な前駆体(例えば、蛍光発生テトラジン−フルオロフォア構築物(例えば、テトラジン−BODIPY FL、テトラジン−オレゴングリーン488、またはテトラジン−BODIPY TMR−X)、または酵素により活性化可能な蛍光発生剤(例えば、PROSENSE(登録商標)(VisEn Medical))であってもよい。酵素標識組成物が使用され得るインビトロアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光法、酵素免疫アッセイ(EIA)、放射免疫アッセイ(RIA)、およびウエスタンブロット分析が含まれるが、これらに限定されない。
組み合わせ ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、1つ以上の他の治療剤、予防剤、診断剤、または撮像剤と組み合わせて使用されてもよい。「と組み合わせて」とは、薬剤が同時に投与されるかつ/または一緒に送達するために製剤化される必要があることを暗示するようには意図さないが、これらの送達方法は、本開示の範囲内にある。組成物は、1つ以上の他の所望の治療薬または医療処置と並行して、その前に、またはその後に投与することができる。一般に、各薬剤は、その薬剤のために決定された用量でおよび/または時間スケジュールに基づいて投与されるであろう。いくつかの実施形態において、本開示は、薬学的、予防的、診断的、または撮像組成物を、それらの生体利用能を改善し、それらの代謝を低減および/もしくは修飾し、それらの排泄を阻害し、かつ/またはそれらの体内分布を修飾し得る薬剤と組み合わせて、送達することを包含する。非限定的な例として、核酸またはmmRNAは、癌の治療のためまたは過剰増殖性細胞を制御するための医薬品と組み合わせて使用されてもよい。参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第7,964,571号において、リポポリマーとともにインターロイキン−12をコードするDNAプラスミドを含む薬学的組成物を使用し、また少なくとも1つの抗癌剤または化学療法剤を投与する、原発性または転移性固形腫瘍の治療のための併用療法が記載される。さらに、抗増殖性分子をコードする本発明の核酸およびmmRNAは、リポポリマーとともに薬学的組成物中にあってもよい(例えば、抗増殖性分子をコードするDNAプラスミドおよびリポポリマーを含む薬学的組成物を特許請求する、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20110218231号を参照のこと)、それは少なくとも1つの化学療法剤または抗癌剤とともに投与され得る。
組み合わせて利用される治療上、予防上、診断上、または撮像活性剤は、単一の組成物中で一緒に投与されても、異なる組成物中で別個に投与されもよいことがさらに理解されよう。一般に、組み合わせて利用される薬剤は、それらが個々に利用されるレベルを超えないレベルで利用されることが予想される。いくつかの実施形態において、組み合わせて利用されるレベルは、個々に利用されるレベルよりも低いであろう。一実施形態において、組み合わせは、各々または一緒に、本明細書に記載の分割投薬レジメンに従って投与されてもよい。
投薬 本発明は、本発明に従う修飾mRNAおよびそれらのコードされたタンパク質または複合体をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。核酸、タンパク質、もしくは複合体、またはその薬学的、画像化、診断的、もしくは予防的組成物は、疾患、障害、および/または状態(例えば、記憶障害の取り組みに関連した疾患、障害、および/または状態)の予防、治療、診断、または画像化に有効な任意の量および任意の投与経路を用いて対象に投与することができる。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方法、その活性方法等に応じて、対象によって異なる。本発明に従う組成物は、投与を容易にし、かつ投薬量を均一にするために、典型的には、単位剤形で製剤化される。しかしながら、本発明の組成物の総1日使用量は、適切な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されてもよいことが理解される。任意の特定の患者の特定の治療上有効、予防上有効、または適切な画像化用量レベルは、治療される障害および障害の重症度;用いられる特定の化合物の活性;用いられる特定の組成物;患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および食生活;投与時間、投与経路、および用いられる特定の化合物の排泄速度;治療の持続期間;用いられる特定の化合物と組み合わせて、またはそれと同時に使用される薬物;医学分野で周知の要素等を含む様々な要素に依存する。
ある特定の実施形態において、本発明に従う組成物は、所望の治療的、診断的、予防的、または画像効果を得るために、1日当たり約0.0001mg/kg〜約100mg/kg、約0.001mg/kg〜約0.05mg/kg、約0.005mg/kg〜約0.05mg/kg、約0.001mg/kg〜約0.005mg/kg、約0.05mg/kg〜約0.5mg/kg、約0.01mg/kg〜約50mg/kg、約0.1mg/kg〜約40mg/kg、約0.5mg/kg〜約30mg/kg、約0.01mg/kg〜約10mg/kg、約0.1mg/kg〜約10mg/kg、または約1mg/kg〜約25mg/kg(対象の体重)を1日1回以上送達するのに十分な投薬量レベルで投与され得る。所望の投薬量は、1日3回、1日2回、1日1回、1日おきに、2日おきに、週1回、2週間に1回、3週間に1回、または4週間に1回送達されてもよい。ある特定の実施形態において、所望の投薬量は、複数回の投与(例えば、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、11回、12回、13回、14回以上の投与)によって送達されてもよい。複数回の投与が用いられるとき、本明細書に記載の分割投薬レジメン等の分割投薬レジメンが使用され得る。
本発明に従って、分割用量レジメンでのmmRNAの投与が哺乳類対象においてより高いレベルのタンパク質を産生することが見出されている。本明細書で使用されるとき、「分割用量」とは、単回単位用量または総1日用量の2つ以上の用量、例えば、単回単位用量の2回以上の投与への分割である。本明細書で使用されるとき、「単回単位用量」とは、1回用量で/一度に/単一経路で/単一接触点で、すなわち、単回投与事象で投与される任意の治療薬の用量である。本明細書で使用されるとき、「総1日用量」は、24時間内に所与または処方される量である。これは、単回単位用量として投与されてもよい。一実施形態において、本発明のmmRNAは、分割用量で対象に投与される。mmRNAは、緩衝液のみまたは本明細書に記載の製剤中で製剤化されてもよい。
剤形 本明細書に記載の薬学的組成物は、局所、鼻腔内、気管内、または注入用(例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、心臓内、腹腔内、皮下)等の本明細書に記載の剤形に製剤化され得る。
液体剤形 非経口投与用の液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および/またはエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、液体剤形は、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油(具体的には、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ソルビタンポリエチレングリコールおよび脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含むが、これらに限定されない当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含んでもよい。非経口投与についてのある特定の実施形態において、組成物は、可溶化剤、例えば、CREMOPHOR(登録商標)、アルコール、油、修飾油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および/またはこれらの組み合わせと混合されてもよい。
注入物 注入用調製物、例えば、滅菌注入用水性または油性懸濁液は、既知の技術に従って製剤化されてもよく、好適な分散化剤、湿潤剤、および/または懸濁化剤を含んでもよい。滅菌注入用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤および/または溶媒、例えば、1,3−ブタンジオール溶液中の滅菌注入用溶液、懸濁液、および/またはエマルションであり得る。用いられ得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、U.S.P.、および等張性塩化ナトリウム溶液が含まれるが、これらに限定されない。無刺激固定油が溶媒または懸濁化媒体として慣習的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激固定油が用いられ得る。オレイン酸等の脂肪酸が注入物の調製において使用され得る。注入用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、かつ/または使用前に滅菌剤を滅菌水または他の滅菌注入用媒体中に溶解もしくは分散され得る滅菌固体組成物の形態で組み込むことによって滅菌され得る。長活性成分の効果を長引かせるために、皮下または筋肉内注入からの活性成分の吸収を遅延させることが所望され得る。これは、水への溶解度が低い結晶質または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって遂行されてもよい。その後、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの吸収速度は、その溶解速度に依存し、次いで、結晶の大きさおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの遅延吸収は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを油ビヒクル中に溶解または懸濁させることによって遂行され得る。注入用デポー形態は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのマイクロカプセルマトリックスを、ポリラクチド−ポリグリコリド等の生分解性ポリマー中に形成することによって作製される。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAとポリマーとの比率、および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの放出速度を調節することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ(オルトエステル)およびポリ(無水物)が挙げられるが、これらに限定されない。デポー注入用製剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に封入することによって調製されてもよい。
肺 肺送達に有用であるとして本明細書に記載される製剤は、薬学的組成物の鼻腔内送達にも使用され得る。鼻腔内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、約0.2μm〜500μmの平均粒子を有する粗粉であってもよい。そのような製剤は、鼻からの吸入が行われる様態で、すなわち鼻に近接して保持された粉末の容器からの鼻孔を通じた急速な吸入によって投与されてもよい。
経鼻投与に好適な製剤は、例えば、最少約0.1w/w%〜最大100w/w%の活性成分を含んでもよく、本明細書に記載のさらなる成分のうちの1つ以上を含んでもよい。薬学的組成物は、頬側投与に好適な製剤中に調製され、パッケージ化され、かつ/または販売されてもよい。そのような製剤は、例えば、従来の方法を用いて作製される錠剤および/またはロゼンジの形態であってもよく、例えば、約0.1w/w%〜20w/w%の活性成分を含有してもよく、この平衡物は、経口溶解性および/または分解性組成物と、任意に、本明細書に記載のさらなる成分のうちの1つ以上とを含んでもよい。代わりに、頬側投与に好適な製剤は、活性成分を含む、粉末ならびに/またはエアロゾル化および/もしくは微粒化溶液および/もしくは懸濁液を含んでもよい。そのような粉末化、エアロゾル化、および/またはエアロゾル化製剤は、分散されるとき、約0.1nm〜約200nmの範囲の平均粒径および/または液滴径を有し得、本明細書に記載の任意のさらなる成分のうちの1つ以上をさらに含んでもよい。
医薬品の製剤および/または製造における一般の考慮事項は、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Remington:Science and Practice of Pharmacy21sted.,Lippincott Williams & Wilkins,2005において見出され得る。
コーティング剤またはシェル 錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤、および顆粒の固体剤形を、コーティング剤およびシェル、例えば、腸溶性コーティング剤および医薬品製剤化分野で周知の他のコーティング剤で調製することができる。それらは、任意に、乳白剤を含んでもよく、それらが、腸管のある特定の部分において、任意に、遅延様式で、活性成分(複数可)のみを放出するか、またはそれを優先的に放出する組成物であり得る。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。同様の種類の固体組成物は、そのような賦形剤をラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコール等として使用した軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いてもよい。
薬学的組成物の特性 本明細書に記載の薬学的組成物は、生物学的利用能、治療域、および/または分布量のうちの1つ以上によって特徴付けられ得る。
生物学的利用能 ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、本明細書に記載の送達剤で組成物に製剤化されるとき、本明細書に記載の送達剤を欠いた組成物と比較して、生物学的利用能の増加を呈し得る。本明細書で使用されるとき、「生物学的利用能」という用語は、哺乳動物に投与されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの所与の量の全身利用能を指す。生物学的利用能は、化合物を哺乳動物に投与した後に、変化していない形態の化合物の曲線下面積(AUC)または最大血清または血漿濃度(Cmax)を測定することによって評価され得る。AUCは、縦座標(Y軸)に沿った化合物の血清または血漿濃度を横座標(X軸)に沿った時間に対してプロットした曲線下面積の決定である。一般に、特定の化合物のAUCは、当業者に既知の方法、および参照により全体が本明細書に組み込まれるG.S.Banker,Modern Pharmaceutics,Drugs and the Pharmaceutical Sciences,v.72,Marcel Dekker,New York,Inc.,1996に記載の方法を用いて算出され得る。
Cmax値は、化合物を哺乳動物に投与した後に哺乳動物の血清または血漿において達成される化合物の最大濃度である。特定の化合物のCmax値は、当業者に既知の方法を用いて測定され得る。「生物学的利用能の増加」または「薬物動態の改善」という表現は、哺乳動物においてAUC、Cmax、またはCminとして測定された第1のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの全身利用能が、本明細書に記載の送達剤と共投与された場合、本明細書に記載の送達剤との共投与が行われない場合よりも高いことを意味する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの生物学的利用能は、少なくとも約2%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または約100%増加し得る。
治療域 ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、本明細書に記載の送達剤で組成物に製剤化されるとき、本明細書に記載の送達剤を欠いた投与されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA組成物の治療域と比較して、投与されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA組成物の治療域の増加を呈し得る。本明細書で使用されるとき、「治療域」は、治療的効果を誘発する可能性の高い、血漿濃度の範囲、または作用部位における治療上活性物質のレベルの範囲を指す。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの治療域は、本明細書に記載の送達剤と共投与されるとき、少なくとも約2%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または約100%増加し得る。
分布量 ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、本明細書に記載の送達剤で組成物に製剤化されるとき、本明細書に記載の送達剤を欠いた組成物と比較して、分布量(Vdist)の改善、例えば、低減または標的化を呈し得る。分布量(Vdist)は、体内の薬物の量を血液または血漿中の薬物の濃度と関連付ける。本明細書で使用されるとき、「分布量」という用語は、血液または血漿中の濃度と同一の濃度で体内の薬物の総量を含有するよう要求される液量を指し、Vdistは、体内の薬物の量/血液または血漿中の薬物の濃度に等しい。例えば、用量10mgおよび血漿濃度10mg/Lの場合、分布量は、1リットルである。分布量は、薬物が血管外組織に存在する程度を反映する。大量の分布量は、血漿タンパク質結合と比較して組織構成成分に結合する化合物の傾向を反映する。臨床現場において、Vdistを用いて負荷用量を決定し、定常状態濃度を達成することができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの分布量は、本明細書に記載の送達剤と共投与されるとき、少なくとも約2%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%減少し得る。
生物学的効果 一実施形態において、動物に送達される修飾mRNAの生物学的効果は、動物におけるタンパク質発現を分析することによって分類され得る。タンパク質発現は、本発明の修飾mRNAを投与した哺乳動物から収集された生体試料を分析することによって決定され得る。一実施形態において、哺乳動物に投与される修飾mRNAによってコードされた少なくとも50pg/mLの発現タンパク質が好ましくあり得る。例えば、哺乳動物に送達される修飾mRNAによってコードされるタンパク質の50〜200pg/mLの発現タンパク質が、哺乳動物における治療上有効量のタンパク質と見なされ得る。
質量分析による修飾核酸の検出 質量分析(MS)は、分子のイオン変換後の分子の構造質量および分子量/濃度情報を提供することができる分析的技法である。分子は、最初に、イオン化されて正電荷または負電荷を得て、次いで、それらは、質量分析器を通って移動して、それらの質量/電荷(m/z)比に従って検出器の異なる領域に到達する。
質量分析は、分画された試料をイオン化し、かつさらなる分析のために荷電分子を作成するためのイオン源を含む質量分析計を用いて行われる。例えば、試料のイオン化は、エレクトロスプレーイオン化(ESI)、大気圧化学イオン化(APCI)、光イオン化、電子イオン化高速原子衝撃(FAB)/液体二次イオン化(LSIMS)、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー/血漿スプレーイオン化、および粒子ビームイオン化によって実施され得る。当業者であれば、イオン化方法の選択が、測定される分析物、試料の種類、検出器の種類、正モードと負モードの選択等に基づいて決定され得ることを理解する。
試料がイオン化された後、その結果作成される正電荷イオンまたは負電荷イオンが分析されて、質量対電荷比(すなわち、m/z)を決定することができる。質量対電荷比の決定に好適な分析器には、四重極分析器、イオントラップ分析器、および飛行時間分析器が含まれる。イオンは、いくつかの検出モードを用いて検出され得る。例えば、選択されたイオンは、検出され得る(すなわち、選択的イオン監視モード(SIM)を用いて)か、またはあるいは、イオンは、走査モード、例えば、多重反応監視(MRM)もしくは選択反応監視(SRM)を用いて検出され得る。
ペプチド標準物の安定した同位体標識化希釈と連動した液体クロマトグラフィー−多重反応監視(LC−MS/MRM)が、タンパク質の検証に有効な方法であることが示されている(例えば、これらの各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Keshishian et al.,Mol Cell Proteomics 2009 8:2339−2349、Kuhn et al.,Clin Chem 2009 55:1108−1117、Lopez et al.,Clin Chem 2010 56:281−290)。バイオマーカー発見の研究で頻繁に用いられる標的化されていない質量分析とは異なり、標的化されたMS方法は、計器の完全な分析能力を複合体混合物中の何十〜何百もの選択されたペプチドに集中させるMSのペプチド配列に基づくモードである。検出および断片化を目的とするタンパク質に由来するペプチドのみに制限することによって、感受性および再現性は、発見モードのMS方法と比較して劇的に改善される。このタンパク質の質量分析に基づく多重反応監視(MRM)定量化方法は、臨床試料の迅速な標的化された多重化タンパク質発現プロファイリングを介してバイオマーカーの発見および定量化に劇的に影響を与えることができる。
一実施形態において、本発明の少なくとも1つの修飾mRNAによってコードされる少なくとも1つのタンパク質を含有し得る生体試料は、MRM−MS法によって分析され得る。生体試料の定量化は、内部標準物として同位体標識ペプチドまたはタンパク質をさらに含むことができるが、これらに限定されない。
本発明に従って、生体試料は、対象から得られた時点で、酵素消化に供されてもよい。本明細書で使用されるとき、「消化」という用語は、より短いペプチドに分裂することを意味する。本明細書で使用されるとき、「タンパク質を消化するために試料を処理する」という表現は、試料中のタンパク質を解体するような方法で試料を操作することを意味する。これらの酵素には、トリプシン、エンドプロテイナーゼGlu−C、およびキモトリプシンが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、本発明の少なくとも1つの修飾mRNAによってコードされる少なくとも1つのタンパク質を含有し得る生体試料は、酵素を用いて消化され得る。
一実施形態において、本発明の修飾mRNAによってコードされるタンパク質を含有し得る生体試料は、エレクトロスプレーイオン化を用いてタンパク質について分析され得る。エレクトロスプレーイオン化(ESI)質量分析(ESIMS)は、それらが質量分析によって分析される前に溶液から気相へのイオンの移動を支援するために電気的エネルギーを用いる。試料は、当技術分野で既知の方法を用いて分析され得る(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ho et al.,Clin Biochem Rev.2003 24(1):3−12)。溶液に含有されるイオン種は、液滴の微粒スプレーを分散させ、溶媒を蒸発させ、高度に帯電した液滴の噴霧を生成するためにイオンを液滴から排出させることによって気相に移動し得る。高度に帯電した液滴の噴霧は、四重極質量分析器等であるが、これに限定されない、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つの質量分析器を用いて分析され得る。さらに、質量分析法には、精製ステップが含まれ得る。非限定的な例として、第1の四重極は、単一m/z比を選択するように設定されてもよく、従って、異なるm/z比を有する他の分子イオンを濾去することができ、これは、MS分析前に複雑で時間のかかる試料精製手順を排除し得る。
一実施形態において、本発明の修飾mRNAによってコードされるタンパク質を含有し得る生体試料は、タンデムESIMS系(例えば、MS/MS)において、タンパク質について分析され得る。非限定的な例として、液滴は、産物スキャン(もしくは娘スキャン)、前駆体スキャン(親スキャン)、中性損失、または多重反応監視を用いて分析され得る。
一実施形態において、本発明の修飾mRNAによってコードされるタンパク質を含有し得る生体試料は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)質量分析(MALDIMS)を用いて分析され得る。MALDIは、タンパク質等の巨大分子および小分子の両方の非破壊蒸発およびイオン化を提供する。MALDI分析において、分析物は、最初に、紫外線吸収弱有機酸も含み得るが、これに限定されない高モル過剰のマトリックス化合物と共結晶化される。MALDIに用いられるマトリックスの非限定的な例としては、α−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸、3,5−ジメトキシ−4−ヒドロキシ桂皮酸、および2,5−ジヒドロキシ安息香酸がある。分析物−マトリックス混合物のレーザー放射は、マトリックスおよび分析物の蒸発をもたらし得る。レーザー誘起脱離は、無傷の分析物の高イオン収率を提供し、高精度の化合物の測定を可能にする。試料は、当技術分野で既知の方法を用いて分析され得る(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Lewis,Wei and Siuzdak,Encyclopedia of Analytical Chemistry 2000:5880−5894)。非限定的な例として、MALDI分析に用いられる質量分析器には、線形飛行時間(TOF)、TOFリフレクトロン、またはフーリエ変換質量分析器が含まれ得る。
一実施形態において、分析物−マトリックス混合物は、乾燥液滴法を用いて形成され得る。生体試料は、マトリックスと混合されて飽和マトリックス溶液を作成し、マトリックスと試料の比率は、およそ5000:1である。その後、一定分量(およそ0.5〜2.0μL)の飽和マトリックス溶液が、乾燥させられて分析物−マトリックス混合物を形成する。
一実施形態において、分析物−マトリックス混合物は、薄層法を用いて形成され得る。マトリックス均質薄膜が最初に形成され、その後、その試料が適用され、マトリックスによって吸収されて分析物−マトリックス混合物を形成し得る。
一実施形態において、分析物−マトリックス混合物は、厚層法を用いて形成され得る。マトリックス均質薄膜は、ニトロ−セルロースマトリックス添加剤で形成される。均一なニトロ−セルロースマトリックス層が得られた時点で、試料が適用され、マトリックスに吸収されて、分析物−マトリックス混合物を形成する。
一実施形態において、分析物−マトリックス混合物は、サンドイッチ法を用いて形成され得る。マトリックス結晶の薄層が、薄層法にあるように調製され、その後、水性トリフルオロ酢酸、試料、およびマトリックスの液滴が添加される。その後、試料はマトリックスに吸収されて、分析物−マトリックス混合物を形成する。
V.本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAの使用 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、好ましい実施形態において、免疫応答および/もしくは分解経路等の有害な生体応答の回避(avoidance)もしくは回避(evasion)、発現の閾値の克服および/もしくはタンパク質産生能力の改善、改善された発現率もしくは翻訳効率、改善された薬物もしくはタンパク質半減期および/もしくはタンパク質濃度、最適化されたタンパク質局在化を提供して、組織内の安定性および/もしくはクリアランス、受容体による取り込みおよび/もしくは動態、組成物による細胞到達、翻訳機構との関わり、分泌効率(該当する場合)、血液循環への到達可能性、ならびに/または細胞の状態、機能、および/もしくは活性の調節のうちの1つ以上を改善するように設計される。
治療薬 治療剤 本明細書に記載される、修飾核酸および修飾RNA等の本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA、ならびにそれらから翻訳されるタンパク質は、治療剤または予防剤として使用することができる。それらは、医薬において使用するために提供される。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、対象に投与することができ、このポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、インビボで翻訳されて、対象において治療的または予防的ポリペプチドを産生する。ヒトおよび他の哺乳動物における疾患または状態の診断、治療、または予防のための組成物、方法、キット、および試薬が提供される。本発明の活性治療剤は、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNA、ポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAを含有する細胞、またはポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAから翻訳されるポリペプチドを含む。
ある特定の実施形態において、抗体依存性細胞傷害性を誘導するタンパク質とともに、哺乳類対象の免疫性を後押しするタンパク質(単数または複数)をコードする翻訳可能領域を含有する、1つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含有する、組み合わせ治療薬が本明細書に提供される。例えば、トラスツズマブおよび顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)をコードする1つ以上の核酸を含有する治療薬が本明細書に提供される。具体的には、そのような組み合わせ治療薬は、トラスツズマブへの誘導耐性を発達するHer2+乳癌患者において有用である。(例えば、Albrecht,Immunotherapy.2(6):795−8(2010)を参照のこと)。
本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを用いて、細胞集団内で組換えポリペプチドの翻訳を誘導する方法が、本明細書に提供される。そのような翻訳は、インビボ、エクスビボ、培養下、またはインビトロであり得る。細胞集団は、少なくとも1つのヌクレオシド修飾および組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する核酸を含有する有効量の組成物と接触させられる。集団は、核酸が細胞集団の1つ以上の細胞内に局在化され、組換えポリペプチドが細胞内で核酸から翻訳されるような条件下で接触させられる。
組成物の「有効量」は、少なくとも部分的に、標的組織、標的細胞型、投与手段、核酸の物理的特徴(例えば、サイズ、および修飾ヌクレオシドの程度)、および他の決定因子に基づいて提供される。一般に、有効量の組成物は、細胞内での効率的な、好ましくは対応する未修飾核酸を含有する組成物よりも効率的な、タンパク質産生を提供する。増加した効率は、増加した細胞トランスフェクション(すなわち、核酸でトランスフェクトされた細胞の割合(%))、核酸からの増加したタンパク質翻訳、減少した核酸分解(例えば、修飾核酸からのタンパク質翻訳の増加した持続期間によって実証される)、または宿主細胞の低減された自然免疫応答によって実証され得る。
本発明の態様は、必要性のある哺乳類対象において組換えポリペプチドのインビボ翻訳を誘導する方法を対象とする。その中で、少なくとも1つの構造修飾または化学修飾および組換えポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する核酸を含有する、有効量の組成物が、本明細書に記載の送達方法を用いて対象に投与される。核酸は、核酸が対象の細胞内に局在化され、組換えポリペプチドが細胞内で核酸から翻訳されるような量および他の条件下で提供される。核酸が局在化される細胞、または細胞が存在する組織は、1周期以上の核酸投与により標的とされ得る。
ある特定の実施形態において、投与されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞、組織、または生物内で実質的に不在である機能的活性を提供する、1つ以上の組換えポリペプチドの産生を指示する。例えば、欠損した機能的活性は、酵素的活性、構造的活性、または遺伝子調節活性の性質を有し得る。関連する実施形態において、投与されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞内に存在しているが、実質的に不全である機能的活性を増加させる(例えば、相乗的に)、1つ以上の組換えポリペプチドの産生を指示する。
他の実施形態において、投与されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、組換えポリペプチドが翻訳される細胞内で実質的に不在である1つのポリペプチド(または複数のポリペプチド)を置き換える、1つ以上の組換えポリペプチドの産生を指示する。そのような不在性は、コード遺伝子の遺伝子突然変異またはその調節経路に起因し得る。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、細胞内の内因性タンパク質のレベルを所望のレベルまで増加させ、そのような増加は、内因性タンパク質のレベルを正常未満のレベルから正常なレベルへと、または正常なレベルから過正常なレベルへと至らせ得る。
あるいは、組換えポリペプチドは、細胞内に存在する、最上の表面上にある、または細胞から分泌される内因性タンパク質の活性に拮抗するように機能する。通常、内因性タンパク質の活性は、例えば、内因性タンパク質の突然変異が変化した活性または局在化をもたらすことに起因して、対象に有害である。さらに、組換えポリペプチドは、細胞内に存在する、最上の表面上にある、または細胞から分泌される生体部分の活性に、直接的または間接的に拮抗する。拮抗対象の生体部分の例としては、脂質(例えば、コレステロール)、リポタンパク質(例えば、低比重リポタンパク質)、核酸、炭水化物、志賀毒素および破傷風毒素等のタンパク質毒素、またはボツリヌス毒素、コレラ毒素、およびジフテリア毒素等の小分子毒素が挙げられる。さらに、拮抗対象の生物学的分子は、細胞傷害性活性または細胞増殖抑制性活性等の望ましくない活性を示す内因性タンパク質である場合がある。
本明細書に記載の組換えタンパク質は、細胞内、可能性としては核等の特定の区画内での局在化のために操作されてもよく、または細胞からの分泌もしくは細胞の原形質膜への移行のために操作される。
いくつかの実施形態において、本発明に従う修飾mRNAおよびそれらのコードされたポリペプチドは、次のうちの1つ以上を含むが、これらに限定されない多様な疾患、障害、および/または状態のいずれの治療に使用されてもよい:自己免疫障害(例えば、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ);炎症性障害(例えば、関節炎、骨盤内炎症性疾患);感染性疾患(例えば、ウイルス感染(例えば、HIV、HCV、RSV)、細菌感染、真菌感染、敗血症);神経障害(例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病;自閉症;デュシェンヌ型筋ジストロフィー);心血管障害(例えば、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、血栓、凝固障害、血管新生障害等の黄斑変性);増殖性障害(例えば、癌、良性新生物);呼吸器障害(例えば、慢性閉塞性肺疾患);消化器障害(例えば、炎症性腸疾患、胃潰瘍);筋骨格障害(例えば、線維筋痛症、関節炎);内分泌、代謝、および栄養障害(例えば、糖尿病、骨粗鬆症);泌尿器障害(例えば、腎疾患);精神的障害(例えば、うつ病、統合失調症);皮膚障害(例えば、創傷、湿疹);血液およびリンパ系障害(例えば、貧血症、血友病)等。
機能不全のまたは異常なタンパク質活性によって特徴付けられる疾患には、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血症、表皮水疱症、筋萎縮性側索硬化症、およびグルコース−6−リン酸脱水素酵素欠損症が含まれる。本発明は、本明細書に提供されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含有する核酸または細胞ベースの治療薬導入することによって、対象においてそのような状態または疾患を治療するための方法を提供し、このポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、対象の細胞内に存在する異常なタンパク質活性に拮抗するか、またはそれに打ち勝つタンパク質をコードする。機能不全のタンパク質の具体的な例としては、嚢胞性線維症を引き起こすCFTRタンパク質の機能不全のタンパク質変異形を産生する、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子(CFTR)遺伝子のミスセンス突然変異変異形が挙げられる。
欠損した(または適正な(正常なまたは生理学的タンパク質機能が生じないほどに実質的に低下した)タンパク質活性によって特徴付けられる疾患には、嚢胞性線維症、ニーマン・ピック病C型、重症型βサラセミア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハーラー症候群、ハンター症候群、および血友病Aが含まれる。そのようなタンパク質は、存在しない場合があるか、または本質的に非機能的である。本発明は、本明細書に提供されるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含有する核酸または細胞ベースの治療薬導入することによって、対象においてそのような状態または疾患を治療するための方法を提供し、このポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、対象の標的細胞から欠損したタンパク質活性を置き換える。機能不全のタンパク質の具体的な例としては、嚢胞性線維症を引き起こすCFTRタンパク質の非機能的なタンパク質変異形を産生する、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子(CFTR)遺伝子のナンセンス突然変異変異形が挙げられる。
したがって、対象の細胞を、有効量のCTFRポリペプチドが細胞内に存在するような条件下で、機能的CFTRポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAと接触させることによって、哺乳類対象において嚢胞性線維症を治療する方法が提供される。好ましい標的細胞は、肺等の上皮、内皮、および中皮細胞であり、投与方法は、標的組織を考慮して決定され、すなわち、肺送達に関して、RNA分子は、吸入による投与のために製剤化される。
別の実施形態において、本発明は、対象の細胞集団に、ゲノム研究によって最近特徴付けられたタンパク質であるSortilinをコードする修飾mRNA分子を用いて導入し、それによって対象において高脂血症を寛解させることによって、対象において高脂血症を治療するための方法を提供する。SORT1遺伝子は、Sortilinと呼ばれるトランスゴルジ網(TGN)膜貫通タンパク質をコードする。遺伝子研究は、5人に1人の個人が、SORT1遺伝子の1p13遺伝子座において、低レベルの低比重リポタンパク質(LDL)および超低比重リポタンパク質(VLDL)の素因を付与する一塩基多型rs12740374を有することを示している。人々の約30%において存在するこのマイナー対立遺伝子の各コピーは、LDLコレステロールを8mg/dLだけ変化させる一方で、集団の約5%において存在するこのマイナー対立遺伝子の2つのコピーは、LDLコレステロールを16mg/dL低下させる。このマイナー対立遺伝子の保因者は、心筋梗塞の40%減少した危険性を有することも示されている。マウスにおける機能的インビボ研究は、マウス肝臓組織内のSORT1の過剰発現が、最大80%より低い、有意により低いLDL−コレステロールレベルをもたらし、SORT1のサイレンシングがLDLコレステロールをおよそ200%増加させることを記載する(Musunuru K et al.From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus.Nature2010;466:714−721)。
別の実施形態において、本発明は、造血障害、心血管疾患、腫瘍学(oncology)、糖尿病、嚢胞性線維症、神経疾患、先天性代謝異常、皮膚および全身障害、ならびに失明を治療するための方法を提供する。これらの具体的な疾患を治療するための分子標的が記載されている(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Templeton ed.,Gene and Cell Therapy:Therapeutic Mechanisms and Strategies,3rd Edition,Bota Raton,FL:CRC Press)。
感染および/または敗血症を発症する危険性がある対象において感染および/または敗血症を予防するための方法が本明細書に提供され、本方法は、そのような予防を必要とする対象に、感染および/または敗血症を予防するのに十分な量で、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)、またはその部分的もしくは完全にプロセシングされた形態をコードするポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNA前駆体を含む組成物を投与することを含む。ある特定の実施形態において、感染および/または敗血症を発症する危険性がある対象は、癌患者であり得る。ある特定の実施形態において、癌患者は、前処置レジメンを経た場合がある。いくつかの実施形態において、前処置統制(regiment)は、化学療法、放射線療法、または両方を含むが、これらに限定されない。非限定的な例として、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、プロテインC、そのチモーゲンもしくはプレプロタンパク質、またはプロテインCの活性化型(APC)もしくはプロテインCの変異形をコードし得、それらは当技術分野で知られている。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、化学修飾され、細胞に送達されてもよい。本発明の化学修飾されたmRNA内でコードされ得るポリペプチドの非限定的な例としては、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第7,226,999号、同第7,498,305号、同第6,630,138号に教示されるものが挙げられる。これらの特許は、プロテインC様分子、変異形、および誘導体を教示し、これらのうちのいずれも、本発明の化学修飾された分子内でコードされ得る。
対象において感染および/または敗血症を治療するための方法が本明細書にさらに提供され、本方法は、そのような治療を必要とする対象に、感染および/または敗血症を治療するのに十分な量で、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)、例えば、本明細書に記載の抗菌性ポリペプチド、またはその部分的もしくは完全にプロセシングされた形態をコードするポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNA前駆体を含む組成物を投与することを含む。ある特定の実施形態において、治療を必要とする対象は、癌患者である。ある特定の実施形態において、癌患者は、前処置レジメンを経ている。いくつかの実施形態において、前処置統制(regiment)は、化学療法、放射線療法、または両方を含むが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、対象は、急性または慢性微生物感染(例えば、細菌感染)を呈する場合がある。ある特定の実施形態において、対象は、治療を受けた場合があるか、または受けている場合がある。ある特定の実施形態において、治療には、放射線療法、化学療法、ステロイド、紫外線放射、またはこれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、患者は、微小血管障害を患っている場合がある。いくつかの実施形態において、微小血管障害は、糖尿病であり得る。ある特定の実施形態において、患者は、創傷を有し得る。いくつかの実施形態において、創傷は、潰瘍であり得る。具体的な実施形態において、創傷は、糖尿病性足部潰瘍であり得る。ある特定の実施形態において、対象は、1つ以上の熱傷創を有し得る。ある特定の実施形態において、投与は、局所であっても全身であってもよい。ある特定の実施形態において、投与は、皮下であってもよい。ある特定の実施形態において、投与は、静脈内であってもよい。ある特定の実施形態において、投与は、経口であってもよい。ある特定の実施形態において、投与は、局所であってもよい。ある特定の実施形態において、投与は、吸入によるものであってもよい。ある特定の実施形態において、投与は、直腸であってもよい。ある特定の実施形態において、投与は、膣内であってもよい。
本開示の他の態様は、哺乳類対象への、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含有する細胞の移植に関する。哺乳類対象への細胞の投与は、当業者に知られており、局所(局所)移植(例えば、局所(topical)または皮下投与)、器官送達または全身埋込(例えば、静脈内注入または吸入)、および薬学的に許容される担体中の細胞の製剤を含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含有するそのような組成物は、筋肉内に、経動脈的に、腹腔内に、静脈内に、鼻腔内に、皮下に、内視鏡的に、経皮的に、または髄腔内に投与するために製剤化することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、持続放出のために製剤化されてもよい。
治療剤が投与され得る対象は、疾患、障害、または有害な状態を患うか、またはそれを発症する危険性があり得る。これらに基づいて、対象を特定する、診断する、および分類する方法が提供され、それは臨床診断、バイオマーカーレベル、全ゲノム相関解析(GWAS)、および当技術分野で既知の他の方法を含んでもよい。
創傷管理 本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、創傷治療、例えば、治癒の遅延を呈する創傷の治療に使用されてもよい。創傷の治療を管理するためにポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの投与を含む方法が本明細書に提供される。本明細書における方法は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの投与の前、それと同時、またはその後のいずれかに行われるステップをさらに含んでもよい。例えば、創傷床は、創傷治癒を容易にし、望ましくは創傷の閉鎖を得るために、清浄にされ、準備される必要があり得る。創傷治癒を促進し、創傷閉鎖を達成するために、次のものを含むが、これらに限定されない、いくつかの戦略が使用され得る:(i)壊死組織除去(任意に反復される)、鋭利な壊死組織除去(死滅または感染組織の創傷からの外科的除去)、任意に、壊死組織を除去するための酵素等の化学的壊死組織除去剤、(ii)創傷に湿潤した温暖な環境を提供し、組織修復および治癒を促進するための創傷ドレッシング。
創傷ドレッシングを製剤化する際に使用される材料の例としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない:ヒドロゲル(例えば、AQUASORB(登録商標);DUODERM(登録商標))、ヒドロコロイド(例えば、AQUACEL(登録商標);COMFEEL(登録商標))、泡状物質(例えば、LYOFOAM(登録商標);SPYROSORB(登録商標))、およびアルギン酸塩(例えば、ALGISITE(登録商標);CURASORB(登録商標))、(iii)細胞分裂および増殖を刺激し、創傷治癒を促進するためのさらなる成長因子、例えば、神経障害性足部潰瘍の治療のためにFDAによって認可されているヒト組換え血小板由来成長因子である、ベカプレルミン(REGRANEXゲル(登録商標))、(iv)清浄な、治癒していない創傷の被覆を得るために、軟組織創傷被覆、すなわち皮膚移植片が必要であり得る。軟組織被覆に使用され得る皮膚移植片の例としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない:自家皮膚移植片、屍体皮膚移植片、生物工学によって作られた代用皮膚(例えば、APLIGRAF(登録商標);DERMAGRAFT(登録商標))。
ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAには、ヒドロゲル(例えば、AQUASORB(登録商標);DUODERM(登録商標))、ヒドロコロイド(例えば、AQUACEL(登録商標);COMFEEL(登録商標))、泡状物質(例えば、LYOFOAM(登録商標);SPYROSORB(登録商標))、および/またはアルギン酸塩(例えば、ALGISITE(登録商標);CURASORB(登録商標))がさらに含まれてもよい。ある特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、自家皮膚移植片、屍体皮膚移植片、または生物工学によって作られた代用皮膚(例えば、APLIGRAF(登録商標);DERMAGRAFT(登録商標))を含むが、これらに限定されない皮膚移植片とともに使用されてもよい。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、創傷(would)ドレッシング製剤および/もしくは皮膚移植片とともに適用されてもよく、またはそれはた、浸漬もしくは散布等であるが、これらに限定されない方法を除いて別個に適用されてもよい。
いくつかの実施形態において、創傷管理のための組成物は、抗菌性ポリペプチド(例えば、抗細菌性ポリペプチド)および/または抗ウイルス性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含んでもよい。抗菌性ポリペプチドの前駆体または部分的もしくは完全にプロセシングされた形態がコードされてもよい。組成物は、包帯(例えば、粘着包帯)を用いた投与のために製剤化されてもよい。抗菌性ポリペプチドおよび/または抗ウイルス性ポリペプチドは、ドレッシング組成物と相互混合されてもよく、または別個に、例えば、浸漬もしくは散布によって適用されてもよい。
抗体の産生 本発明の一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、抗体およびそのような抗体の断片をコードし得る。これらは、本明細書に記載の方法のうちのいずれか1つによって産生されてもよい。抗体は、IgA、IgG、もしくはIgM等であるが、これらに限定されない、免疫グロブリンの異なるサブクラスまたはアイソタイプのうちのいずれか、または他のサブクラスのうちのいずれかであってもよい。本発明に従って調製され得る例示の抗体分子および断片には、免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、およびパラトープを含有し得る免疫グロブリン分子の部分が含まれるが、これらに限定されない。パラトープを含有し得る抗体のそのような部分には、Fab、Fab’、F(ab’)2、F(v)および当技術分野で既知の部分が含まれるが、これらに限定されない。
本発明のポリヌクレオチドは、参照ポリペプチド配列とある特定の同一性を有し得るか、または参照ポリペプチド配列と似ているもしくは似ていない結合特徴を有し得る、変異形抗体ポリペプチドをコードし得る。
本発明の方法によって得られる抗体は、免疫された動物に由来する非ヒト抗体由来可変領域(複数可)配列、およびヒト抗体由来定常領域(複数可)配列を含む、キメラ抗体であってもよい。加えて、それらは、免疫された動物に由来する非ヒト抗体の相補的(complementary)決定領域(CDR)ならびにヒト抗体に由来するフレームワーク領域(FR)および定常領域を含む、ヒト化抗体でもあり得る。別の実施形態において、本明細書に提供される方法は、細胞培養プロセスにおいて抗体タンパク質産物の収率を向上させるために有用であり得る。
感染を管理する 一実施形態において、抗菌性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを投与することによって、対象において、微生物感染(例えば、細菌感染)および/または微生物またはウイルス感染に関連した疾患、障害、もしくは状態、またはその症状を治療するまたは予防するための方法が提供される。該投与は、抗菌性薬剤(例えば、抗細菌剤)、例えば、本明細書に記載の抗菌性ポリペプチドまたは小分子抗菌性化合物と組み合わせられてもよい。抗菌性薬剤には、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原虫薬剤、抗寄生虫剤、および抗プリオン剤が含まれるが、これらに限定されない。
薬剤は、同時に、例えば、組み合わせた単位用量(例えば、両方の薬剤の同時送達を提供する)で投与することができる。薬剤は、数分間、数時間、数日間、または数週間の間隔等であるが、これらに限定されない、指定される時間間隔で投与することもできる。一般に、薬剤は、対象において、並行して生物学的に利用可能、例えば、検出可能であり得る。いくつかの実施形態において、薬剤は、本質的に同時に、例えば、同時に投与される2つの単位投薬量、または2つの薬剤の組み合わせた単位投薬量で、投与されてもよい。他の実施形態において、薬剤は、別個の単位投薬量で送達されてもよい。薬剤は、任意の順序で、または2つ以上の薬剤を含む1つ以上の調製物により、投与されてもよい。好ましい実施形態において、薬剤のうちの1つ、例えば、第1の薬剤の、少なくとも1回の投与は、他方の薬剤、例えば、第2の薬剤の数分、1、2、3、もしくは4時間以内に、またはさらに1日もしくは2日以内に行われてもよい。いくつかの実施形態において、組み合わせは、相乗的結果、例えば、相加的結果を超える、例えば、相加的結果の少なくとも25、50、75、100、200、300、400、または500%超を達成することができる。
細菌感染に関連した状態 細菌感染に関連し得る疾患、障害、または状態には、膿瘍、放線菌症、急性前立腺炎、エロモナス・ハイドロフィラ、一年生草ライグラス中毒、炭疽病、桿菌性紫斑症、菌血症、細菌性胃腸炎、細菌性髄膜炎、細菌性肺炎、細菌性膣症、細菌関連皮膚状態、バルトネラ症、BCG腫、ボトリオミセス症、ボツリヌス症、ブラジル紫斑熱、ブローディー膿瘍、ブルセラ症、ブルーリ潰瘍、カンピロバクター症、カリエス、カリオン病、ネコひっかき病、蜂窩織炎、クラミジア感染、コレラ、慢性細菌性前立腺炎、慢性再発性多巣性骨髄炎、クロストリジウム壊死性腸炎、歯周−歯内病変(combined periodontic−endodontic lesions)、牛肺疫、ジフテリア、ジフテリア性口内炎、エーリキア症、丹毒、喉頭蓋炎(piglottitis)、丹毒、フィッツ・ヒュー・カーチス症候群、ノミ媒介性斑点熱、腐蹄症(感染性足皮膚炎)、Garre硬化性骨髄炎、淋病、鼠径肉芽腫、ヒト顆粒球性アナプラズマ症、ヒト単球向性エーリキア症、百日咳(hundred days’cough)、膿痂疹、晩期先天性梅毒性眼病、レジオネラ症、レミエール症候群、ライ病(ハンセン病)、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、リンパ節炎、類鼻疽、髄膜炎菌性疾患、髄膜炎菌性敗血症、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)感染、マイコバクテリウム複合体(MAI)、マイコプラズマ肺炎、壊死性筋膜炎、ノカルジア症、水癌(noma)(水癌(cancrum oris)または壊疽性口内炎)、臍炎、眼窩蜂巣炎、骨髄炎、脾臓摘出後重症感染(OPSI)、ヒツジブルセラ症、パスツレラ病、眼窩周囲蜂巣炎、百日咳(pertussis)(百日咳(whooping cough))、ペスト、肺炎球菌肺炎、ポット病、直腸炎、シュードモナス感染、オウム病、膿血症、化膿性筋炎、Q熱、再帰熱(回帰熱)、リウマチ熱、ロッキー山斑点熱(RMSF)、リケッチア症、サルモネラ症、猩紅熱、敗血症、セラチア感染、細菌性赤痢、南部ダニ紅斑病(southern tick−associated rash illness)、ブドウ球菌性皮膚剥脱症候群、連鎖球菌咽頭炎、プール肉芽腫、ブタブルセラ症、梅毒、梅毒性大動脈炎、破傷風、毒素性ショック症候群(TSS)、トラコーマ、塹壕熱、熱帯性潰瘍、結核、野兎病、腸チフス、発疹チフス、尿路性器結核、尿路感染、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌感染、ウォーターハウス・フリードリヒセン症候群、偽性結核(エルシニア)症、およびエルシニア症のうちの1つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。細菌感染に関連した他の疾患、障害、および/または状態は、例えば、アルツハイマー病、神経性食欲不振症、喘息、アテローム性動脈硬化症、注意欠陥多動性障害、自閉症、自己免疫疾患、双極性障害、癌(例えば、結腸直腸癌、胆嚢癌、肺癌、膵臓癌、および胃癌)、慢性疲労症候群、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、冠動脈心疾患、認知症、うつ病、ギラン・バレー症候群、内臓脂肪症候群、多発性硬化症、心筋梗塞、肥満、強迫障害、パニック障害、乾癬、関節リウマチ、サルコイドーシス、統合失調症、脳卒中、閉塞性血栓血管炎(バージャー病)、およびトゥレット症候群を含むことができる。
細菌性病原体 本明細書に記載の細菌は、グラム陽性菌またはグラム陰性菌であり得る。細菌性病原体には、アシネトバクター・バウマンニ、バチルス・アントラシス、バチルス・スブチリス、ボルデテラ・パータシス、ボレリア・ブルグドルフェリ、ブルセラ・アボルタス、ブルセラ・カニス、ブルセラ・メリテンシス、ブルセラ・スイス、カンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア・ニューモニエ、クラミジアトラコーマtis、クラミドフィラ・シタッシ、クロストリジウムボツリヌス、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウムテタニ、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、コリネバクテリウムジフテリア、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌、腸内毒素原性大腸菌(ETEC)、腸管病原性大腸菌、大腸菌O157:H7、エンテロバクター種、フランシセラ・ツラレンシス、ヘモフィルス・インフルエンザエ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、レプトスピラ・インテロガンス、リステリア・モノサイトゲネス、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarralis)、マイコバクテリウム・レプレ、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコプラズマ・ニューモニエ、ナイセリア・ゴノレー、ナイセリア・メニンギティディス、プレテウス・ミラビリス(Preteus mirabilis)、プロテウス属、シュードモナス・エルジノーサ、リケッチア・リケッチイ、サルモネラ・チフィ、サルモネラ・チフィリウム、セラチア・マルセセンス(Serratia marcesens)、シゲラ・フレックスネリ、シゲラ・ソネイ、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミデス、スタフィロコッカス・サプロフィチカス、ストレプトコッカス・アガラクチア、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、トレポネーマー・パリダム、ビブリオ・コレラエ、およびエルシニア・ペスチスが挙げられるが、これらに限定されない。細菌性病原体は、耐性菌感染を引き起こす細菌、例えば、クリンダマイシン耐性クロストリジウム・ディフィシル、フルオロキノロン耐性クロストリジウム・ディフィシル、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(MRSA)、多剤耐性エンテロコッカス・フェカリス、多剤耐性エンテロコッカス・フェシウム、多剤耐性シュードモナス・エルジノーサ、多剤耐性アシネトバクター・バウマンニ、およびバンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス(VRSA)も含み得る。
抗生物質の組み合わせ 一実施形態において、本発明の修飾mRNAは、1つ以上の抗生物質と組み合わせて投与され得る。これらには、アクニロックス、アムビゾーム、アモキシシリン、アンピシリン、オーグメンチン、アベロックス、アジスロマイシン、バクトロバン、ベタジン、ベトノベート、ブレファミド(Blephamide)、セファクロル、セファドロキシル、セフジニル、セフェピム、セフィックス(Cefix)、セフィキシム、セフォキシチン、セフポドキシム、セフプロジル、セフロキシム、セフジル(Cefzil)、セファレキシン、セファゾリン(Cephazolin)、セプタズ(Ceptaz)、クロラムフェニコール、クロルヘキシジン、クロロマイセチン、クローシグ(Chlorsig)、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダゲル(Clindagel)、クリンダマイシン、クリンダテック(Clindatech)、クロキサシリン、コリスチン、コトリモキサゾール、デメクロサイクリン、ジクロシル(Diclocil)、ジクロキサシリン、ドキシサイクリン、デュリセフ(Duricef)、エリスロマイシン、フラマジン(Flamazine)、フロキシン(Floxin)、フラミセチン、フシジン(Fucidin)、フラダンチン、フシジック(Fusidic)、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、ゲミフロキサシン、イロソン、ヨード、ラバキン(Levaquin)、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、マクサクイン(Maxaquin)、メフォキシン、メロネム、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ミヤンブトール(Myambutol)、マイコスタチン、ネオスポリン、ネトロマイシン(Netromycin)、ニトロフラントイン、ノルフロキサシン、ノリレット(Norilet)、フロキサシン、オムニカフ(Omnicef)、オスパモックス(Ospamox)、オキシテトラサイクリン、パラキシン(Paraxin)、ペニシリン、ニューモバックス、ポリファックス(Polyfax)、ポビドン、リファジン、リファンピン、リファキシミン、リファナフ(Rifinah)、リマクタン、ロセフィン、ロキシスロマイシン、セロマイシン、ソフラマイシン(Soframycin)、スパルフロキサシン、スタフレックス(Staphlex)、タゴシッド、テトラサイクリン、テトラドックス(Tetradox)、テトラリサル(Tetralysal)、トブラマイシン(tobramycin)、トブラマイシン(Tobramycin)、トレケーター(Trecator)、タイガシル、バンコシン、ベロセフ(Velosef)、ビブラマイシン、キファサン(Xifaxan)、ザガム(Zagam)、ジトロテク(Zitrotek)、ゾデルム(Zoderm)、ジマー(Zymar)、およびザイボックスが挙げられるが、これらに限定されない。
抗細菌剤 例示の抗細菌剤には、アミノグリコシド(例えば、アミカシン(AMIKIN(登録商標))、ゲンタマイシン(GARAMYCIN(登録商標))、カナマイシン(KANTREX(登録商標))、ネオマイシン(MYCIFRADIN(登録商標))、ネチルマイシン(NETROMYCIN(登録商標))、トブラマイシン(NEBCIN(登録商標))、パロモマイシン(HUMATIN(登録商標))、アンサマイシン(例えば、ゲルダナマイシン、ハービマイシン)、カルバセフェム(例えば、ロラカルベフ(LORABID(登録商標))、カルバペネム(例えば、エルタペネム(INVANZ(登録商標))、ドリペネム(DORIBAX(登録商標))、イミペネム/シラスタチン(PRIMAXIN(登録商標))、メロペネム(MERREM(登録商標))、セファロスポリン類(第1世代)(例えば、セファドロキシル(DURICEF(登録商標))、セファゾリン(ANCEF(登録商標))、セファロチンまたはセファロチン(cefalothin)(KEFLIN(登録商標))、セファレキシン(KEFLEX(登録商標))、セファロスポリン類(第2世代)(例えば、セファクロル(CECLOR(登録商標))、セファマンドール(MANDOL(登録商標))、セフォキシチン(MEFOXIN(登録商標))、セフプロジル(CEFZIL(登録商標))、セフロキシム(CEFTIN(登録商標)、ZINNAT(登録商標))、セファロスポリン類(第3世代)(例えば、セフィキシム(SUPRAX(登録商標))、セフジニル(OMNICEF(登録商標)、CEFDIEL(登録商標))、セフジトレン(SPECTRACEF(登録商標))、セフォペラゾン(CEFOBID(登録商標))、セフォタキシム(CLAFORAN(登録商標))、セフポドキシム(VANTIN(登録商標))、セフタジジム(FORTAZ(登録商標))、セフチブテン(CEDAX(登録商標))、セフチゾキシム(CEFIZOX(登録商標))、セフトリアクソン(ROCEPHIN(登録商標))、セファロスポリン類(第4世代)(例えば、セフェピム(MAXIPIME(登録商標))、セファロスポリン類(第5世代)(例えば、セフトビプロール(ZEFTERA(登録商標))、グリコペプチド(例えば、テイコプラニン(TARGOCID(登録商標))、バンコマイシン(VANCOCIN(登録商標))、テラバンシン(VIBATIV(登録商標))、リンコサミド系(例えば、クリンダマイシン(CLEOCIN(登録商標))、リンコマイシン(LINCOCIN(登録商標))、リポペプチド(例えば、ダプトマイシン(CUBICIN(登録商標))、マクロライド系(例えば、アジスロマイシン(ZITHROMAX(登録商標)、SUMAMED(登録商標)、ZITROCIN(登録商標))、クラリスロマイシン(BIAXIN(登録商標))、ジリスロマイシン(DYNABAC(登録商標))、エリトロマイシン(ERYTHOCIN(登録商標)、ERYTHROPED(登録商標))、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン(TAO(登録商標))、テリスロマイシン(KETEK(登録商標))、スペクチノマイシン(TROBICIN(登録商標))、モノバクタム系(例えば、アズトレオナム(AZACTAM(登録商標))、ニトロフラン(例えば、フラゾリドン(FUROXONE(登録商標))、ニトロフラントイン(MACRODANTIN(登録商標)、MACROBID(登録商標))、ペニシリン系(例えば、アモキシシリン(NOVAMOX(登録商標)、AMOXIL(登録商標))、アンピシリン(PRINCIPEN(登録商標))、アズロシリン、カルベニシリン(GEOCILLIN(登録商標))、クロキサシリン(TEGOPEN(登録商標))、ジクロキサシリン(DYNAPEN(登録商標))、フルクロキサシリン(FLOXAPEN(登録商標))、メズロシリン(MEZLIN(登録商標))、メチシリン(STAPHCILLIN(登録商標))、ナフシリン(UNIPEN(登録商標))、オキサシリン(PROSTAPHLIN(登録商標))、ペニシリンG(PENTIDS(登録商標))、ペニシリンV(PEN−VEE−K(登録商標))、ピペラシリン(PIPRACIL(登録商標))、テモシリン(NEGABAN(登録商標))、チカルシリン(TICAR(登録商標))、ペニシリンの組合せ(例えば、アモキシシリン/クラブラン酸(AUGMENTIN(登録商標))、アンピシリン/スルバクタム(UNASYN(登録商標))、ピペラシリン/タゾバクタム(ZOSYN(登録商標))、チカルシリン/クラブラネート(TIMENTIN(登録商標))、ポリペプチド(例えば、バシトラシン、コリスチン(COLY−MYCIN−S(登録商標))、ポリミキシンB、キノロン系(例えば、シプロフロキサシン(CIPRO(登録商標)、CIPROXIN(登録商標)、CIPROBAY(登録商標))、エノキサシン(PENETREX(登録商標))、ガチフロキサシン(TEQUIN(登録商標))、レボフロキサシン(LEVAQUIN(登録商標))、ロメフロキサシン(MAXAQUIN(登録商標))、モキシフロキサシン(AVELOX(登録商標))、ナリジクス酸(NEGGRAM(登録商標))、ノルフロキサシン(NOROXIN(登録商標))、オフロキサシン(FLOXIN(登録商標)、OCUFLOX(登録商標))、トロバフロキサシン(TROVAN(登録商標))、グレパフロキサシン(RAXAR(登録商標))、スパルフロキサシン(ZAGAM(登録商標))、テマフロキサシン(OMNIFLOX(登録商標))、スルホンアミド類(例えば、マフェニド(SULFAMYLON(登録商標))、スルホンアミドクリソイジン(PRONTOSIL(登録商標))、スルファセタミド(SULAMYD(登録商標)、BLEPH−10(登録商標))、スルファジアジン(MICRO−SULFON(登録商標))、スルファジアジン銀(SILVADENE(登録商標))、スルファメチゾール(THIOSULFIL FORTE(登録商標))、スルファメトキサゾール(GANTANOL(登録商標))、スルファニルイミド(sulfanilimide)、スルファサラジン(AZULFIDINE(登録商標))、スルファフラゾール(GANTRISIN(登録商標))、トリメトプリム(PROLOPRIM(登録商標))、TRIMPEX(登録商標))、トリメトプリム−スルファメトキサゾール(コトリモキサゾール)(TMP−SMX)(BACTRIM(登録商標)、SEPTRA(登録商標))、テトラサイクリン系(例えば、デメクロサイクリン(DECLOMYCIN(登録商標))、ドキシサイクリン(VIBRAMYCIN(登録商標))、ミノサイクリン(MINOCIN(登録商標))、オキシテトラサイクリン(TERRAMYCIN(登録商標))、テトラサイクリン(SUMYCIN(登録商標)、ACHROMYCIN(登録商標)V、STECLIN(登録商標))、マイコバクテリアに対する薬物(例えば、クロファジミン(LAMPRENE(登録商標))、ダプソン(AVLOSULFON(登録商標))、カプレオマイシン(CAPASTAT(登録商標))、サイクロセリン(SEROMYCIN(登録商標))、エタンブトール(MYAMBUTOL(登録商標))、エチオナミド(TRECATOR(登録商標))、イソニアジド(I.N.H.(登録商標))、ピラジナミド(ALDINAMIDE(登録商標))、リファンピン(RIFADIN(登録商標)、RIMACTANE(登録商標))、リファブチン(MYCOBUTIN(登録商標))、リファペンチン(PRIFTIN(登録商標))、ストレプトマイシン)、ならびにその他(例えば、アルスフェナミン(SALVARSAN(登録商標))、クロラムフェニコール(CHLOROMYCETIN(登録商標))、ホスホマイシン(MONUROL(登録商標))、フシジン酸(FUCIDIN(登録商標))、リネゾリド(ZYVOX(登録商標))、メトロニダゾール(FLAGYL(登録商標))、ムピロシン(BACTROBAN(登録商標))、プラテンシマイシン、キヌプリスチン/ダルホプリスチン(SYNERCID(登録商標))、リファキシミン(XIFAXAN(登録商標))、チアンフェニコール、チゲサイクリン(TIGACYL(登録商標))、チニダゾール(TINDAMAX(登録商標)、FASIGYN(登録商標))が挙げられるが、これらに限定されない。
ウイルス感染に関連した状態 別の実施形態において、抗ウイルス剤、例えば、本明細書に記載の抗ウイルス性ポリペプチドまたは小分子抗ウイルス剤と組み合わせて、一次構築物をコードするポリヌクレオチド、またはmmRNA抗ウイルス性ポリペプチド、例えば、本明細書に記載の抗ウイルス性ポリペプチドを投与することによって、対象において、ウイルス感染および/もしくはウイルス感染に関連した疾患、障害、または状態、またはそれらの症状を治療するか、または予防する方法が提供される。
ウイルス感染に関連した疾患、障害、または状態には、急性熱性咽頭炎、咽頭結膜熱、流行性角結膜炎、乳児胃腸炎、コクサッキー感染、感染性単核球症、バーキットリンパ腫、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌、一次HSV−1感染(例えば、小児における歯肉口内炎、成人における扁桃炎および咽頭炎、角結膜炎)、潜在性HSV−1感染(例えば、口唇ヘルペスおよび単純ヘルペス)、一次HSV−2感染、潜在性HSV−2感染、無菌性髄膜炎、感染性単核球症、巨細胞封入体症、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病、原発性体液性リンパ腫、AIDS、インフルエンザ、ライ症候群、麻疹、感染後脳脊髄炎、流行性耳下腺炎、過形成性上皮性病変(例えば、尋常性、扁平、足底および肛門性器疣贅、喉頭乳頭腫、疣贅状表皮発育異常症)、子宮頸癌、扁平上皮癌、クループ、肺炎、細気管支炎、感冒、灰白髄炎、狂犬病、細気管支炎、肺炎、インフルエンザ様症候群、肺炎を伴う重症細気管支炎、ドイツ麻疹、先天性風疹、水痘およびヘルペス帯状疱疹が挙げられるが、これらに限定されない。
ウイルス性病原体 ウイルス性病原体には、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、デングウイルス、脳炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス8型、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス、パラインフルエンザ、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、風疹ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、西ナイルウイルス、および黄熱病ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス性病原体は、耐性ウイルス感染を引き起こすウイルスも含む。
抗ウイルス剤 例示の抗ウイルス剤には、アバカビル(ZIAGEN(登録商標))、アバカビル/ラミブジン/ジドブジン(trizivir(登録商標))、アシクロビル(aciclovir)またはアシクロビル(acyclovir)(CYCLOVIR(登録商標)、HERPEX(登録商標)、ACIVIR(登録商標)、ACIVIRAX(登録商標)、ZOVIRAX(登録商標)、ZOVIR(登録商標))、アデフォビル(Preveon(登録商標)、Hepsera(登録商標))、アマンタジン(SYMMETREL(登録商標))、アンプレナビル(AGENERASE(登録商標))、アンプリゲン(ampligen)、アルビドール、アタザナビル(REYATAZ(登録商標))、ボセプレビル、シドフォビル、ダルナビル(PREZISTA(登録商標))、デラビルジン(RESCRIPTOR(登録商標))、ジダノシン(VIDEX(登録商標))、ドコサノール(ABREVA(登録商標))、エドクスジン、エファビレンツ(SUSTIVA(登録商標)、STOCRIN(登録商標))、エムトリシタビン(EMTRIVA(登録商標))、エムトリシタビン/テノホビル/エファビレンツ(ATRIPLA(登録商標))、エンフビルチド(FUZEON(登録商標))、エンテカビル(BARACLUDE(登録商標)、ENTAVIR(登録商標))、ファムシクロビル(FAMVIR(登録商標))、ホミビルセン(VITRAVENE(登録商標))、ホスアンプレナビル(LEXIVA(登録商標)、TELZIR(登録商標))、ホスカルネット(FOSCAVIR(登録商標))、ホスホネット、ガンシクロビル(CYTOVENE(登録商標)、CYMEVENE(登録商標)、VITRASERT(登録商標))、GS9137(ELVITEGRAVIR(登録商標))、イミキモド(ALDARA(登録商標)、ZYCLARA(登録商標)、BESELNA(登録商標))、インジナビル(CRIXIVAN(登録商標))、イノシン、イノシンプラノベクス(IMUNOVIR(登録商標))、I型インターフェロン、II型インターフェロン、III型インターフェロン、クタプレシン(kutapressin)(NEXAVIR(登録商標))、ラミブジン(ZEFFIX(登録商標)、HEPTOVIR(登録商標)、EPIVIR(登録商標))、ラミブジン/ジドブジン(COMBIVIR(登録商標))、ロピナビル、ロビライド(loviride)、マラビロク(SELZENTRY(登録商標)、CELSENTRI(登録商標))、メチサゾン、MK−2048、モロキシジン、ネルフィナビル(VIRACEPT(登録商標))、ネビラピン(VIRAMUNE(登録商標))、オセルタミビル(TAMIFLU(登録商標))、ペグインターフェロンα−2a(PEGASYS(登録商標))、ペンシクロビル(DENAVIR(登録商標))、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン(CONDYLOX(登録商標))、ラルテグラビル(ISENTRESS(登録商標))、リバビリン(COPEGUs(登録商標)、REBETOL(登録商標)、RIBASPHERE(登録商標)、VILONA(登録商標)ANDVIRAZOLE(登録商標))、リマンタジン(FLUMADINE(登録商標))、リトナビル(NORVIR(登録商標))、ピラミジン(pyramidine)、サクイナビル(INVIRASE(登録商標)、FORTOVASE(登録商標))、スタブジン、ティーツリーオイル(メラレウカ(melaleuca)油)、テノホビル(VIREAD(登録商標))、テノホビル/エムトリシタビン(TRUVADA(登録商標))、チプラナビル(APTIVUS(登録商標))、トリフルリジン(VIROPTIC(登録商標))、トロマンタジン(VIRU−MERZ(登録商標))、バラシクロビル(VALTREX(登録商標))、バルガンシクロビル(VALCYTE(登録商標))、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジン(viramidine)、ザルシタビン、ザナミビル(RELENZA(登録商標))、ならびにジドブジン(アジドミジン(AZT)、RETROVIR(登録商標)、RETROVIS(登録商標))が挙げられるが、これらに限定されない。
真菌感染に関連した状態 真菌感染に関連した疾患、障害、または状態には、アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、ヒストプラズマ症、菌腫、パラコクシジオイデス症、および足白癬が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、免疫不全を有する人は、アスペルギルス、カンジダ、クリプトコッカス(Cryptoccocus)、ヒストプラズマ、およびニューモシスチス等の真菌属による疾患に特に罹患しやすい。他の真菌は眼、爪、髪、および特に皮膚を攻撃し得る、いわゆる皮膚糸状真菌(dermatophytic fungi)および好角質性真菌と呼ばれ、それは足部白癬等の環蠕虫が一般的である多様な状態を引き起こす。菌類胞子もまた、アレルギーの主要な原因であり、異なる分類群からの幅広い真菌が、一部の人々にアレルギー反応を誘起し得る。
真菌性病原体 真菌性病原体には、子嚢菌門(例えば、フザリウムオキシスポルム、ニューモシスチス・ジロベシ、アスペルギルス属、コクシジオイデス・イミチス/ポサダシ、カンジダ・アルビカンス)、担子菌門(例えば、フィロバジエラ・ネオフォルマンス、トリコスポロン)、微胞子虫門(例えば、エンセファリトゾーン・クニクリ、エンテロシトゾーン・ビエヌーシ)、およびケカビ亜門(例えば、ムコール・シルシネロイデス(Mucor circinelloides)、リゾプス・オリーゼ、Lichtheimia corymbifera)が挙げられるが、これらに限定されない。
抗真菌剤 例示の抗真菌剤には、ポリエン抗真菌薬(例えば、ナタマイシン、リモシジン(rimocidin)、フィリピン、ナイスタチン、アンホテリシンB、カンジシン(candicin)、ハマイシン)、イミダゾール抗真菌薬(例えば、ミコナゾール(MICATIN(登録商標)、DAKTARIN(登録商標))、ケトコナゾール(NIZORAL(登録商標)、FUNGORAL(登録商標)、SEBIZOLE(登録商標))、クロトリマゾール(LOTRIMIN(登録商標)、LOTRIMIN(登録商標)AF、CANESTEN(登録商標))、エコナゾール、オモコナゾール、ビホナゾール、ブトコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール(ERTACZO(登録商標))、スルコナゾール、チオコナゾール)、トリアゾール抗真菌薬(例えば、アルバコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、イサブコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール、テルコナゾール)、チアゾール抗真菌薬(例えば、アバファンギン(abafungin))、アリルアミン(例えば、テルビナフィン(LAMISIL(登録商標))、ナフチフィン(NAFTIN(登録商標))、ブテナフィン(LOTRIMIN(登録商標)ウルトラ)、エキノキャンディン(例えば、アニデュラファンギン、カスポファンギン、ミカファンギン)、およびその他(例えば、ポリゴジアール、安息香酸、シクロピロックス、トルナフテート(TINACTIN(登録商標)、DESENEX(登録商標)、AFTATE(登録商標))、ウンデシレン酸、フルシトシンまたは5−フルオロシトシン、グリセオフルビン、ハロプロジン、炭酸水素ナトリウム、アリシン)が挙げられるが、これらに限定されない。
原虫感染に関連した状態 原虫感染に関連した疾患、障害、または状態には、アメーバ症、ジアルジア症、トリコモナス症、アフリカ睡眠病、アメリカ睡眠病、リーシュマニア症(カラアザール)、バランチジウム症、トキソプラズマ症、マラリア、アカントアメーバ角膜炎、およびバベシア症が挙げられるが、これらに限定されない。
原虫病原体 原虫性病原体には、赤痢アメーバ、ランブル鞭毛虫(Giardia lambila)、腟トリコモナス、トリパノソーマ・ブルセイ、クルーズトリパノソーマ、ドノバンリーシュマニア、大腸バランチジウム、トキソプラズマ・ゴンディ、プラスモジウム属、およびネズミバベシアが挙げられるが、これらに限定されない。
抗原虫剤 例示の抗原虫剤には、エフロールニチン、フラゾリドン(FUROXONE(登録商標)、DEPENDAL−M(登録商標))、メラルソプロール、メトロニダゾール(FLAGYL(登録商標))、オルニダゾール、パロモマイシン硫酸塩(HUMATIN(登録商標))、ペンタミジン、ピリメタミン(DARAPRIM(登録商標))、およびチニダゾール(TINDAMAX(登録商標)、FASIGYN(登録商標))が挙げられるが、これらに限定されない。
寄生虫感染に関連した状態 寄生虫感染に関連した疾患、障害、または状態には、アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、ベイリスアスカリス症(baylisascariasis)、シャガス病、肝吸虫症、コクリオミイヤ、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮病、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、横川吸虫症、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、施毛虫症、および鞭虫症が挙げられるが、これらに限定されない。
寄生虫性病原体 寄生虫性病原体には、アカントアメーバ、アニサキス、回虫、ウシバエ、大腸バランチジウム、南京虫、条虫、恙虫、コクリオミイヤ・ホミニボラキス(Cochliomyia hominivorax)、赤痢アメーバ、肝蛭ランブル鞭毛虫、鉤虫、リーシュマニア、鼻腔舌虫、肝吸虫、ロア糸状虫、肺吸虫、蟯虫、熱帯熱マラリア原虫、住血吸虫、糞線虫、ダニ、サナダムシ、トキソプラズマ原虫、トリパノソーマ、鞭虫、バンクロフト糸状虫が挙げられるが、これらに限定されない。
抗寄生虫剤 例示の抗寄生虫剤には、抗線虫薬(antinematodes)(例えば、メベンダゾール、ピランテルパモ酸塩、チアベンダゾール、ジエチルカルバマジン、イベルメクチン)、抗条虫薬(anticestodes)(例えば、ニクロサミド、プラジカンテル、アルベンダゾール)、抗吸虫薬(antitrematodes)(例えば、プラジカンテル)、抗アメーバ薬(antiamoebics)(例えば、リファンピン、アンホテリシンB)、および抗原虫薬(例えば、メラルソプロール、エフロールニチン、メトロニダゾール、チニダゾール)が挙げられるが、これらに限定されない。
プリオン感染に関連した状態 プリオン感染に関連した疾患、障害、または状態には、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、医原性クロイツフェルト・ヤコブ病(iCJD)、異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vCJD)、家族性クロイツフェルト・ヤコブ病(fCJD)、孤発性クロイツフェルト・ヤコブ病(sCJD)、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、クールー病、スクラピー、ウシ海綿状脳症(BSE)、狂牛病、伝達性ミンク脳症(TME)、慢性消耗病(CWD)、ネコ海綿状脳症(FSE)、外来性有蹄類脳症(EUE)、および海綿状脳症が挙げられるが、これらに限定されない。
抗プリオン剤 例示の抗プリオン剤には、フルピルチン、ペントサンポリ硫酸(pentosan polysuphate)、キナクリン、およびテトラ環状化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
免疫応答の調節 免疫応答の回避(avoidance) 本明細書に記載されるように、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの有用な特長は、細胞の自然免疫応答を低減させるか、逃れるか、または回避する能力である。一態様において、細胞に送達されるとき、参照化合物、例えば、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNA、または本発明の異なるポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNAに対応する未修飾ポリヌクレオチドによって誘起される応答と比較して、低減された宿主からの免疫応答をもたらす、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが本明細書に提供される。本明細書で使用されるとき、「参照化合物」は、哺乳動物に投与されるとき、既知の程度、レベル、または量の免疫刺激を有する自然免疫応答をもたらす任意の分子または物質である。参照化合物は、核酸分子である必要はなく、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのいずれかである必要もない。よって、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAによる免疫応答の誘起の回避(avoidance)、回避(evasion)、または失敗の測定は、そのような応答を誘起することが知られている任意の化合物または物質と比較することで示され得る。
「自然免疫応答」という用語は、一般的にはウイルス起源または細菌起源の外因性一本鎖核酸に対する細胞応答を含み、これは、サイトカイン、特にインターフェロンの発現および放出、ならびに細胞死の誘導を含む。本明細書で使用されるとき、自然免疫応答またはインターフェロン応答は、サイトカイン発現、サイトカイン放出、タンパク質合成の全般的阻害、細胞RNAの全般的破壊、主要な組織適合性分子の上方制御、および/またはアポトーシス死の誘導、アポトーシス、抗成長、ならびに自然および適応免疫細胞活性化に関与する遺伝子の遺伝子転写の誘導を引き起こす単細胞レベルで機能する。I型IFNによって誘導されるいくつかの遺伝子には、PKR、ADAR(RNAに作用するアデノシンデアミナーゼ)、OAS(2’,5’−オリゴアデニル酸シンテターゼ)、RNase L、およびMxタンパク質が挙げられる。PKRおよびADARは、それぞれ、翻訳開始およびRNA編集の阻害をもたらす。OASは、ssRNAを分解するためのエンドリボヌクレアーゼRNase Lを活性化するdsRNA依存性シンテターゼである。
いくつかの実施形態において、自然免疫応答は、I型またはII型インターフェロンの発現を含み、そのI型またはII型インターフェロンの発現は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAと接触していない細胞からの参照と比較して2倍を超えては増加されない。
いくつかの実施形態において、自然免疫応答は、1つ以上のIFNシグネチャー遺伝子の発現を含み、その1つ以上のIFNシグネチャー遺伝子は、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAと接触していない細胞からの参照と比較して3倍を超えては増加しない。
いくつかの状況では、細胞内の自然免疫応答を排除することは利益であり得るが、本発明は、投与すると、そのような応答を完全には排除することなく、実質的に低減された(著しく低い)インターフェロンシグナル伝達を含む免疫応答をもたらすポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAを提供する。
いくつかの実施形態において、免疫応答は、参照化合物に誘導される免疫応答と比較して10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%、または99.9%超低い。免疫応答自体は、1型インターフェロンの発現または活性のレベル、またはトール様受容体(例えば、TLR7およびTLR8)等のインターフェロン制御遺伝子の発現を決定することにより測定され得る。自然免疫応答の低減は、細胞集団への1つ以上の投与に従って減少された細胞死のレベルを測定することによっても測定され得る。例えば、細胞死は、参照化合物で観察された細胞死頻度よりも10%、25%、50%、75%、85%、90%、95%、または95%超少ない。さらに、細胞死は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAと接触した細胞の50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%、または0.01%未満に影響し得る。
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、同じ配列を有する未修飾インビトロ合成RNA分子ポリヌクレオチドもしくは一次構築物、または参照化合物よりも著しく低い免疫原性である。本明細書で使用されるとき、「著しく低い免疫原性」とは、免疫原性の検出可能な減少を指す。別の実施形態では、本用語は、免疫原性における倍数減少を指す。別の実施形態において、本用語は、有効量のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが検出可能な免疫応答を誘起することなく投与され得るような減少を指す。別の実施形態において、本用語は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが、組換えタンパク質の発現を検出可能に低減させるのに十分な免疫応答を誘発することなく繰り返し投与され得るような減少を指す。別の実施形態において、この減少は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが、組換えタンパク質の検出可能な発現を排除するのに十分な免疫応答を誘発することなく繰り返し投与され得るような減少である。
別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、その未修飾対応物または参照化合物よりも2倍低い免疫原性である。別の実施形態において、免疫原性は、3倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、5倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、7倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、10倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、15倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、ある倍数だけ低減する。別の実施形態において、免疫原性は、50倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、100倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、200倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、500倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、1000倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、2000倍低減する。別の実施形態において、免疫原性は、別の倍数だけ低減する。
免疫原性を決定する方法は、当技術分野でよく知られており、例えば、サイトカイン(例えば、IL−12、IFNα、TNF−α、RANTES、MIP−1αもしくはβ、IL−6、IFN−β、またはIL−8)の分泌を測定すること、DC活性化マーカー(例えば、CD83、HLA−DR、CD80、およびCD86)の発現を測定すること、または適応免疫応答のアジュバントとして作用する能力を測定すること、が挙げられる。
本明細書で教示される修飾の組み合わせを含む本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、それらを治療法としてより好適にする優れた特性を有し得る。
当技術分野における「全か無か」のモデルは、修飾mRNAの治療有用性に関連した生物学的現象を説明するのにひどく不十分であることが確定されている。本発明者らは、タンパク質産生を改善するためには、特定の修飾mRNAの効果およびリスクプロファイルを判定するように、修飾もしくは修飾の組み合わせの性質、修飾の割合(%)を考慮し、1つを超えるサイトカインもしくは測定基準を検査し得ることを確認した。
本発明の一態様において、未修飾と比較して修飾mRNAの有効性を決定する方法は、その発現が本発明の外因性核酸の投与によって誘起される1つ以上のサイトカインの測定および分析を含む。これらの値は、未修飾核酸の投与と、またはサイトカイン応答、ポリIC、R−848等の標準的な測定基準もしくは当技術分野で既知の他の標準と比較される。
本明細書で開発される標準的な測定基準の1つの例は、細胞、組織、または生物内で産生されるコードされたポリペプチド(タンパク質)のレベルまたは量の、修飾核酸の投与または修飾核酸との接触の結果として、その発現が細胞、組織、または生物内で誘起されるサイトカインの1つ以上のレベルまたは量(またはパネル)に対する比率の測定である。そのような比率は、本明細書において、タンパク質:サイトカイン比または「PC」比と称される。PC比が高いほど、修飾核酸(測定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド)の効果がより高い。本発明のサイトカインによる好ましいPC比は、1を超える、10を超える、100を超える、1000を超える、10,000を超える、またはそれ以上であり得る。異なるまたは未修飾の構築物の修飾核酸よりも高いPC比を有する修飾核酸が、好ましい。
PC比は、ポリヌクレオチドに存在する修飾の割合(%)によってさらに評価され得る。例えば、100%修飾された核酸に対して正規化され、サイトカイン(もしくはリスク)の機能またはサイトカインプロファイルとしてのタンパク質産生が、判定され得る。
一実施形態において、本発明は、修飾核酸(ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA)のPC比を比較することで、化学、サイトカイン、または修飾の割合(%)にわたって、任意の特定の修飾ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの相対的効果を決定するための方法を提供する。
増加したタンパク質産生および減少した免疫刺激可能性を維持する、様々なレベルの核酸塩基置換を含有するmmRNAが産生され得る。任意の修飾ヌクレオチドのその天然に生じるヌクレオチド対応物に対する相対的割合(%)は、IVT反応中に変化し得る(例えば、100、50、25、10、5、2.5、1、0.1、0.01%の5メチルシチジン使用対シチジン;100、50、25、10、5、2.5、1、0.1、0.01%のシュードウリジンまたはN1−メチル−シュードウリジン使用対ウリジン)。また、2つ以上の異なるヌクレオチドを同じ塩基に対して使用することによる異なる比率(例えば、シュードウリジンおよびN1−メチル−シュードウリジンの異なる比率)を利用するmmRNAを作製することもできる。mmRNAは、同時に、5メチルシチジン/シチジンおよびシュードウリジン/N1−メチル−シュードウリジン/ウリジンの比率等の1つを超える「塩基」位置における混合した比率で作製されることもできる。修飾ヌクレオチドの変化した比率で修飾mRNAを使用することは、化学的修飾ヌクレオチドへの可能な曝露の低減において、有益であり得る。最後に、タンパク質産生もしくは免疫刺激可能性のいずれか、またはその両方を調節するmmRNAへの修飾ヌクレオチドの位置的な導入もまた可能である。これらの改善された特性を実証するそのようなmmRNAの能力を、(本明細書に記載のPBMCアッセイ等のアッセイを用いて)インビトロで評価することができ、また、mmRNAでコードされたタンパク質の産生およびサイトカイン等の自然免疫認識のメディエーターの両方の測定を通してインビボで評価することもできる。
別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAと、その未修飾対応物との相対的免疫原性は、未修飾ヌクレオチドまたは参照化合物の所与の量と同じ程度の上記応答のうちの1つを誘発するのに必要とされるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの量を決定することによって、決定することができる。例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAよりも2倍多いポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが同じ応答を誘発するために必要とされる場合、そのポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、未修飾ヌクレオチドまたは参照化合物よりも2倍低い免疫原性である。
別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAと、その未修飾対応物との相対的免疫原性は、同じ量の未修飾ヌクレオチドまたは参照化合物に対するポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの投与に応じて分泌されるサイトカイン(例えば、IL−12、IFNα、TNF−α、RANTES、MIP−1αもしくはβ、IL−6、IFN−β、またはIL−8)の量を決定することによって、決定される。例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの2分の1のサイトカインが分泌される場合、そのポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、未修飾ヌクレオチドよりも2倍低い免疫原性である。別の実施形態において、刺激のバックグラウンドレベルは、上記の方法において免疫原性を算出する前に減算する。
細胞内、または細胞の集団における免疫応答の滴定、低減、または排除を実施するための方法がまた本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、細胞は異なる用量の同じポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAと接触させられ、用量応答が評価される。いくつかの実施形態において、細胞は、同じまたは異なる用量でいくつかの異なるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAと接触させられ、所望の効果をもたらすための最適な組成物を決定する。免疫応答に関して、所望の効果は、細胞の免疫応答を回避すること、逃れること、または低減させることであり得る。所望の効果は、タンパク質産生の効率を変化させることでもあり得る。
本発明のポリヌクレオチド、一時構築物および/またはmmRNAは、参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開第WO2013003475号に記載の方法を用いて免疫応答を低減するために使用されてもよい。
免疫応答の活性化:ワクチン さらに、ある特定の修飾ヌクレオシド、またはその組み合わせは、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAに導入されると、自然免疫応答を活性化する。そのような活性化分子は、ポリペプチドおよび/または他のワクチンと組み合わせられる場合、アジュバントとして有用である。ある特定の実施形態において、活性化分子は、ワクチンとして有用であるポリペプチド配列をコードする翻訳可能領域を含有し、このようにして、自己アジュバントとなる能力を提供する。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、免疫原をコードし得る。免疫原をコードするポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAの送達は、免疫応答を活性化し得る。非限定的な例として、免疫原をコードするポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、複数の自然応答経路を誘起するように細胞へ送達され得る(参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012006377号を参照のこと)。別の非限定的な例として、免疫原をコードする本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、脊椎動物に対する免疫原性となるのに十分に大きい投与量で脊椎動物に送達され得る(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012006372号および同第WO2012006369号を参照のこと)。
本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、ワクチンのためのポリペプチド配列をコードし得、それは阻害剤をさらに含んでもよい。阻害剤は、抗原提示を損なうか、および/または当技術分野で既知の様々な経路を阻害し得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、抗原提示を損なうことができる阻害剤と組み合わせてワクチンに使用されてもよい(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012089225号および同第WO2012089338号を参照のこと)。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、自己複製RNAであり得る。自己複製RNA分子は、RNA送達の効率および封入された遺伝子産物の発現を向上させることができる。一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、本明細書に記載され、かつ/または当技術分野で既知の少なくとも1つの修飾を含み得る。一実施形態において、自己複製RNAは、自己複製RNAが感染性ウイルス粒子の産生を誘導しないように設計され得る。非限定的な例として、自己複製RNAは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第US20110300205号および国際公開第WO2011005799号に記載の方法によって設計されてもよい。
一実施形態において、本発明の自己複製ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、免疫応答を生じさせ得るタンパク質をコードし得る。非限定的な例として、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、少なくとも1つの抗原をコードし得る自己複製mRNAであり得る(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第US20110300205号、ならびに国際公開第WO2011005799号、同第WO2013006838号、および同第WO2013006842号を参照のこと)。
一実施形態において、本発明の自己複製ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、本明細書に記載されるか、または当技術分野で既知の方法を用いて製剤化することができる。非限定的な例として、自己複製RNAは、Geall et al(Nonviral delivery of self−amplifying RNA vaccines,PNAS 2012;PMID:22908294)に記載の方法によって送達用に製剤化されてもよい。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、両親媒性および/または免疫原性の両親媒性ペプチドをコードし得る。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの製剤は、両親媒性および/または免疫原性の両親媒性ペプチドをさらに含んでもよい。非限定的な例として、両親媒性および/または免疫原性の両親媒性ペプチドを含むポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第US20110250237号、ならびに国際公開第WO2010009277号および同第WO2010009065号に記載されるように製剤化されてもよい。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、免疫刺激性であり得る。非限定的な例として、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、陽性センスまたは陰性センス鎖RNAウイルスゲノムのすべてまたは一部をコードし得る(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012092569号および米国公開第US20120177701号を参照のこと)。別の非限定的な例において、本発明の免疫刺激性ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、本明細書に記載され、かつ/または当技術分野で既知の投与用賦形剤を用いて製剤化されてもよい(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012068295号および米国公開第US20120213812号を参照のこと)。
一実施形態において、本明細書に記載の方法によって製剤化されたワクチンの応答は、治療的効果を誘導するための様々な化合物の添加によって向上され得る。非限定的な例として、ワクチン製剤は、MHCII結合ペプチドまたはMHCII結合ペプチドと類似の配列を有するペプチドを含んでもよい(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012027365号、同第WO2011031298号、および米国公開第US20120070493号、同第US20110110965号を参照のこと)。別の例として、ワクチン製剤は、対象においてニコチン残基に対する抗体応答を生成し得る修飾ニコチン化合物を含んでもよい(各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012061717号および米国公開第US20120114677号を参照のこと)。
天然に生じる変異体 別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAを用いて、増加した生物学的活性、改善された患者予後、または保護機能等を含む、改善された疾患修飾活性を有する天然に生じるタンパク質の変異形を発現することができる。多くのそのような修飾遺伝子が、哺乳動物において記載されている(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Nadeau,Current Opinion in Genetics&Development 2003 13:290−295;Hamilton and Yu,PLoS Genet.2012;8:e1002644;Corder et al.,Nature Genetics 1994 7:180−184)。ヒトにおける例には、アポE2タンパク質、アポA−I変異形タンパク質(アポA−I Milano、アポA−I Paris)、機能亢進性第IX因子タンパク質(第IX因子Padua Arg338Lys)、トランスサイレチン変異体(TTR Thr119Met)が挙げられる。アポE2(cys112、cys158)の発現は、アルツハイマー病および心血管疾患等の可能性のある他の状態に対する易罹患性を低減することによって、他のアポEアイソフォーム(アポE3(cys112、arg158)およびアポE4(arg112、arg158))と比較して保護を与えることが示されている(すべてが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Corder et al.,Nature Genetics 1994 7:180−184、Seripa et al.,Rejuvenation Res.2011 14:491−500、Liu et al.Nat Rev Neurol.2013 9:106−118)。アポA−I変異形の発現は、低減されたコレステロールを伴った(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、deGoma and Rader,2011 Nature Rev Cardiol 8:266−271、Nissen et al.,2003 JAMA 290:2292−2300)。ある特定の集団におけるアポA−Iのアミノ酸配列は、アポA−I Milanoにおいて(Arg173がCysに変更された)、およびアポA−I Parisにおいて(Arg151がCysに変更された)、システインに変更された。位置R338L(FIX Padua)における第IX因子突然変異は、約10倍に増加された活性を有する第IX因子タンパク質をもたらす(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Simioni et al.,N Engl J Med.2009 361:1671−1675、Finn et al.,Blood.2012 120:4521−4523、Cantore et al.,Blood.2012 120:4517−20)。位置104または119(Arg104His、Thr119Met)におけるトランスサイレチンの突然変異は、疾患をもたらすVal30Met突然変異も有する患者に保護を提供することも示されている(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Saraiva,Hum Mutat.2001 17:493−503、DATA BASE ON TRANSTHYRETIN MUTATIONS http://www.ibmc.up.pt/mjsaraiva/ttrmut.html)。それぞれ、Met119およびHis104突然変異体を有するポルトガル人および日本人のMet30患者における臨床所見および症状の重症度の差異が、分子にさらなる安定性を与える非病原性変異体によって発現される明らかな保護作用を伴い観察される(すべてが参照により全体が本明細書に組み込まれる、Coelho et al.1996 Neuromuscular Disorders(Suppl)6:S20、Terazaki et al.1999.Biochem Biophys Res Commun 264:365−370)。これらの保護TTR対立遺伝子をコードする修飾mRNAは、TTRアミロイド症患者において発現され得、それにより病原性変異体TTRタンパク質の効果を低減させる。
主溝相互作用パートナー 本明細書に記載されるように、「主溝相互作用パートナー」という表現は、ヌクレオチドまたは核酸の主溝の面との相互作用、例えば結合を通して、RNAリガンドを検出し、それに応答するRNA認識受容体を指す。したがって、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA等の修飾ヌクレオチドまたは核酸を含むRNAリガンドは、主溝結合パートナーとの相互作用を減少させ、ゆえに、自然免疫応答を減少させる。
例示の主溝相互作用、例えば結合パートナーには、以下のヌクレアーゼおよびヘリカーゼを含むが、これらに限定されない。膜内において、TLR(トール様受容体((Toll−like Receptor))3、7、および8は、一本鎖および二重鎖RNAに応答することができる。細胞質内において、DEX(D/H)ヘリカーゼおよびATPアーゼのスーパーファミリー2クラスのメンバーは、抗ウイルス応答を開始するRNAを感知することができる。これらのヘリカーゼには、RIG−I(レチノイン酸誘導性遺伝子(retinoic acid−inducible gene)I)およびMDA5(メラノーマ分化関連遺伝子(melanoma differentiation−associated gene)5)を含む。他の例には、遺伝学と生理学の研究所(laboratory ofgenetics and physiology)2(LGP2)、HIN−200ドメイン含有するタンパク質、またはヘリカーゼドメイン含有タンパク質が挙げられる。
病原性生物または疾患細胞の標的化 細胞増殖抑制性または細胞傷害性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを用いて、細菌、酵母、原虫、蠕虫等の病原性微生物または癌細胞等の疾患細胞を標的化するための方法が本明細書に提供される。好ましくは、導入されるmRNAは、治療の見込まれるオフターゲット効果を低減させるために、標的病原性生物において排他的または優先的に翻訳された修飾ヌクレオシドまたは他の核酸配列修飾を含む。そのような方法は、血液、精液、卵子、ならびに胚、組織、および器官を含む移植材料を含む任意の生体材料で見られる病原性生物を除去するか、または疾患細胞を死滅させるのに有用である。
バイオプロセシング 本明細書に提供される方法は、細胞培養プロセスにおけるタンパク質産物収率を向上させるのに有用であり得る。複数の宿主細胞を含有する細胞培養において、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの導入は、対応する未修飾核酸と比べて増加したタンパク質産生効率をもたらす。そのような増加したタンパク質産生効率は、例えば、増加した細胞トランスフェクション、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAからの増加したタンパク質翻訳、減少した核酸分解、および/または低減された宿主細胞の自然免疫応答を示すことによって実証することができる。タンパク質産生は酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって測定することができ、タンパク質活性は当技術分野で既知の様々な機能的アッセイによって測定することができる。タンパク質産生は、連続的または流加(batch−fed)哺乳類プロセスにおいて生成され得る。
さらに、潜在的対象の細胞株または細胞株の収集物において、特定のポリペプチド、特に既知の活性を有する参照タンパク質のタンパク質変異形等の目的とするポリペプチドの発現を最適化することは有用である。一実施形態において、複数の標的細胞型を提供することによって、および独立して、その複数の標的細胞型のそれぞれと目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAとを接触させることによって、標的細胞において目的とするポリペプチドの発現を最適化する方法が提供される。細胞は、同時にまたは順次に、2つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAでトランスフェクトされ得る。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の方法の複数ラウンドを用いて、目的とする1つ以上の核酸またはタンパク質の増加した発現を有する細胞を得ることができる。例えば、細胞は、目的とする核酸またはタンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAでトランスフェクトされてもよい。細胞は、再び単離される前に目的とする核酸またはタンパク質をコードする1つ以上の他の核酸によるトランスフェクションのさらなるラウンドに供される前に、本明細書に記載の方法に従って単離されてもよい。この方法は、タンパク質の複合体、同じまたは関連する生体経路中の核酸またはタンパク質、互いの上流または下流で作用する核酸またはタンパク質、互いに調節、活性化、または抑制機能を有する核酸またはタンパク質、機能または活性に関して互いに依存する核酸またはタンパク質、あるいは相同性を共有する核酸またはタンパク質の増加した発現を有する細胞を生成するのに有用であり得る。
さらに、培養条件を変化させ、タンパク質産生効率を増加させることができる。続いて、複数の標的細胞型における目的とするポリペプチドの存在および/またはレベルを検出および/または定量し、ポリペプチドの発現に関する効率的な標的細胞および細胞培養条件の選択により、その最適化を可能にする。そのような方法は、しばしば効率的なタンパク質産生を複雑化する状況である、ポリペプチドが1つ以上の翻訳後修飾を含有するか、または実質的な三次構造を有する場合に、特に有用である。
一実施形態において、本発明の方法で用いられる細胞は、培養され得る。細胞は、懸濁液中で、または接着培養物として培養され得る。細胞は、バイオリアクター、細胞バッグ、ウェーブバッグ、培養プレート、フラスコ、および当業者に周知の他の容器を含むが、これらに限定されない、様々な容器内で培養され得る。細胞は、IMDM(Invitrogen、カタログ番号12440−53)または既知組成培地配合物を含む、これらに限定されない任意の他の好適な培地内で培養され得る。また、温度や大気組成等の細胞培養に好適な周囲条件は、当業者によく知られている。本発明の方法は、タンパク質産生に使用するのに好適な任意の細胞で使用することができる。
本発明は、例えば、インビトロ、エクスビボ、インサイツ、またはインビボで修飾核酸の標的細胞集団への反復導入(例えば、トランスフェクション)を提供する。例えば、同じ細胞集団への接触が、1回以上(2、3、4、5、または5回を超える等)反復され得る。いくつかの実施形態において、細胞集団をポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAと接触するステップは、細胞集団におけるタンパク質翻訳の既定の効率を達成するのに十分であるように数回反復される。標的細胞集団の頻繁に低減された細胞傷害性を核酸修飾によって提供したと仮定すると、本明細書に提供されるように、反復トランスフェクションが多様な一連の細胞型において、および多様な組織内で達成可能である。
一実施形態において、本発明のバイオプロセシング方法を用いて、抗体またはその機能的断片を産生することができる。機能的断片は、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fvドメイン、scFv、または二特異性抗体を含み得る。それらは、相補性決定領域(CDR)を含む任意の領域において可変であり得る。一実施形態において、CDR3領域には完全な多様性がある。別の実施形態において、抗体は、CDR3領域内を除いて実質的に保存される。
起源がヒト病原性であるか非ヒトであるかにかかわらず、任意の生体分子に結合するか、またはそれに会合する抗体が作製され得る。病原体は、非ヒト哺乳動物、臨床標本、または化粧品または医薬品材料等の市販製品に存在し得る。それらは、臨床標本または任意の生物からの組織試料を含む任意の標本または試料にも結合し得る。
いくつかの実施形態において、接触ステップは、6時間時間、12時間、24時間、36時間、48時間、72時間、84時間、96時間、および108時間からなる群から選択される頻度で、ならびに20nM未満、50nM未満、80nM未満、または100nM未満の濃度で、複数回反復される。組成物は、1mM未満、5mM未満、10mM未満、100mM未満、または500mM未満でも投与され得る。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、細胞当たり50分子、100分子/細胞、200分子/細胞、300分子/細胞、400分子/細胞、500分子/細胞、600分子/細胞、700分子/細胞、800分子/細胞、900分子/細胞、1000分子/細胞、2000分子/細胞、または5000分子/細胞の量で添加される。
他の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、0.01fmol/106細胞、0.1fmol/106細胞、0.5fmol/106細胞、0.75fmol/106細胞、1fmol/106細胞、2fmol/106細胞、5fmol/106細胞、10fmol/106細胞、20fmol/106細胞、30fmol/106細胞、40fmol/106細胞、50fmol/106細胞、60fmol/106細胞、100fmol/106細胞、200fmol/106細胞、300fmol/106細胞、400fmol/106細胞、500fmol/106細胞、700fmol/106細胞、800fmol/106細胞、900fmol/106細胞、および1pmol/106細胞からなる群から選択される濃度で添加される。
いくつかの実施形態において、そこでの生体産物の産生は、細胞密度、pH、酸素レベル、グルコースレベル、乳酸レベル、温度、およびタンパク質産生からなる群から選択されるパラメータ等の1つ以上の測定可能なバイオプロセスパラメータを監視することによって検出される。タンパク質産生を比生産性(SP)(溶液中で非相同的に発現されるポリペプチド等の産物の濃度)として測定することができ、mg/Lまたはg/Lで示すことができ、別の方法として、比生産性をpg/細胞/日で示してもよい。SPの増加は、2つの既定の条件下(例えば、修飾mRNA(複数可)で処理されていない対照と比較した場合)で産生される産物の濃度の絶対的または相対的増加を指すことができる。
細胞 一実施形態において、細胞は、哺乳類細胞、細菌性細胞、植物、微生物、藻類および真菌細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ウサギ、ハムスター、またはウシ細胞等であるが、これらに限定されない、哺乳類細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、HeLa、NS0、SP2/0、KEK 293T、Vero、Caco、Caco−2、MDCK、COS−1、COS−7、K562、ジャーカット、CHO−K1、DG44、CHOK1SV、CHO−S、Huvec、CV−1、Huh−7、NIH3T3、HEK293、293、A549、HepG2、IMR−90、MCF−7、U−20S、Per.C6、SF9、SF21、またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が挙げられるが、これらに限定されない株化細胞に由来し得る。
ある特定の実施形態において、細胞は、クリソスポリウム細胞、アスペルギルス細胞、トリコデルマ細胞、ディクチオステリウム細胞、カンジダ細胞、サッカロミセス細胞、シゾサッカロミセス細胞、およびペニシリウム細胞等であるが、これらに限定されない、真菌細胞である。
ある特定の実施形態において、細胞は、大腸菌、枯草菌、またはBL21細胞等であるが、これらに限定されない、細菌性細胞である。本発明の方法によってトランスフェクトされる一次および二次細胞を多様な組織から得ることができ、培養下で維持され得るすべての細胞型を含むが、これらに限定されない。例えば、本発明の方法によってトランスフェクトされ得る一次および二次細胞には、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞(例えば、乳腺上皮細胞、腸上皮細胞)、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の形成要素(例えば、リンパ球、骨髄細胞)、筋肉細胞、およびこれらの体細胞型の前駆体が挙げられるが、これらに限定されない。また、一次細胞を同種または別の種(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウマ)の供与体から得ることもできる。
精製および単離 当業者であれば、培養細胞から目的とするタンパク質を精製または単離するために使用する方法を決定できるはずである。一般に、これは、親和性結合または非親和性精製を使用する捕獲法を通して行われる。目的とするタンパク質が培養細胞によって分泌されない場合、次いで、精製または単離の前に培養細胞の溶解が行われるべきである。本発明中の細胞培養培地構成成分ならびに消泡化合物および他の栄養剤および栄養補助剤等の細胞培養添加物、細胞、細胞残屑、宿主細胞タンパク質、DNA、ウイルス等とともに目的とするタンパク質を含有する清浄にされていない細胞培養液を用いてもよい。プロセスは、バイオリアクター自体において行われ得る。流体は、pH、温度、もしくは他の刺激特徴等の所望の刺激に予め調整されるか、もしくは流体は、ポリマー(複数可)の添加に応じて調整されるかのいずれかであってもよく、またはポリマー(複数可)が、ポリマーを流体中で可溶化するために必要とされる刺激条件に必要なパラメータに適正に調整された担体液体に添加されてもよい。流体を用いてポリマーを完全に循環させることができ、次いで、刺激を適用し(pH、温度、塩濃度等の変化)、所望のタンパク質およびポリマー(複数可)沈殿物を溶液中から取り出すことができる。ポリマーおよび所望のタンパク質(複数可)を残りの流体から分離することができ、任意に1回以上洗浄し、任意の捕捉された、または緩く結合された混入物質を除去してもよい。次いで、所望のタンパク質が、例えば溶出等によってポリマー(複数可)から回収される。好ましくは、溶出は、所望のタンパク質の選択された溶出中、ポリマーがその沈殿形態中に残存し、任意の不純物をそこに保持するような条件下で行われ得る。ポリマーおよびタンパク質ならびに任意の不純物は、水または緩衝液等の新たな流体中に可溶化されてもよく、タンパク質は、ポリマーまたは不純物のものを上回るタンパク質の優先性および選択性を有する親和性、イオン交換、疎水性、またはいくつかの他の種類のクロマトグラフィー等によって回収され得る。次いで、溶出されたタンパク質が回収され、適切な場合、バッチ様(batch like)ステップまたは連続フロースルーステップのいずれかのさらなるプロセシングステップに供され得る。
別の実施形態において、潜在的対象の細胞株または細胞株の収集物において、特定のポリペプチド、特に既知の活性を有する参照タンパク質のタンパク質変異形等の目的とするポリペプチドの発現を最適化することは有用であり得る。一実施形態において、複数の標的細胞型を提供することによって、および独立して、その複数の標的細胞型のそれぞれとポリペプチドをコードする修飾mRNAとを接触させることによって、標的細胞において目的とするポリペプチドの発現を最適化する方法が提供される。さらに、培養条件を変化させ、タンパク質産生効率を増加させることができる。続いて、複数の標的細胞型における目的とするポリペプチドの存在および/またはレベルを検出および/または定量し、目的とするポリペプチドの発現に関する効率的な標的細胞および細胞培養条件の選択により、その最適化を可能にする。そのような方法は、しばしば効率的なタンパク質産生を複雑化する、目的とするポリペプチドが1つ以上の翻訳後修飾を含有するか、または実質的な三次構造を有する場合に、有用であり得る。
タンパク質回収 目的とするタンパク質は、好ましくは、分泌されるポリペプチドとして培養培地から回収され得るか、または分泌シグナルを伴わずに発現される場合、宿主細胞ライセートから回収され得る。目的とするタンパク質の実質的に均一の調節物が得られる方法で、目的とするタンパク質を他の組換えタンパク質および宿主細胞タンパク質から精製しなければならない場合がある。細胞および/または粒状細胞残屑は、培養培地またはライセートから除去され得る。次いで、例えば、免疫親和性またはイオン交換カラム上の分画、エタノール沈殿、逆相HPLC(RP−HPLC)、SEPHADEX(登録商標)クロマトグラフィー、シリカ上またはDEAE等のカチオン交換樹脂上でのクロマトグラフィーによって、目的とする産物を混入物質可溶性タンパク質、ポリペプチドおよび核酸から精製することができる。宿主細胞によって非相同的に発現されるタンパク質の精製方法は、当技術分野でよく知られている。
本明細書に記載の方法および組成物を用いて、哺乳類対象において、内因性アゴニスト生物応答を減弱するか、もしくは遮断する、および/または受容体もしくはシグナル伝達分子を拮抗することができるタンパク質を産生することができる。例えば、IL−12およびIL−23受容体シグナル伝達が、多発性硬化症等の慢性自己免疫障害ならびに関節リウマチ、乾癬、狼瘡エリテマトーデス、強直性脊椎炎、およびクローン病(Chron’s disease)等の炎症性疾患において増強され得る(Kikly K,Liu L,Na S,Sedgwich JD(2006)Cur.Opin.Immunol.18(6):670−5)。別の実施形態において、核酸は、ケモカイン受容体のアンタゴニストをコードする。ケモカイン受容体CXCR−4およびCCR−5が、HIVが宿主細胞内に進入するために必要とされる(Arenzana−Seisdedos F et al,(1996)Nature.Oct 3;383(6599):400)。
遺伝子サイレンシング 本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、細胞集団における1つ以上の標的遺伝子の発現を発現停止させる(すなわち、予防するか、または大幅に低減させる)ために有用である。配列特異的ヒストンH3メチル化を指示することができる目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが、ポリペプチドが翻訳され、ヒストンH3メチル化および続ヘテロクロマチン形成を介して標的遺伝子の遺伝子転写が低減されるような条件下の集団における細胞内に導入される。いくつかの実施形態において、サイレンシング機構は、哺乳類対象中に存在する細胞集団上で行われる。非限定的な例として、有用な標的遺伝子は、その中で哺乳類対象が、異常なキナーゼ活性の結果である骨髄増殖性疾患から被る変異体標的遺伝子を発現する、変異ヤヌスキナーゼ−2ファミリーメンバーである。
ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAとRNAi薬剤との同時投与もまた、本明細書に提供される。
生体経路の調節 細胞内に導入される急速翻訳ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAは、標的生体経路を調節する所望の機構を提供する。そのような調節には、所与の経路のアンタゴニズムまたはアゴニズムが含まれる。一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAが細胞内に局在化され、ポリペプチドが、ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAから細胞内で翻訳されることができ、そのポリペプチドが、生体経路におけるポリペプチド機能の活性を阻害するような条件下で、細胞を目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含む有効量の組成物と接触させることによって、細胞内の生体経路を拮抗するための方法が、提供される。例示の生体経路は、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、狼瘡エリテマトーデス、強直性脊椎炎、大腸炎、またはクローン病等の自己免疫または炎症性障害において欠損しているものである。特に、IL−12およびIL−23シグナル伝達経路のアンタゴニズムは、特に有用性がある(Kikly K,Liu L,Na S,Sedgwick JD(2006)Curr.Opin.Immunol.18(6):670−5)を参照のこと)。
さらに、ケモカイン受容体のアンタゴニストをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。ケモカイン受容体CXCR−4およびCCR−5は、例えば、HIVが宿主細胞内に進入するために必要とされる(Arenzana−Seisdedos F et al,(1996)Nature.Oct 3;383(6599):400)。
あるいは、核酸が細胞内に局在化され、組換えポリペプチドが核酸から細胞内で翻訳されることができ、その組換えポリペプチドが、生体経路のおけるポリペプチド機能の活性を誘導するような条件下で、細胞を組換えポリペプチドをコードする有効量のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAと接触させることによって、細胞内の生体経路を刺激する方法が提供される。例示の刺激された生体経路には、細胞運命決定を調節する経路を含む。そのような刺激化(agonization)は、可逆性であるか、または不可逆性である。
細胞表面上でのリガンドまたは受容体の発現 本明細書に記載のいくつかの態様および態様の実施形態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを用いて、細胞の表面上(例えば、ホーミング部分)でリガンドまたはリガンド受容体を発現することができる。細胞表面に結合されるリガンドまたはリガンド受容体部分は、細胞がインビボで組織または薬剤との所望の生物相互作用を有することを可能にする。リガンドは、抗体、抗体断片、アプタマー、ペプチド、ビタミン、炭水化物、タンパク質またはポリペプチド、受容体、例えば細胞表面受容体、接着分子、糖タンパク質、糖残基、治療剤、薬物、グリコサミノグリカン、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、リガンドは、癌細胞特異的抗原を認識する抗体であってもよく、腫瘍細胞と優先的に相互作用することができる細胞を与え、修飾細胞の腫瘍特異的局在化を可能にする。好ましいリガンドは治療される組織の外側の面で標的分子と相互作用することができるため、リガンドは、細胞組成物の治療される組織内で蓄積する能力を与えることができる。他の組織との制限された交差反応性を有するリガンドが、一般的に好ましい。
いくつかの場合において、リガンドは、細胞が特定の組織を標的化するか、または特定のリガンドと相互作用することを可能にするホーミング部分として作用することができる。そのようなホーミング部分には、:Fv断片、一本鎖Fv(scFv)断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、単一ドメイン抗体、ラクダ化抗体および抗体断片、ヒト化抗体および抗体断片、および前述の多価の別形態が挙げられるが、これらに限定されない、特異的結合ペア、抗体、モノクローナル抗体、または誘導体またはそれらの類似体の任意のメンバー:ジスルフィド安定化Fv断片、scFvタンデム((SCFV)2断片)等の単一特異性または二重特異性抗体、典型的には、共有結合されるか、または安定化される(すなわち、ロイシンジッパーまたはヘリックス安定化されている)scFv断片である二特異性抗体、三特異性抗体(tribodies)、または四特異性抗体(tetrabodies)が挙げられるが、これらに限定されない、多価結合試薬;ならびに例えば、アプタマー、受容体、および融合タンパク質を含む、他のホーミング部分を含み得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ホーミング部分は、細胞標的化特異性の調整を可能にすることができる表面結合抗体であり得る。これは、高度特異的抗体が、所望の標的化部位の目的とするエピトープに対して産生され得るため、特に有用である。一実施形態において、複数の抗体が、細胞の表面上に発現され、各抗体は所望の標的に対する異なる特異性を有することができる。そのような手法は、ホーミング相互作用の結合力および特異性を増加させることができる。
当業者であれば、細胞の所望の局在化または機能に基づいて任意のホーミング部分を選択することができ、例えば、タモキシフェン等のエストロゲン受容体リガンドは、細胞を細胞表面上に増加したエストロゲン受容体数を有するエストロゲン依存乳癌細胞に標的化することができる。リガンド/受容体相互作用の他の非限定的な例としては、CCRI(例えば、関節リウマチおよび/または多発性硬化症における炎症した関節組織または脳の治療のため)、CCR7、CCR8(例えば、リンパ節組織を標的化する)、CCR6、CCR9、CCR10(例えば、腸組織に標的化するため)、CCR4、CCR10(例えば、皮膚を標的化するため)、CXCR4(例えば、一般的に向上された遊出のため)、HCELL(例えば、炎症および炎症性障害、骨髄の治療のため)、α4β7(例えば、腸粘膜標的化のため)、VLA−4/VCAM−1(例えば、内皮を標的化する)が挙げられる。一般に、標的化(例えば、癌転移)に関与する任意の受容体は、本明細書に記載の方法および組成物の用途において利用され得る。
細胞系譜の調節 標的哺乳類細胞における細胞運命の変化を誘導する方法が提供される。標的哺乳類細胞は前駆体細胞であってもよく、変化は分化を系譜内に推進すること、またはそのような分化を遮断することを含み得る。あるいは、標的哺乳類細胞は分化細胞であってもよく、細胞運命変化は、脱分化を多能性前駆体細胞内に推進すること、または癌幹細胞への癌細胞の脱分化等のそのような脱分化を遮断することを含む。細胞運命の変化が望まれる状況において、細胞運命誘導性ポリペプチドをコードする有効量のmRNAが、細胞運命の変化が誘導されるような条件下で標的細胞に導入される。いくつかの実施形態において、修飾mRNAは、第1の表現型から第2の表現型へ細胞の亜集団を再プログラムするのに有用である。そのような再プログラミングは、一時的または永久的であってもよい。任意に、再プログラミングは、中間表現型を装うように標的細胞を誘導する。
さらに、本発明の方法は、高い効率のトランスフェクション、細胞を再トランスフェクトする能力、および標的細胞内で産生される組換えポリペプチドの量の妥当性によって、人工多能性幹細胞(iPS細胞)を生成するのに特に有用である。さらに、本明細書に記載の方法を用いて生成されたiPS細胞の使用は、テラトーマ形成の低減された発生率を有することが予期される。
標的細胞集団における細胞分化を低減する方法もまた提供される。例えば、ポリペプチドが翻訳され、かつ前駆体細胞の分化を低減するような条件下で、1つ以上の前駆体細胞型を含有する標的細胞集団を、ポリペプチドをコードする有効量のポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAを有する組成物と接触する。非限定的な実施形態において、標的細胞集団は、哺乳類対象における損傷組織または外科的処置を受けた組織を含む。前駆体細胞は、例えば、間質前駆体細胞、神経前駆体細胞、または間葉系前駆体細胞である。
具体的な実施形態において、1つ以上の分化因子Gata4、Mef2c、およびTbx4をコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが提供される。これらのmRNA生成因子が、線維芽細胞内に導入され、再プログラミングを心筋細胞に推進する。そのような再プログラミングは、mRNA含有パッチまたは他の材料を損傷された心臓組織と接触することによってインビボで行われ、心臓の再分化を容易にすることができる。そのようなプロセスは、線維症とは対照的に心筋細胞発生を促進する。
細胞死の媒介 一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA組成物を用いて、細胞死受容体、細胞死受容体リガンド、またはこれらの組み合わせの発現を増加させることによって、細胞(例えば、癌細胞)内のアポトーシスを誘導することができる。この方法は、任意の所望の細胞における細胞死を誘導するために使用することができ、細胞が天然のアポトーシスシグナルを逃れる癌の治療において特に有用性を有する。
アポトーシスは、腫瘍壊死因子(TNF)受容体/リガンドスーパーファミリーに属する、いくつかの「細胞死受容体」とそれらのリガンドとの間の複数の相互作用からなる最終エフェクター機構に応じて収束する複数の独立したシグナル伝達経路によって誘導され得る。最もよく特徴がわかっている細胞死受容体は、CD95(「Fas」)、TNFRI(p55)、細胞死受容体3(DR3またはアポ3/TRAMO)、DR4、およびDR5(アポ2−TRAIL−R2)である。アポトーシスの最終エフェクター機構は、カスパーゼとして設計された一連のプロテイナーゼの活性化であり得る。これらのカスパーゼの活性化は、一連の生命細胞タンパク質の切断および細胞死をもたらす。細胞死受容体/リガンド誘導性アポトーシスの分子機構は、当技術分野でよく知られている。例えば、Fas/FasL媒介性アポトーシスは、C末端デスドメイン(DD)を介してFas受容体の三量体形成を誘導する3つのFasL分子の結合によって誘導され、それは次に、アダプタータンパク質FADD(デスドメインを持つFas関連タンパク質)およびカスパーゼ−8を動員する。この三分子複合体、Fas/FAIDD/カスパーゼ8のオリゴマー形成は、酵素前駆体カスパーゼ8の活性カスパーゼ8へのタンパク質分解性切断をもたらし、これは次に、タンパク質分解を通してカスパーゼ3を含む他の下流カスパーゼを活性化することによって、アポトーシスプロセスを開始する。デスリガンドは、一般的には、三量体またはより高次の構造内に形成されるときに、アポトーシス性である。単量体に関しては、それらは、細胞死受容体と結合するための三量体と競合することによって、抗アポトーシス性薬剤として役立ち得る。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA組成物は、細胞死受容体(例えば、Fas、TRAIL、TRAMO、TNFR、TLR等)をコードする。ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNAのトランスフェクションによって、細胞死受容体を発現するように作製される細胞は、その受容体を活性化するリガンドによって誘導される細胞死の影響をうけやすくなる。同様に、例えば、その表面上にデスリガンドを発現するように作製される細胞は、トランスフェクトされた細胞を標的細胞と接触するとき、受容体で細胞の死を誘導する。別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNA組成物は、細胞死受容体リガンド(例えば、FasL、TNF等)をコードする。別の実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNA組成物は、カスパーゼ(例えば、カスパーゼ3、カスパーゼ8、カスパーゼ9等)をコードする。癌細胞が非増殖性または制御された増殖性形態への適正な分化の失敗をしばしば示す場合、別の実施形態において、合成ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNA組成物は、細胞死受容体およびその適切な活性化リガンドの両方をコードする。別の実施形態において、合成ポリヌクレオチド、一次構築物、およびmmRNA組成物は、癌幹細胞等の癌細胞内で発現されるとき、細胞を非病原性もしくは非自己再生性表現型(例えば、低減された細胞成長速度、低減された細胞分裂等)に分化するように誘導するか、または細胞を休眠細胞期(例えば、G0休止期)に誘導する分化因子をコードする。
当業者であれば、アポトーシス誘導技術の使用は、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが、望ましくない広範囲に及ぶ細胞死を防ぐように、例えば腫瘍細胞に適切に標的化されることを必要とし得ることを理解されよう。したがって、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAが癌細胞内でのみ発現するように、癌抗原を認識する送達機構(例えば、リポソーム等を標的とする結合リガンドまたは抗体)を用いることができる。
美容用途 一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、および/またはmmRNAは、美容的状態の治療、寛解、または予防に使用され得る。そのような状態には、挫瘡、酒さ、瘢痕、皺、湿疹、帯状疱疹、乾癬、加齢によるシミ、母斑、乾燥肌、たこ、発疹(例えば、おむつかぶれ、あせも)、疥癬、蕁麻疹、疣贅、虫刺され、白斑、フケ、そばかす、および老化の一般的な兆候が挙げられる。
VI.キットおよびデバイス キット 本発明は、好都合におよび/または効果的に本発明の方法を行うための多様なキットを提供する。典型的には、キットは、使用者が対象の(複数可)複数の治療を実施する、および/または複数の実験を実施することを可能にするのに十分な量および/または数の構成成分を含む。
一態様において、本発明は、本発明の分子(ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA)を含むキットを提供する。一実施形態において、キットは、1つ以上の機能的抗体またはその機能断片を含む。
そのキットは、翻訳可能領域を含む第1のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを含む、タンパク質産生のためのものであり得る。キットは、製剤組成物を形成するための包装および説明書ならびに/または送達剤をさらに含んでもよい。送達剤は、本明細書で開示される食塩水、緩衝液、リピドイド(lipidoid)、または任意の送達剤を含んでもよい。
一実施形態において、緩衝液には、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸塩、および/またはEDTAが含まれてもよい。別の実施形態において、緩衝液は、食塩水、2mMカルシウムを含有する食塩水、5%ショ糖、2mMカルシウムを含有する5%ショ糖、5%マンニトール、2mMカルシウムを含有する5%マンニトール、Ringerの乳酸塩、塩化ナトリウム、2mMカルシウムおよびマンノースを含有する塩化ナトリウムを含み得るが、これらに限定されない(例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国公開第20120258046号を参照のこと)。さらなる実施形態において、緩衝液は沈殿されてもよく、または凍結乾燥されてもよい。各構成成分の量は、一貫した、再現性のある高濃度食塩水または単純緩衝製剤を可能にするように変更され得る。構成成分は、一定期間にわたって、および/または多様な条件下での緩衝液中における修飾RNAの安定性を増加させるようにも変更され得る。一態様において、本発明は、標的細胞内に導入されるとき、所望の量の翻訳可能領域によってコードされるタンパク質を産生するのに有効な量で提供される、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAと、細胞の自然免疫応答を実質的に阻害するのに有効な量で提供される、阻害性核酸を含む第2のポリヌクレオチドと、包装および説明書と、を含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
一態様において、本発明は、ポリヌクレオチドが細胞ヌクレアーゼによる低減された分解を示す、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAと、包装および説明書と、を含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
一態様において、本発明は、そのポリヌクレオチドが細胞ヌクレアーゼによる低減された分解を示す、翻訳可能領域を含むポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAと、第1の核酸の翻訳可能領域の翻訳に適した哺乳類細胞と、を含む、タンパク質産生のためのキットを提供する。
一実施形態において、プロテインCのレベルは、イムノアッセイによって測定され得る。アッセイは購入されてもよく、BioMerieux,Inc.(Durham,NC)、Abbott Laboratories(Abbott Park,IL)、Siemens Medical Solutions USA,Inc.(Malvern,PA)、BIOPORTO(登録商標)Diagnostics A/S(Gentofte,Denmark)、USCN(登録商標)Life Science Inc.(Houston,TX)、またはRoche Diagnostic Corporation(Indianapolis,IN)を含む、任意のいくつかの供給元から利用可能である。この実施形態において、アッセイは、修飾mRNA分子として、もしくはその投与に応答して、送達されるプロテインCまたはその活性型もしくは変異形のレベルを評価するために使用され得る。
デバイス 本発明は、目的とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを組み込み得るデバイスを提供する。これらのデバイスは、安定した製剤中に、ヒト患者等のそれを必要とする対象に即時に送達されることができる製剤中にポリヌクレオチドを合成するための試薬を含有する。そのような目的とするポリペプチドの非限定的な例としては、創傷治癒のための成長因子および/または血管形成刺激因子、感染制御を容易にするためのペプチド抗細菌剤、ならびに新たに確認されたウイルスに対する免疫応答を急速に刺激するための抗原が挙げられる。
デバイスを本発明とともに使用することもできる。一実施形態において、デバイスは、修飾mRNAの形態で投与されたタンパク質のレベルを評価するために使用される。デバイスは、血液、尿、または他の生物流体(biofluidic)検査を含んでもよい。それは自動化セントラルラボプラットフォームを含むほどの大型、または小分散化卓上デバイスであり得る。それはポイントオブケアまたは手持ち式デバイスであり得る。この実施形態において、例えば、プロテインCまたはAPCは、プロテインC(そのチモーゲン)、APC、またはそれらの任意の変異形をコードする修飾mRNAを用いた治療の前、治療中、または治療後に定量され得る。オートプロトロンビンIIAおよび血液凝固第XIV因子としても知られているプロテインCは、血液凝固の制御およびインビボでの線維素溶解活性の発生において重要な役割を果たすセリンプロテアーゼのチモーゲンまたは前駆体である。それは一本鎖ポリペプチドとして肝臓で合成されるが、二本鎖中間体を生じさせる翻訳後プロセシングを経る。プロテインCのその中間形態は、重鎖のアミノ末端から分子のアミノ末端に12残基ペプチドのトロンビン媒介性切断を介して、「活性化タンパク質C」(APC)として知られる活性型に変換される。デバイスは、敗血症または重度の敗血症等のプロテインCまたはAPC治療に関連したコンパニオン診断検査として、創薬努力において有用であり得る。初期研究において、APCが重度の敗血症における死亡率を低下させる能力を有したことが示唆された。この研究路線に従って、臨床研究は、1つの化合物、活性化ドロトレコギンアルファ(組換えタンパク質C)のFDA認可を導いた。しかしながら、2011年の終わりに、敗血症性ショックの患者おける28日間の全死因死亡率において統計的に有意な低下の主要評価項目を満たなかったことを示したPROWESS−SHOCK試験の結果を受けて、この薬物はすべての市場から回収された。本発明は、哺乳動物におけるタンパク質発現効率の増加に関連した先の課題または問題を克服する、敗血症、重度の敗血症、および敗血症(septicemia)の診断および治療に使用され得る修飾mRNA分子を提供する。
いくつかの実施形態において、デバイスは、自己完結型であり、任意に、生成されたポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの合成および/または分析のための指示を得るための無線遠隔通信が可能である。デバイスは、少なくとも1つのポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA、および好ましくは無制限の異なるポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのモバイル合成が可能である。ある特定の実施形態において、デバイスは、1または少数の個体によって輸送されることができる。他の実施形態において、デバイスは、卓上または机に合うように調整される。他の実施形態において、デバイスは、スーツケース、バックパック、または同様の大きさの対象に収まるように調整される。別の実施形態において、デバイスは、ポイントオブケアまたは手持ち式デバイスであってもよい。さらなる実施形態において、デバイスは、乗用車、運搬車、もしくは救急車等の自動車、または戦車もしくは兵員輸送車等の軍用車両に収まるように調整される。目的とするポリペプチドをコードする修飾mRNA生成するために必要な情報は、デバイスに存在するコンピュータ可読媒体内に存在する。
一実施形態において、デバイスは、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの形態で投与されたタンパク質のレベルを評価するために使用され得る。デバイスは、血液、尿、または他の生物流体(biofluidic)検査を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、デバイスは、核酸およびポリペプチド配列のデータベースを用いて通信(例えば、無線通信)が可能である。デバイスは、1つ以上の試料容器を挿入するための少なくとも1つの試料ブロックを含む。そのような試料容器は、テンプレートDNA、ヌクレオチド、酵素、緩衝剤、および他の試薬等の任意の数の材料の液体または他の形態を受け入れることが可能である。試料容器は、試料ブロックとの接触によって加熱または冷却されることも可能である。試料ブロックは、一般的に、少なくとも1つの試料ブロックのための1つ以上の電子制御装置を有するデバイス基部と通信している。試料ブロックは、好ましくは、試料容器およびその構成要素を約−20℃〜+100℃を超える温度に加熱および/または冷却することができるような加熱モジュールである、加熱モジュールを含む。デバイス基部は、電池または外部電圧源等の電圧源と通信している。デバイスは、RNA合成のための材料を貯蔵および分配するための手段も含む。
任意に、試料ブロックは、合成された核酸を分離するためのモジュールを含む。あるいは、デバイスは、試料ブロックに作動可能に連結される分離モジュールを含む。好ましくは、デバイスは、合成された核酸を分析するための手段を含む。そのような分析には、配列同一性(ハイブリダイゼーション等によって実証される)、望ましくない配列の不在、合成されたmRNAの完全性の測定(分光光度法と組み合わせた微小流体粘度測定によるもの等)、ならびに修飾RNAの濃度および/または効力(分光光度法によるもの等)が挙げられる。
ある特定の実施形態において、デバイスは、対象から得られた生物材料中に存在する病原体の検出のための手段、例えば、微生物同定用のIBIS PLEX−IDシステム(Abbott,Abbott Park,IL)と組み合わせられる。
本明細書に記載の薬学的組成物を皮内送達する際に用いるのに適したデバイスには、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第4,886,499号、同第5,190,521号、同第5,328,483号、同第5,527,288号、同第4,270,537号、同第5,015,235号、同第5,141,496号、および同第5,417,662号に記載のデバイス等の短針デバイスが挙げられる。皮内組成物は、参照により全体が本明細書に組み込まれるPCT公開第WO99/34850号に記載のデバイスおよびその機能的等価物等の皮膚の中への針の有効な貫通長さを制限するデバイスによって投与され得る。液体ジェット式注入器を介して、および/または角質層に穴を開ける針を介して、液体組成物を真皮に送達し、真皮に到達するジェットを生じるジェット式注入デバイスが好適である。ジェット式注入デバイスは、例えば、各々が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第5,480,381号、同第5,599,302号、同第5,334,144号、同第5,993,412号、同第5,649,912号、同第5,569,189号、同第5,704,911号、同第5,383,851号、同第5,893,397号、同第5,466,220号、同第5,339,163号、同第5,312,335号、同第5,503,627号、同第5,064,413号、同第5,520,639号、同第4,596,556号、同第4,790,824号、同第4,941,880号、同第4,940,460号、ならびにPCT公開第WO97/37705号および同第WO97/13537号に記載されている。圧縮ガスを用いて、粉末形態にあるワクチンを加速させ、皮膚の外層を通して真皮に到達させる弾道粉末/粒子送達デバイスが、好適である。あるいは、またはさらに、従来のシリンジを皮内投与の古典的なマントゥー法で用いることができる。
いくつかの実施形態において、デバイスは、ポンプであってもよく、または血液脳関門を横断する本発明の化合物または組成物の投与用のカテーテルを含む。そのようなデバイスには、加圧嗅覚送達デバイス、イオン泳動デバイス、多層微小流体デバイス等が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなデバイスは、携帯型または固定型であってもよい。それらは、身体に埋め込み可能であるか、または身体に外的に係留されるか、またはそれらの組み合わせであってもよい。
投与用デバイスを用いて、本発明で教示される単回、複数回、または分割投薬レジメンに従って、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAを送達してもよい。そのようなデバイスは、以下に記載される。
細胞、器官、および組織への複数回投与のための当技術分野で既知の方法およびデバイスは、本発明の実施形態として本明細書で開示される方法および組成物とともに使用されることが企図される。これらには、例えば、複数の針、例えば、ルーメンまたはカテーテルを用いるハイブリッドデバイスならびに熱、電流、または放射線駆動機構を利用するデバイスを有する方法およびデバイスが挙げられる。
本発明に従って、これらの複数回投与デバイスを利用して、本明細書で企図される単回用量、複数回用量、または分割された用量が送達されてもよい。
治療剤を固体組織に送達するための方法は、Bahramiらによって説明されており、例えば、米国特許公開第20110230839号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Bahramiによると、一連の針はデバイス内に組み込まれ、各針の長さに沿ってその固体組織内の任意の箇所で実質的に同量の流体を送達する。
生物組織を横断して生物材料を送達するためのデバイスは、Kodguleらによって説明されており、例えば、米国特許公開第20110172610号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Kodguleによると、1つ以上の金属から作製され、かつ約200ミクロン〜約350ミクロンの外径および少なくとも100ミクロンの長さを有する複数の中空型マイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、ペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸分子、脂質、および他の薬学的に有効な成分またはそれらの組み合わせを送達する。
治療剤の組織への送達のための送達プローブは、Gundayらによって説明されており、例えば、米国特許公開第20110270184号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Gundayによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、デバイスは、付加されたカプセルを作動位置と非作動位置との間で移動させ、その針を通してカプセルの外に薬剤を出させる。
複数回注入医療器具が、Assafによって説明されており、例えば、米国特許公開第20110218497号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Assafによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、デバイスは、その針のうちの1つ以上に接続するチャンバと、各注入の後、連続的にそのチャンバに医療用流体を補充する手段と、を有する。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、少なくとも3つの針を介して皮下にまたは筋肉内に、同時または60分以内に3つの異なる、任意に隣接した部位へ投与される(例えば、同時または60以内に4、5、6、7、8、9、または10個の部位への投与)。分割された用量は、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許公開第20110230839号および同第20110218497号に記載のデバイスを用いて、同時に隣接した組織に投与され得る。
物質を患者の身体に注入するための少なくとも部分的に埋め込み可能なシステム、具体的には陰茎勃起刺激システムが、Forsellによって説明されており、例えば、米国特許公開第20110196198号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Forsellによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、デバイスは、患者の左および右の陰核海綿体に隣接する1つ以上の筐体とともに埋め込まれる。また、針を通して薬物を供給するためにリザーバおよびポンプも埋め込まれる。
治療的有効量の鉄分の経皮送達のための方法が、Berensonによって説明されており、例えば、米国特許公開第20100130910号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Berensonによると、複数の針を用いて、イオン泳動パッチ上のイオン性鉄分の経皮送達を強化するために角質層内に複数のマイクロチャネルを作製することができる。
生物組織を横断する生物材料の送達のための方法が、Kodguleらによって説明されており、例えば、米国特許公開第20110196308号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Kodguleによると、治療的活性成分を含む複数の生分解性マイクロニードルがデバイスに組み込まれ、タンパク質、炭水化物、核酸分子、脂質、および他の薬学的活性成分、またはそれらの組み合わせを送達する。
ボツリヌス毒素組成物を含む経皮パッチが、Donovanによって説明されており、例えば、米国特許公開第20080220020号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Donovanによると、複数の針がパッチ内に組み込まれ、血液を破裂させることなく、皮膚の角質層を通して突出するその針を通してボツリヌス毒素を角質層下に送達する。
およそ0.2〜15mLの液体製剤を保持することができる小さい使い捨ての薬物リザーバ、またはパッチポンプを皮膚上に配置し、製剤を細い針(例えば、26〜34ゲージ)を用いて連続的に皮下に送達することができる。非限定的な例として、パッチポンプは、30〜34ゲージ針を有するばね式の50mm×76mm×20mm(BD(商標),Microinfuser,Franklin Lakes NJ)、インスリン等の薬物送達に使用される2mLリザーバを有する41mm×62mm×17mm(OMNIPOD(登録商標),Insulet Corporation Bedford,MA)、または0.5〜10mLリザーバを有する43〜60mm直径、10mm厚(PATCHPUMP(登録商標),SteadyMed Therapeutics,San Francisco,CA)であってもよい。さらに、パッチポンプは、電池式および/または充電式であり得る。
低温治療の箇所への活性剤の投与用の凍結探針が、Toubiaによって説明されており、例えば、米国特許公開第20080140061号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Toubiaによると、複数の針がプローブ内に組み込まれ、プローブは、チャンバ内への活性剤を受容し、薬剤を組織に投与する。
炎症を治療するか、もしくは予防し、または健常な関節を促進するための方法が、Stockらによって説明されており、例えば、米国特許公開第20090155186号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Stockによると、複数の針がデバイスに組み込まれ、シグナル伝達調節因子化合物を含有する組成物を投与する。
多部位注入システムが、Kimmellらによって説明されており、例えば、米国特許公開第20100256594号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Kimmellによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、その針を通して薬物を角質層内に送達する。
インターフェロンを皮内区画に送達するための方法が、Dekkerらによって説明されており、例えば、米国特許公開第20050181033号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Dekkerによると、0〜1mmの露出された高さを持つ放出口を有する複数の針がデバイス内に組み込まれ、それが0.3mm〜2mmの深さで物質を送達することによって、薬物動態およびバイオアベイラビリティを改善する。
遺伝子、酵素、および生物薬剤を組織細胞に送達するための方法が、Desaiによって説明されており、例えば、米国特許公開第20030073908号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Desaiによると、複数の針が体内に挿入されるデバイス内に組み込まれ、その針を通して薬物流体を送達する。
線維芽細胞を用いて不整脈を治療するための方法が、Leeらによって説明されており、例えば、米国特許公開第20040005295号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Leeによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、線維芽細胞を組織の局所的領域に送達する。
磁力制御されたポンプ使用して脳腫瘍を治療するための方法が、Shacharらによって説明されており、例えば、米国特許第7799012号(方法)および同第7799016号(デバイス)に教示され、それらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Shacharによると、複数の針がポンプに組み込まれ、ポンプは、制御された速度でその針を通して薬物治療剤を押す。
雌哺乳類における膀胱の機能的障害を治療する方法が、Versiらによって説明されており、例えば、米国特許第8,029,496号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Versiによると、一連のマイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、その針を通して直接膀胱の膀胱三角部内に治療剤を送達する。
マイクロニードル経皮輸送デバイスが、Angelらによって説明されており、例えば、米国特許第7,364,568号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Angelによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、デバイスは、異なる方向から表面内に挿入されるその針を通して物質を体表内に輸送する。マイクロそのニードル経皮輸送デバイスは、中実型マイクロニードルシステムまたは中空型マイクロニードルシステムであってもよい。非限定的な例として、中実型マイクロニードルシステムは、薬物で被覆された約150〜700μmの高さの、cm2当たり300〜1500の中実マイクロニードルを伴う最大0.5mgの容量を有し得る。マイクロニードルは、角質層に透過し、短い持続期間(例えば、20秒間〜15分間)、皮膚に残存する。別の例において、中空型マイクロニードルシステムは、最大3mLの容量を有し、およそ950μmの高さであるcm2当たり15〜20マイクロニードルを用いて液体製剤を送達する。マイクロニードルは皮膚に透過し、液体製剤がデバイスから皮膚内に流れることを可能にする。中空型マイクロニードルシステムは、製剤体積および粘度に応じて、1〜30分間で消耗し得る。
皮下輸注用デバイスが、Daltonらによって説明されており、例えば、米国特許第7,150,726号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Daltonによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、その針を通して流体を皮下組織に送達する。
マイクロカニューレを通したワクチンおよび遺伝子治療剤の皮内送達用デバイスおよび方法が、Miksztaらによって説明されており、例えば、米国特許第7,473,247号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Mitsztaによると、少なくとも1つの中空型マイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、0.025mm〜2mmの深さでワクチンを対象の皮膚に送達する。
インスリンを送達する方法が、Pettisらによって説明されており、例えば、米国特許第7,722,595号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Pettisによると、2つの針はデバイス内に組み込まれ、第1の針はインスリンを皮内区画に送達するように2.5mm未満の深さで、第2の針はインスリンを皮内区画に送達するように2.5mm超えかつ5.0mm未満の深さで、両方の針は基本的に同時に皮膚内に挿入される。
吸引下での皮膚注入送達が、Kochambaらによって説明されており、例えば、米国特許第6,896,666号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Kochambaによると、互いに比較的に隣接した複数の針がデバイス内に組み込まれ、皮膚層の下に流体を注入する。
皮膚を通して物質を取り除くか、または送達するためのデバイスが、Downらによって説明されており、例えば、米国特許第6,607,513号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Downによると、複数の皮膚透過メンバーがデバイス内に組み込まれ、約100ミクロンから約2000ミクロンの長さを有し、約30〜50ゲージである。
物質を皮膚に送達するためのデバイスが、Palmerらによって説明されており、例えば、米国特許第6,537,242号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Palmerによると、一連のマイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、その針と皮膚との接触を強化するために引っ張りアセンブリを使用し、物質のより均一な送達をもたらす。
局所薬物送達のための灌流デバイスが、Zamoyskiによって説明されており、例えば、米国特許第6,468,247号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Zamoyskiによると、複数の皮下針が、皮下注射器が後退するときに皮下注射器の内容物を組織内に注入するデバイス内に組み込まれる。
マイクロニードルおよびヒト皮膚との間の相互作用を改善することによる組織を横断する薬物および生体分子の増強された輸送のための方法が、Prausnitzらによって説明されており、例えば、米国特許第6,743,211号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Prausnitzによると、複数のマイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、デバイスは、そこにマイクロニードルが適用される、より強固で、より変形しにくい表面を示すことができる。
医薬剤の器官内投与のためのデバイスが、Tingらによって説明されており、例えば、米国特許第6,077,251号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Tingによると、増強投与のための側面開口部を有する複数の針がデバイス内に組み込まれ、デバイスは、その針を針チャンバからおよび針チャンバ中へ伸長および後退することによって医薬剤をリザーバからその針の中へ押し進め、その医薬剤を標的器官に注入する。
複数の持針器および皮下多重チャネル輸注ポートが、Brownによって説明されており、例えば、米国特許第4,695,273号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Brownによると、持針器上の複数の針が輸注ポートの中隔を通して挿入され、その輸注ポート内の単離されたチャンバと連通する。
二重皮下シリンジが、Hornによって説明されており、例えば、米国特許第3,552,394号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Hornによると、デバイス内に組み込まれる2つの針が、68mm未満の間隔で離間され、異なるスタイルおよび長さであってもよく、このため注入が異なる深さで行われることを可能にする。
複数の針および複数の流体区画を有するシリンジが、Hershbergによって説明されており、例えば、米国特許第3,572,336号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Hershbergによると、複数の針が複数の流体区画を有するシリンジ内に組み込まれ、1つの注入に混合することができない相性の悪い薬物を同時に投与することができる。
流体の皮内の注入のための外科用器具が、Eliscuらによって説明されており、例えば、米国特許第2,588,623号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Eliscuによると、複数の針がその器具内に組み込まれ、流体を皮内により幅広い分散で注入する。
複数の乳房内の乳管への物質の同時送達のための装置が、Hungによって説明されており、例えば、欧州特許第1818017号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Hungによると、複数のルーメンがデバイス内に組み込まれ、乳管網のオリフィスを通して挿入し、流体を乳管網に送達する。
心臓または他の器官の組織への薬物の導入のためのカテーテルが、Tkebuchavaによって説明されており、例えば、国際公開第WO2006138109号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Tkebuchavaによると、平坦な軌道で器官壁に進入する2つの湾曲針が組み込まれる。
医薬剤を送達するためのデバイスが、Mckayらによって説明されており、例えば、国際公開第WO2006118804号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Mckayによると、各針上に複数のオリフィスを有する複数の針がデバイス内に組み込まれ、脊髄円板の内部円板空間等の組織への局部送達を容易にする。
哺乳類皮膚内の皮内空間内に免疫調節物質を直接送達するための方法が、Pettisによって説明されており、例えば、国際公開第WO2004020014号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Pettisによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、針を通して物質を0.3mm〜2mmの深さに送達する。
全身性吸収および改善された薬物動態のための皮膚の少なくとも2つの区画内へ物質を投与するための方法およびデバイスが、Pettisらによって説明されており、例えば、国際公開第WO2003094995号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Pettisによると、約300μm〜約5mmの長さを有する複数の針がデバイス内に組み込まれ、皮内および皮下組織区画へ同時に送達する。
針およびローラーを有する薬物送達デバイスが、Zimmermanらによって説明されており、例えば、国際公開第WO2012006259号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Zimmermanによると、ローラー内に位置する複数の中空針がデバイス内に組み込まれ、ローラーが回転すると、針を通してリザーバ内の内容物を送達する。
当技術分野で既知のステント等の薬物送達デバイスが、例えば、米国特許第8,333,799号、米国公開第US20060020329号、同第US20040172127号、および同第US20100261692号に教示され、これらの各々の内容は、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のポリヌクレオチド、一次構築物、mmRNAの製剤は、ステントを用いて送達され得る。さらに、本明細書で使用されるステントは、同じか、または異なる送達速度で複数のポリヌクレオチド、一次構築物、および/もしくはmmRNAならびに/または製剤を送達することができる。ステントの製造業者の非限定的な例としては、CORDIS(登録商標)(Miami,FL)(CYPHER(登録商標))、Boston Scientific Corporation(Natick,MA)(TAXUS(登録商標))、Medtronic(Minneapolis,MN)(ENDEAVOUR(登録商標))、およびAbbott(Abbott Park,IL)(XIENCE V(登録商標))が挙げられる。
カテーテルおよび/またはルーメンを利用する方法およびデバイス カテーテルおよびルーメンを使用する方法およびデバイスを用いて、単回、複数回、または分割された投薬スケジュールにおいて本発明のmmRNAを投与することができる。そのような方法およびデバイスを、以下に記載する。
骨格筋芽細胞から損傷された心臓の心筋へのカテーテルベースの送達が、Jacobyらによって説明されており、例えば、米国特許公開第20060263338号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Jacobyによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、その少なくとも一部が血管内に挿入され、針を通して細胞組成物を対象の心臓の局所領域に送達する。
神経毒素を用いて喘息を治療するための装置が、Deemらによって説明されており、例えば、米国特許公開第20060225742号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Deemによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、その針を通して神経毒素を気管支組織内に送達する。
複数成分療法を施すための方法が、Nayakによって説明されており、例えば、米国特許第7,699,803号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Nayakによると、複数の注入カニューレがデバイス内に組み込まれてもよく、深さを制御するための深度スロットが含まれてもよく、治療用物質はそこで組織内に送達される。
チャネルを切断し、少なくとも1つの治療剤を組織の所望の領域内に送達するための外科用デバイスが、McIntyreらによって説明されており、例えば、米国特許第8,012,096号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。McIntyreによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、これはチャネルを取り囲む組織の領域内に治療剤を分注し、特に経心筋血行再建手術によく適している。
雌哺乳類における膀胱の機能的障害を治療する方法が、Versiらによって説明されており、例えば、米国特許第8,029,496号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Versiによると、一連のマイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、その針を通して直接膀胱の膀胱三角部内に治療剤を送達する。
流体を柔軟な生体バリアーに送達するためのデバイスおよび方法が、Yeshurunらによって説明されており、例えば、米国特許第7,998,119号(デバイス)および同第8,007,466(方法)号に教示され、それらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Yeshurunによると、デバイス上のマイクロニードルが柔軟な生体バリアーに透過および伸長し、流体は中空型マイクロニードルの孔を通して注入される。
心外膜表面を有し、心外膜を有する心臓の組織の領域に物質を介して注入するための、胴体内に配置される方法が、Bonnerらによって説明されており、例えば、米国特許第7,628,780号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Bonnerによると、デバイスは、針を組織内に操縦し、その針を通して医薬剤を組織内に注入するための細長いシャフトおよび遠位注入ヘッドを有する。
穿刺創を密封するためのデバイスが、Nielsenらによって説明されており、例えば、米国特許第7,972,358号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Nielsenによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、穿刺路を取り囲む組織内に閉鎖剤を送達する。
筋形成および血管形成のための方法が、Chiuらによって説明されており、例えば、米国特許第6,551,338号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Chiuによると、少なくとも1.25mmの最大直径と、6〜20mmの穿刺深度を提供するのに有効な長さと、を有する5〜15の針がデバイス内に組み込まれ、心筋近くに挿入し、外因性血管新生または筋原性因子をその針の少なくとも一部の中にある導管を通してその心筋に供給する。
前立腺組織の治療ための方法が、Bolmsjらによって説明されており、例えば、米国特許第6,524,270号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Bolmsjによると、尿道を通して挿入されるカテーテルを含むデバイスが、周囲の前立腺組織内に伸長可能な少なくとも1つの中空端を有する。収斂薬および鎮痛薬は、その端部を通してその前立腺組織内に投与される。
流体を骨内部位に輸注する方法が、Findlayらによって説明されており、例えば、米国特許第6,761,726号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Findlayによると、軟質材料の層で覆われた材料の硬質殻を貫通することが可能な複数の針がデバイス内に組み込まれ、その材料の硬質殻から下へ規定の距離で流体を送達する。
薬物を血管壁内に注入するためのデバイスが、Vigilらによって説明されており、例えば、米国特許第5,713,863号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Vigilによると、複数の注入器がデバイス内の可撓管のそれぞれの上に設置され、血管壁内への輸注のためにマルチルーメンカテーテルを通してその可撓管の中へ、およびその注入器の外へ薬物流体を導入する。
治療用および/または診断用薬剤を身体通路を取り囲む組織に送達するためのカテーテルが、Faxonらによって説明されており、例えば、米国特許第5,464,395号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Faxonによると、少なくとも1つの針カニューレがカテーテル内に組み込まれ、カテーテルの外部へ突出するその針を通して所望の薬剤を組織に送達する。
治療剤を送達するためのバルーンカテーテルが、Orrによって説明されており、例えば、国際公開第WO2010024871号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Orrによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、治療剤を組織内の異なる深さに送達する。別の態様において、薬物溶出バルーンを用いて、本明細書に記載の製剤を送達してもよい。薬物溶出バルーンは、蛇行血管内の病変、分岐病変、大腿/膝窩病変、および膝の下の病変を治療するステント内再狭窄等であるが、これらに限定されない標的病変への適用において使用され得る。
治療剤(例えば、ポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNA)をルーメン周囲に配置された組織に送達するためのデバイスが、Perryらによって説明されており、例えば、米国特許公開第US20100125239号に教示され、これらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Perryによると、カテーテルはバルーンを有し、それは当技術分野で既知の、およびPerryによって記載される方法によって治療剤で被覆され得る。バルーンが膨張すると、治療剤が周辺組織に接触する。デバイスは、治療剤(thereapeutic agent)を組織に放出するようにバルーン上のコーティングの温度を変化するための熱源をさらに有してもよい。
電流を利用する方法およびデバイス 本明細書に教示される単回、複数回、または分割された投薬レジメンに従って、電流を利用する方法およびデバイスを用いて、本発明のmmRNAを送達することができる。そのような方法およびデバイスが、以下に記載される。
電気コラーゲン誘導治療デバイスが、Marquezによって説明されており、例えば、米国特許公開第20090137945号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Marquezによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、皮膚を繰り返し穿刺し、最初に皮膚に適用される物質の一部を皮膚部分に引き込む。
動電システムが、Etheredgeらによって説明されており、例えば、米国特許公開第20070185432号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Etheredgeによると、マイクロニードルがデバイス内に組み込まれ、電流によって、針を通して薬物を標的とされる治療部位に推進する。
イオン泳動デバイスが、Matsumuraらによって説明されており、例えば、米国特許第7,437,189号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Matsumuraによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、イオン化可能薬物をより速い速度で、またはより高効率で生体内に送達することができる。
無針注入およびエレクトロポレーションによる生物活性剤の皮内送達が、Hoffmannらによって説明されており、例えば、米国特許第7,171,264号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Hoffmannによると、1つ以上の無針注入器がエレクトロポレーションデバイスに組み込まれ、無針注入とエレクトロポレーションとの組み合わせは、薬剤を皮膚、筋肉、または粘膜の細胞内に導入するのに十分である。
電気透過化処理(electropermeabilization)を介した細胞内送達のための方法が、Lundkvistらによって説明されており、例えば、米国特許第6,625,486号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Lundkvistによると、一対の針電極がカテーテル内に組み込まれる。そのカテーテルは体内ルーメン内に位置し、そのルーメンを取り囲む組織内に透過させるためのその針電極が続く。次いでデバイスは、その針電極のうちの少なくとも1つを通して薬剤を導入し、その針電極で電界をかけ、その薬剤が細胞膜を通して治療部位の細胞内へ通過することを可能にする。
経皮免疫化のための送達システムが、Levinらによって説明されており、例えば、国際公開第WO2006003659号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Levinによると、複数の電極がデバイス内に組み込まれ、電気エネルギーを電極間に印加し、経皮送達を容易にするためのマイクロチャネルを皮膚内に生成する。
RFエネルギーを皮膚の中へ送達するための方法が、Schomackerによって説明されており、例えば、国際公開第WO2011163264号に教示され、この内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。Schomackerによると、複数の針がデバイス内に組み込まれ、針がRFエネルギーをプレート上の孔を通して皮膚に挿入し、送達するように、皮膚をプレートとの接触に誘引するために減圧する。
VII.定義 本明細書中の種々の箇所で、本開示の化合物の置換基が、群においてまたは範囲において開示される。本開示は、そのような群および範囲のメンバーのありとあらゆる個々の部分的組み合わせを含むことが具体的に意図される。例えば、「C1−6アルキル」という用語は、メチル、エチル、C3アルキル、C4アルキル、C5アルキル、およびC6アルキルを個々に開示することが具体的に意図される。
約:本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、列挙される値の+/−10%を意味する。
組み合わせて投与される:本明細書で使用されるとき、「組み合わせて投与される」または「組み合わせた投与」という用語は、2つ以上の薬剤が、同時にまたは患者に対する各薬剤の効果の重複があるような間隔内で、対象に投与されることを意味する。いくつかの実施形態において、それらは、互いの約60、30、15、10、5、または1分以内に投与される。いくつかの実施形態において、薬剤の投与は、組み合わせ(例えば、相乗的)効果が達成されるように、互いに十分に近接して間隔を置かれる。
動物:本明細書で使用されるとき、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、任意の発達段階にあるヒトを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、任意の発達段階にある非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物(例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ)である。いくつかの実施形態において、動物には、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、サカナ、および蠕虫が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作動物、またはクローンである。
目的とする抗原または所望の抗原:本明細書で使用されるとき、「目的とする抗原」または「所望の抗原」という用語は、本明細書に記載の抗体、ならびにそれらの断片、変異体、変異形、および改変体によって免疫特異的に結合される、本明細書に提供されるタンパク質および他の生体分子を含む。目的とする抗原の例としては、インスリン、インスリン様成長因子、hGH、tPA、インターロイキン(IL)、例えば、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、インターフェロン(IFN)α、IFNβ、IFNγ、IFNω、またはIFNτ、TNFαおよびTNFβ、TNFγ、TRAIL等の腫瘍壊死因子(TNF);G−CSF、GM−CSF、M−CSF、MCP−1、およびVEGF等のサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。
およそ:本明細書で使用されるとき、目的とする1つ以上の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、定められる参照値と同様である値を指す。ある特定の実施形態において、「およそ」または「約」という用語は、別途定められるか、または文脈から別途明白でない限り、定められる参照値のいずれかの方向(それよりも大きいまたはそれよりも小さい)における、25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、またはそれ未満の内に該当する値の範囲を指す(そのような数字が可能な値の100%を超えるような場合を除く)。
と会合される:本明細書で使用されるとき、2つ以上の部分に関して使用される際、「と会合される」、「複合体化される」、「連結される」、「結合される」、および「係留される」という用語は、直接、または連結剤としての役目を果たす1つ以上のさらなる部分を介してのいずれかで、その部分が互いに物理的に会合されるか、または結合されて、その部分が、構造が使用される条件下、例えば、生理的条件下で、物理的に会合されたままであるように十分に安定した構造を形成することを意味する。「会合」は、厳密に直接的な共有化学結合を経る必要はない。それは、「会合した」実体が物理的に会合したままであるように十分に安定したイオン結合もしくは水素結合またはハイブリダイゼーションベースの結合性も示唆し得る。
二機能性:本明細書で使用されるとき、「二機能性」という用語は、少なくとも2つの機能を維持することが可能である任意の物質、分子、または部分を指す。この機能は、同じ結果または異なる結果を達成してもよい。この機能をもたらす構造は、同じであることも、異なることもある。例えば、本発明の二機能性修飾RNAが、細胞傷害性ペプチド(第1の機能)をコードし得る一方で、コードRNAを含むヌクレオシドは、それ自体として、細胞傷害性(第2の機能)である。この例において、癌細胞への二機能性修飾RNAの送達は、癌を寛解させ得るまたは治療し得るペプチドまたはタンパク質分子をもたらすだけでなく、万一、修飾RNAの翻訳の代わりに分解が生じることがあった場合、ヌクレオシドの細胞傷害性ペイロードを細胞に送達するであろう。
生体適合性:本明細書で使用されるとき、「生体適合性」という用語は、損傷、毒性、または免疫系による拒絶の危険性をほとんどもしくは全くもたらさず、生細胞、組織、器官、または系と適合性であることを意味する。
生分解性:本明細書で使用されるとき、「生分解性」という用語は、生き物の作用によって無害の生成物へと分解されることが可能であることを意味する。
生物学的に活性:本明細書で使用されるとき、「生物学的に活性」という表現は、生体系および/または生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与されるときに、その生物に対して生物学的効果を有する物質は、生物学的に活性であると見なされる。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAは、そのポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのほんの一部分でも、生物学的に活性であるか、生物学的に関連性があると見なされる活性を模倣する場合、生物学的に活性であると見なされ得る。
化学用語:以下は、「アシル」から「チオール」までの種々の化学用語の定義を提供する。
本明細書で使用されるとき、「アシル」という用語は、本明細書に定義されるカルボニル基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義される水素またはアルキル基(例えば、ハロアルキル基)を表し、ホルミル(すなわち、カルボキシアルデヒド基)、アセチル、プロピオニル、ブタノイル等により例として示される。例示の非置換アシル基は、1〜7、1〜11、または1〜21個の炭素を含む。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換される。
本明細書で使用されるとき、「アシルアミノ」という用語は、本明細書に定義されるアミノ基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアシル基を表す(すなわち、−N(RN1)−C(O)−Rであり、式中、Rは、Hであるか、または任意に置換されるC1−6、C1−10、もしくはC1−20アルキル基であり、RN1は、本明細書に定義される通りである)。例示の非置換アシルアミノ基は、1〜41個の炭素(例えば、1〜7、1〜13、1〜21、2〜7、2〜13、2〜21、または2〜41個の炭素)を含む。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載の1、2、3、もしくは4個の置換基でさらに置換され、かつ/またはアミノ基は、−NH2もしくは−NHRN1であり、式中、RN1は、独立して、OH、NO2、NH2、NRN22、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、アルキル、またはアリールであり、各RN2は、H、アルキル、またはアリールであり得る。
本明細書で使用されるとき、「アシルオキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアシル基を表す(すなわち、−O−C(O)−Rであり、式中、Rは、Hであるか、または任意に置換されるC1−6、C1−10、もしくはC1−20アルキル基である)。例示の非置換アシルオキシ基は、1〜21個の炭素(例えば、1〜7または1〜11個の炭素)を含む。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載の1、2、3、もしくは4個の置換基でさらに置換され、かつ/またはアミノ基は、−NH2もしくは−NHRN1であり、式中、RN1は、独立して、OH、NO2、NH2、NRN22、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、アルキル、またはアリールであり、各RN2は、H、アルキル、またはアリールであり得る。
本明細書で使用されるとき、「アルカリール(alkaryl)」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアリール基を表す。例示の非置換アルカリール基は、7〜30個の炭素(例えば、C1−6アルク−C6−10アリール、C1−10アルク−C6−10アリール、またはC1−20アルク−C6−10アリール等の、7〜16または7〜20個の炭素)である。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびアリールは各々、それぞれの基について本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。接頭辞「アルク−」に続く他の基は、同じように定義され、ここで「アルク」は、別途注記のない限り、C1−6アルキレンを指し、結合される化学構造は、本明細書に定義される通りである。
「アルクシクロアルキル(alkcycloalkyl)」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基(例えば、1〜4、1〜6、1〜10、または1〜20個の炭素のアルキレン基)を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるシクロアルキル基を表す。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびシクロアルキルは各々、それぞれの基について本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「アルケニル」という用語は、別途明記されない限り、1つ以上の炭素−炭素二重結合を含有する、2〜20個の炭素(例えば、2〜6または2〜10個の炭素)の、一価の直鎖または分岐鎖基を表し、エテニル、1−プロペニル、2−プロペニル、2−メチル−1−プロペニル、1−ブテニル、2−ブテニル等により例として示される。アルケニルは、シスおよびトランス異性体の両方を含む。アルケニル基は、本明細書に定義されるアミノ、アリール、シクロアルキル、もしくはヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール)から独立して選択される1、2、3、もしくは4個の置換基、または本明細書に記載の例示のアルキル置換基のうちのいずれかで、任意に置換されてもよい。
「アルケニルオキシ」という用語は、式−ORの化学置換基を表し、式中、Rは、別途明記されない限り、C2−20アルケニル基(例えば、C2−6またはC2−10アルケニル)である。例示のアルケニルオキシ基には、エテニルオキシ、プロペニルオキシ等が含まれる。いくつかの実施形態において、アルケニル基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基(例えば、ヒドロキシ基)でさらに置換され得る。
「アルクヘテロアリール」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるヘテロアリール基を指す。例示の非置換アルクヘテロアリール基は、2〜32個の炭素(例えば、C1−6アルク−C1−12ヘテロアリール、C1−10アルク−C1−12ヘテロアリール、またはC1−20アルク−C1−12ヘテロアリール等の、2〜22、2〜18、2〜17、2〜16、3〜15、2〜14、2〜13、または2〜12個の炭素)である。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびヘテロアリールは各々、それぞれの基について本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。アルクヘテロアリール基は、アルクヘテロシクリル基の部分集合である。
「アルクヘテロシクリル」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。例示の非置換アルクヘテロシクリル基は、2〜32個の炭素(例えば、C1−6アルク−C1−12ヘテロシクリル、C1−10アルク−C1−12ヘテロシクリル、またはC1−20アルク−C1−12ヘテロシクリル等の、2〜22、2〜18、2〜17、2〜16、3〜15、2〜14、2〜13、または2〜12個の炭素)である。いくつかの実施形態において、アルキレンおよびヘテロシクリルは各々、それぞれの基について本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
「アルコキシ」という用語は、式−ORの化学置換基を表し、式中、Rは、別途明記されない限り、C1−20アルキル基(例えば、C1−6またはC1−10アルキル)である。例示のアルコキシ基には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ(例えば、n−プロポキシおよびイソプロポキシ)、t−ブトキシ等が含まれる。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基(例えば、ヒドロキシまたはアルコキシ)でさらに置換され得る。
「アルコキシアルコキシ」という用語は、アルコキシ基で置換されるアルコキシ基を表す。例示の非置換アルコキシアルコキシ基は、2〜40個の炭素(例えば、C1−6アルコキシ−C1−6アルコキシ、C1−10アルコキシ−C1−10アルコキシ、またはC1−20アルコキシ−C1−20アルコキシ等の、2〜12または2〜20個の炭素)を含む。いくつかの実施形態において、各アルコキシ基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
「アルコキシアルキル」という用語は、アルコキシ基で置換されるアルキル基を表す。例示の非置換アルコキシアルキル基は、2〜40個の炭素(例えば、C1−6アルコキシ−C1−6アルキル、C1−10アルコキシ−C1−10アルキル、またはC1−20アルコキシ−C1−20アルキル等の、2〜12または2〜20個の炭素)を含む。いくつかの実施形態において、アルキルおよびアルコキシは各々、それぞれの基について本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニル」という用語は、カルボニル原子を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアルコキシを表す(例えば、−C(O)−ORであり、式中、Rは、Hであるか、または任意に置換されるC1−6、C1−10、もしくはC1−20アルキル基である)。例示の非置換アルコキシカルボニルは、1〜21個の炭素(例えば、1〜11または1〜7個の炭素)を含む。いくつかの実施形態において、アルコキシ基は、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換される。
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニルアルコキシ」という用語は、本明細書に定義されるアルコキシカルボニル基で置換される、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す(例えば、−O−アルキル−C(O)−ORであって、式中、Rは、任意に置換されるC1−6、C1−10、またはC1−20アルキル基である)。例示の非置換アルコキシカルボニルアルコキシは、3〜41個の炭素(例えば、C1−6アルコキシカルボニル−C1−6アルコキシ、C1−10アルコキシカルボニル−C1−10アルコキシ、またはC1−20アルコキシカルボニル−C1−20アルコキシ等の、3〜10、3〜13、3〜17、3〜21、または3〜31個の炭素)を含む。いくつかの実施形態において、各アルコキシ基は、独立して、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基(例えば、ヒドロキシ基)でさらに置換される。
本明細書で使用されるとき、「アルコキシカルボニルアルキル」という用語は、本明細書に定義されるアルコキシカルボニル基で置換される、本明細書に定義されるアルキル基を表す(例えば、−アルキル−C(O)−ORであって、式中、Rは、任意に置換されるC1−20、C1−10、またはC1−6アルキル基である)。例示の非置換アルコキシカルボニルアルキルは、3〜41個の炭素(例えば、C1−6アルコキシカルボニル−C1−6アルキル、C1−10アルコキシカルボニル−C1−10アルキル、またはC1−20アルコキシカルボニル−C1−20アルキル等の、3〜10、3〜13、3〜17、3〜21、または3〜31個の炭素)を含む。いくつかの実施形態において、各アルキルおよびアルコキシ基は、独立して、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基(例えば、ヒドロキシ基)でさらに置換される。
本明細書で使用されるとき、「アルキル」という用語は、別途明記されない限り、1〜20個(例えば、1〜10または1〜6個)の炭素の直鎖および分岐鎖両方の飽和基を含む。アルキル基は、メチル、エチル、n−およびイソ−プロピル、n−、sec−、イソ−、およびtert−ブチル、ネオペンチル等により例として示され、次のものからなる群から独立して選択される1、2、3個の置換基で、または2個以上の炭素のアルキル基の場合には4個の置換基で、任意に置換されてもよい:(1)C1−6アルコキシ;(2)C1−6アルキルスルフィニル;(3)本明細書に定義されるアミノ(例えば、非置換アミノ(すなわち、−NH2)または置換アミノ(すなわち、−N(RN1)2、式中、RN1は、アミノについて定義される通りである);(4)C6−10アリール−C1−6アルコキシ;(5)アジド;(6)ハロ;(7)(C2−9ヘテロシクリル)オキシ;(8)ヒドロキシ;(9)ニトロ;(10)オキソ(例えば、カルボキシアルデヒドまたはアシル);(11)C1−7スピロシクリル;(12)チオアルコキシ;(13)チオール;(14)−CO2RA’(式中、RA’は、(a)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c)C6−10アリール、(d)水素、(e)C1−6アルク−C6−10アリール、(f)アミノ−C1−20アルキル、(g)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(15)−C(O)NRB’RC’(式中、RB’およびRC’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(16)−SO2RD’(式中、RD’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)C1−6アルク−C6−10アリール、および(d)ヒドロキシからなる群から選択される);(17)−SO2NRE’RF’(式中、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−C(O)RG’(式中、RG’は、(a)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c)C6−10アリール、(d)水素、(e)C1−6アルク−C6−10アリール、(f)アミノ−C1−20アルキル、(g)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(19)−NRH’C(O)RI’(式中、RH’は、(a1)水素および(b1)C1−6アルキルからなる群から選択され、RI’は、(a2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b2)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c2)C6−10アリール、(d2)水素、(e2)C1−6アルク−C6−10アリール、(f2)アミノ−C1−20アルキル、(g2)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h2)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(20)−NRJ’C(O)ORK’(式中、RJ’は、(a1)水素および(b1)C1−6アルキルからなる群から選択され、RK’は、(a2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b2)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c2)C6−10アリール、(d2)水素、(e2)C1−6アルク−C6−10アリール、(f2)アミノ−C1−20アルキル、(g2)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h2)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);ならびに(21)アミジン。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、C1−アルカリールのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイル(aryloyl)置換基をもたらすことができる。
本明細書で使用されるとき、「アルキレン」および接頭辞「アルク−」という用語は、2つの水素原子の除去によって直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素に由来する、飽和二価炭化水素基を表し、メチレン、エチレン、イソプロピレン等により例として示される。「Cx−yアルキレン」および接頭辞「Cx−yアルク−」という用語は、x〜y個の炭素を有するアルキレン基を表す。xに関する例示の値は、1、2、3、4、5、および6であり、yに関する例示の値は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、または20である(例えば、C1−6、C1−10、C2−20、C2−6、C2−10、またはC2−20アルキレン)。いくつかの実施形態において、アルキレンは、アルキル基について本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「アルキルスルフィニル」という用語は、−S(O)−基を介して親分子基に結合されるアルキル基を表す。例示の非置換アルキルスルフィニル基は、1〜6、1〜10、または1〜20個の炭素である。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「アルキルスルフィニルアルキル」という用語は、アルキルスルフィニル基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。例示の非置換アルキルスルフィニルアルキル基は、2〜12、2〜20、または2〜40個の炭素である。いくつかの実施形態において、各アルキル基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「アルキニル」という用語は、炭素−炭素三重結合を含有する、2〜20個の炭素原子(例えば、2〜4、2〜6、または2〜10個の炭素)の、一価の直鎖または分岐鎖基を表し、エチニル、1−プロピニル等により例として示される。アルキニル基は、本明細書に定義されるアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール)から独立して選択される1、2、3、もしくは4個の置換基、または本明細書に記載の例示のアルキル置換基のうちのいずれかで、任意に置換されてもよい。
「アルキニルオキシ」という用語は、式−ORの化学置換基を表し、式中、Rは、別途明記されない限り、C2−20アルキニル基(例えば、C2−6またはC2−10アルキニル)である。例示のアルキニルオキシ基には、エチニルオキシ、プロピニルオキシ等が含まれる。いくつかの実施形態において、アルキニル基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基(例えば、ヒドロキシ基)でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「アミジン」という用語は、−C(=NH)NH2基を表す。
本明細書で使用されるとき、「アミノ」という用語は、−N(RN1)2を表し、式中、各RN1は、独立して、H、OH、NO2、N(RN2)2、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、N−保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アルカリール、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、カルボキシアルキル、スルホアルキル、ヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール)、またはアルクヘテロシクリル(例えば、アルクヘテロアリール)であり、これらの列挙されるRN1基の各々は、各基について本明細書に定義されるように任意に置換され得るか、または2つのRN1が組み合わさって、ヘテロシクリルもしくはN保護基を形成し、各RN2は、独立して、H、アルキル、またはアリールである。本発明のアミノ基は、非置換アミノ(すなわち、−NH2)または置換アミノ(すなわち、−N(RN1)2)であり得る。好ましい実施形態において、アミノは、−NH2または−NHRN1であり、式中、RN1は、独立して、OH、NO2、NH2、NRN22、SO2ORN2、SO2RN2、SORN2、アルキル、カルボキシアルキル、スルホアルキル、またはアリールであり、各RN2は、H、C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、またはC6−10アリールであり得る。
本明細書に記載の「アミノ酸」という用語は、側鎖、アミノ基、および酸性基(例えば、−CO2Hのカルボキシ基または−SO3Hのスルホ基)を有する分子を指し、このアミノ酸は、側鎖、アミノ基、または酸性基(例えば、側鎖)によって親分子基に結合される。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、カルボニル基によって親分子基に結合され、この側鎖またはアミノ基は、カルボニル基に結合される。例示の側鎖には、任意に置換されるアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルカリール、アルクヘテロシクリル、アミノアルキル、カルバモイルアルキル、およびカルボキシアルキルが含まれる。例示のアミノ酸には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシノルバリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、ピロリジン、セレノシステイン、セリン、タウリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが含まれる。アミノ酸基は、次のものからなる群から独立して選択される1、2、3個の置換基で、または2個以上の炭素のアミノ酸基の場合には4個の置換基で、任意に置換されてもよい:(1)C1−6アルコキシ;(2)C1−6アルキルスルフィニル;(3)本明細書に定義されるアミノ(例えば、非置換アミノ(すなわち、−NH2)または置換アミノ(すなわち、−N(RN1)2(式中、RN1は、アミノについて定義される通りである));(4)C6−10アリール−C1−6アルコキシ;(5)アジド;(6)ハロ;(7)(C2−9ヘテロシクリル)オキシ;(8)ヒドロキシ;(9)ニトロ;(10)オキソ(例えば、カルボキシアルデヒドまたはアシル);(11)C1−7スピロシクリル;(12)チオアルコキシ;(13)チオール;(14)−CO2RA’(式中、RA’は、(a)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c)C6−10アリール、(d)水素、(e)C1−6アルク−C6−10アリール、(f)アミノ−C1−20アルキル、(g)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(15)−C(O)NRB’RC’(式中、RB’およびRC’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(16)−SO2RD’(式中、RD’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)C1−6アルク−C6−10アリール、および(d)ヒドロキシからなる群から選択される);(17)−SO2NRE’RF’(式中、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−C(O)RG’(式中、RG’は、(a)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c)C6−10アリール、(d)水素、(e)C1−6アルク−C6−10アリール、(f)アミノ−C1−20アルキル、(g)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(19)−NRH’C(O)RI’(式中、RH’は、(a1)水素および(b1)C1−6アルキルからなる群から選択され、RI’は、(a2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b2)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c2)C6−10アリール、(d2)水素、(e2)C1−6アルク−C6−10アリール、(f2)アミノ−C1−20アルキル、(g2)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h2)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);(20)−NRJ’C(O)ORK’(式中、RJ’は、(a1)水素および(b1)C1−6アルキルからなる群から選択され、RK’は、(a2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル)、(b2)C2−20アルケニル(例えば、C2−6アルケニル)、(c2)C6−10アリール、(d2)水素、(e2)C1−6アルク−C6−10アリール、(f2)アミノ−C1−20アルキル、(g2)−(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR’のポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、R’は、HまたはC1−20アルキルである)、および(h2)−NRN1(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NRN1のアミノ−ポリエチレングリコール(式中、s1は、1〜10(例えば、1〜6または1〜4)の整数であり、s2およびs3の各々は、独立して、0〜10(例えば、0〜4、0〜6、1〜4、1〜6、または1〜10)の整数であり、各RN1は、独立して、水素であるか、または任意に置換されるC1−6アルキルである)からなる群から選択される);ならびに(21)アミジン。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「アミノアルコキシ」という用語は、本明細書に定義されるアミノ基によって置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。アルキルおよびアミノは各々、それぞれの基について本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基(例えば、CO2RA’(式中、RA’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)水素、および(d)C1−6アルク−C6−10アリール、例えば、カルボキシからなる群から選択される))でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「アミノアルキル」という用語は、本明細書に定義されるアミノ基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。アルキルおよびアミノは各々、それぞれの基について本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基(例えば、CO2RA’(式中、RA’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)水素、および(d)C1−6アルク−C6−10アリール、例えば、カルボキシからなる群から選択される))でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「アリール」という用語は、1つまたは2つの芳香族環を有する単環式、二環式、または多環式の炭素環式環系を表し、フェニル、ナフチル、1,2−ジヒドロナフチル、1,2,3,4−テトラヒドロナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、インダニル、インデニル等により例として示され、次のものからなる群から独立して選択される1、2、3、4、または5個の置換基で任意に置換されてもよい:(1)C1−7アシル(例えば、カルボキシアルデヒド);(2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル、C1−6アルコキシ−C1−6アルキル、C1−6アルキルスルフィニル−C1−6アルキル、アミノ−C1−6アルキル、アジド−C1−6アルキル、(カルボキシアルデヒド)−C1−6アルキル、ハロ−C1−6アルキル(例えば、ペルフルオロアルキル)、ヒドロキシ−C1−6アルキル、ニトロ−C1−6アルキル、またはC1−6チオアルコキシ−C1−6アルキル);(3)C1−20アルコキシ(例えば、ペルフルオロアルコキシ等のC1−6アルコキシ);(4)C1−6アルキルスルフィニル;(5)C6−10アリール;(6)アミノ;(7)C1−6アルク−C6−10アリール;(8)アジド;(9)C3−8シクロアルキル;(10)C1−6アルク−C3−8シクロアルキル;(11)ハロ;(12)C1−12ヘテロシクリル(例えば、C1−12ヘテロアリール);(13) (C1−12ヘテロシクリル)オキシ;(14)ヒドロキシ;(15)ニトロ;(16)C1−20チオアルコキシ(例えば、C1−6チオアルコキシ);(17)−(CH2)qCO2RA’(式中、qは、0〜4の整数であり、RA’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)水素、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−(CH2)qCONRB’RC’(式中、qは、0〜4の整数であり、RB’およびRC’は、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から独立して選択される);(19)−(CH2)qSO2RD’(式中、qは、0〜4の整数であり、RD’は、(a)アルキル、(b)C6−10アリール、および(c)アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(20)−(CH2)qSO2NRE’RF’(式中、qは、0〜4の整数であり、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(21)チオール;(22)C6−10アリールオキシ;(23)C3−8シクロアルコキシ;(24)C6−10アリール−C1−6アルコキシ;(25)C1−6アルク−C1−12ヘテロシクリル(例えば、C1−6アルク−C1−12ヘテロアリール);(26)C2−20アルケニル;ならびに(27)C2−20アルキニル。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、C1−アルカリールまたはC1−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび(ヘテロシクリル)オイル置換基をもたらすことができる。
本明細書で使用されるとき、「アリールアルコキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアルカリール基を表す。例示の非置換アルコキシアルキル基は、7〜30個の炭素(例えば、C6−10アリール−C1−6アルコキシ、C6−10アリール−C1−10アルコキシ、またはC6−10アリール−C1−20アルコキシ等の、7〜16または7〜20個の炭素)を含む。いくつかの実施形態において、アリールアルコキシ基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基で置換され得る。
「アリールオキシ」という用語は、式−OR’の化学置換基を表し、式中、R’は、別途明記されない限り、6〜18個の炭素のアリール基である。いくつかの実施形態において、アリール基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基で置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「アリーロイル」という用語は、カルボニル基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるアリール基を表す。例示の非置換アリーロイル基は、7〜11個の炭素のものである。いくつかの実施形態において、アリール基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基で置換され得る。
「アジド」という用語は、−N3基を表し、それは、−N=N=Nとしても表され得る。
本明細書で使用されるとき、「二環式」という用語は、芳香族でも非芳香族でもあり得る2つの環を有する構造を指す。二環式構造には、本明細書に定義されるスピロシクリル基、および1つ以上の架橋を共有する2つの環が含まれ、そのような架橋は、1個の原子、または2個、3個、もしくはそれよりも多い原子を含む鎖を含むことができる。例示の二環式基には、二環式カルボシクリル基(その第1および第2の環は、本明細書に定義されるカルボシクリル基である);二環式アリール基(その第1および第2の環は、本明細書に定義されるアリール基である);二環式ヘテロシクリル基(その第1の環は、ヘテロシクリル基であり、第2の環は、カルボシクリル(例えば、アリール)またはヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール)基である);および二環式ヘテロアリール基(その第1の環は、ヘテロアリール基であり、第2の環は、カルボシクリル(例えば、アリール)またはヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール)基である)が含まれる。いくつかの実施形態において、二環式基は、シクロアルキル、ヘテロシクリル、およびアリール基について本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基で置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「炭素環式」および「カルボシクリル」という用語は、芳香族でも非芳香族でもあり得る環が炭素原子によって形成される、任意に置換されるC3−12単環式、二環式、または三環式構造を指す。炭素環式構造には、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびアリール基が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「カルバモイル」という用語は、−C(O)−N(RN1)2を表し、式中、各RN1の意味は、本明細書に提供される「アミノ」の定義において見出される。
本明細書で使用されるとき、「カルバモイルアルキル」という用語は、本明細書に定義されるカルバモイル基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。アルキル基は、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「カルバミル」という用語は、構造−NRN1C(=O)ORまたは−OC(=O)N(RN1)2を有するカルバメート基を指し、式中、各RN1の意味は、本明細書に提供される「アミノ」の定義において見出され、Rは、本明細書に定義されるアルキル、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、アリール、アルカリール、ヘテロシクリル(例えば、ヘテロアリール)、またはアルクヘテロシクリル(例えば、アルクヘテロアリール)である。
本明細書で使用されるとき、「カルボニル」という用語は、C(O)基を表し、それは、C=Oとしても表され得る。
「カルボキシアルデヒド」という用語は、構造−CHOを有するアシル基を表す。
本明細書で使用されるとき、「カルボキシ」という用語は、−CO2Hを意味する。
本明細書で使用されるとき、「カルボキシアルコキシ」という用語は、本明細書に定義されるカルボキシ基によって置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。アルコキシ基は、アルキル基について本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「カルボキシアルキル」という用語は、本明細書に定義されるカルボキシ基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。アルキル基は、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「シアノ」という用語は、−CN基を表す。
「シクロアルコキシ」という用語は、式−ORの化学置換基を表し、式中、Rは、別途明記されない限り、本明細書に定義されるC3−8シクロアルキル基である。シクロアルキル基は、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。例示の非置換シクロアルコキシ基は、3〜8個の炭素である。いくつかの実施形態において、シクロアルキル基は、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「シクロアルキル」という用語は、別途明記されない限り、3〜8個の炭素の一価の飽和または不飽和非芳香族環状炭化水素基を表し、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ビシクロ[2.2.1.]ヘプチル等により例として示される。シクロアルキル基が1つの炭素−炭素二重結合を含むとき、シクロアルキル基は、「シクロアルケニル」基と称され得る。例示のシクロアルケニル基には、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等が含まれる。本発明のシクロアルキル基は、次のもので任意に置換され得る:(1)C1−7アシル(例えば、カルボキシアルデヒド);(2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル、C1−6アルコキシ−C1−6アルキル、C1−6アルキルスルフィニル−C1−6アルキル、アミノ−C1−6アルキル、アジド−C1−6アルキル、(カルボキシアルデヒド)−C1−6アルキル、ハロ−C1−6アルキル(例えば、ペルフルオロアルキル)、ヒドロキシ−C1−6アルキル、ニトロ−C1−6アルキル、またはC1−6チオアルコキシ−C1−6アルキル);(3)C1−20アルコキシ(例えば、ペルフルオロアルコキシ等のC1−6アルコキシ);(4)C1−6アルキルスルフィニル;(5)C6−10アリール;(6)アミノ;(7)C1−6アルク−C6−10アリール;(8)アジド;(9)C3−8シクロアルキル;(10)C1−6アルク−C3−8シクロアルキル;(11)ハロ;(12)C1−12ヘテロシクリル(例えば、C1−12ヘテロアリール);(13) (C1−12ヘテロシクリル)オキシ;(14)ヒドロキシ;(15)ニトロ;(16)C1−20チオアルコキシ(例えば、C1−6チオアルコキシ);(17)−(CH2)qCO2RA’(式中、qは、0〜4の整数であり、RA’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)水素、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−(CH2)qCONRB’RC’(式中、qは、0〜4の整数であり、RB’およびRC’は、(a)水素、(b)C6−10アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から独立して選択される);(19)−(CH2)qSO2RD’(式中、qは、0〜4の整数であり、RD’は、(a)C6−10アルキル、(b)C6−10アリール、および(c)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(20)−(CH2)qSO2NRE’RF’(式中、qは、0〜4の整数であり、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C6−10アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(21)チオール;(22)C6−10アリールオキシ;(23)C3−8シクロアルコキシ;(24)C6−10アリール−C1−6アルコキシ;(25)C1−6アルク−C1−12ヘテロシクリル(例えば、C1−6アルク−C1−12ヘテロアリール);(26)オキソ;(27)C2−20アルケニル;ならびに(28)C2−20アルキニル。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、C1−アルカリールまたはC1−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび(ヘテロシクリル)オイル置換基をもたらすことができる。
本明細書で使用されるとき、「ジアステレオマー」という用語は、互いの鏡像でなく、互いの上に重ね合わせ不可能である、立体異性体を意味する。
本明細書で使用されるとき、本明細書で使用される薬剤の「有効量」は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用されている前後関係に依存する。例えば、癌を治療する薬剤を投与することの前後関係において、有効量の薬剤は、例えば、薬剤の投与を伴わずに得られる反応と比較して、本明細書に定義される癌の治療を達成するのに十分な量である。
本明細書で使用されるとき、「鏡像異性体」という用語は、少なくとも80%(すなわち、一方の鏡像異性体が少なくとも90%および他方の鏡像異性体が多くても10%)、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも98%の光学純度または鏡像異性体過剰率(当技術分野で標準の方法によって決定するとき)を有する、本発明の化合物の各個々の光学活性型を意味する。
本明細書で使用されるとき、「ハロ」という用語は、臭素、塩素、ヨウ素、またはフッ素から選択されるハロゲンを表す。
本明細書で使用されるとき、「ハロアルコキシ」という用語は、ハロゲン基(すなわち、F、Cl、Br、またはI)によって置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。ハロアルコキシは、1、2、3個のハロゲンで、または2個以上の炭素のアルキル基の場合には4個のハロゲンで置換されてもよい。ハロアルコキシ基には、ペルフルオロアルコキシ(例えば、−OCF3)、−OCHF2、−OCH2F、−OCCl3、−OCH2CH2Br、−OCH2CH(CH2CH2Br)CH3、および−OCHICH3が含まれる。いくつかの実施形態において、ハロアルコキシ基は、アルキル基について本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「ハロアルキル」という用語は、ハロゲン基(すなわち、F、Cl、Br、またはI)によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。ハロアルキルは、1、2、3個のハロゲンで、または2個以上の炭素のアルキル基の場合には4個のハロゲンで置換されてもよい。ハロアルキル基には、ペルフルオロアルキル(例えば、−CF3)、−CHF2、−CH2F、−CCl3、−CH2CH2Br、−CH2CH(CH2CH2Br)CH3、および−CHICH3が含まれる。いくつかの実施形態において、ハロアルキル基は、アルキル基について本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「ヘテロアルキレン」という用語は、構成炭素原子のうちの1個または2個が各々、窒素、酸素、または硫黄によって置き換えらた、本明細書に定義されるアルキレン基を指す。いくつかの実施形態において、ヘテロアルキレン基は、アルキレン基について本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「ヘテロアリール」という用語は、芳香族である、本明細書に定義されるヘテロシクリルの部分集合を表し、すなわち、それらは単環式または多環式環系内に4n+2個のπ電子を含有する。例示の非置換ヘテロアリール基は、1〜12個(例えば、1〜11、1〜10、1〜9、2〜12、2〜11、2〜10、または2〜9個)の炭素ものもである。いくつかの実施形態において、ヘテロアリールは、ヘテロシクリル基について定義される1、2、3、または4個の置換基で置換される。
本明細書で使用されるとき、「ヘテロシクリル」という用語は、別途明記されない限り、窒素、酸素、および硫黄からなる群から独立して選択される1、2、3、または4個のヘテロ原子を含有する、5、6、または7員環を表す。5員環は、0〜2つの二重結合を有し、6および7員環は、0〜3つの二重結合を有する。例示の非置換ヘテロシクリル基は、1〜12個(例えば、1〜11、1〜10、1〜9、2〜12、2〜11、2〜10、または2〜9個)の炭素のものである。「ヘテロシクリル」という用語は、1個以上の炭素および/またはヘテロ原子が単環式環の2つの隣接していない員を架橋する、架橋多環式構造を有する複素環式化合物、例えば、キヌクリジニル基も表す。「ヘテロシクリル」という用語は、上記の複素環式環のうちのいずれかが1、2、もしくは3つの炭素環式環、例えば、アリール環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環、シクロペンタン環、シクロペンテン環、またはインドリル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル等の別の単環式の複素環式環に縮合される、二環式、三環式、および四環式基を含む。縮合ヘテロシクリルの例としては、トロパンおよび1,2,3,5,8,8a−ヘキサヒドロインドリジンが挙げられる。複素環には、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピリジル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ピラジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、インドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル、ジヒドロキノキサリニル、キナゾリニル、シノリニル、フタラジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアジアゾリル、フリル、チエニル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル(例えば、1,2,3−オキサジアゾリル)、プリニル、チアジアゾリル(例えば、1,2,3−チアジアゾリル)、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロインドリル、ジヒドロキノリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ジヒドロイソキノリル、ピラニル、ジヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチエニル等が含まれ、1つ以上の二重結合が還元され、水素と置き換えられる、それらのジヒドロおよびテトラヒドロ形態を含む。さらに他の例示のヘテロシクリルには、2,3,4,5−テトラヒドロ−2−オキソ−オキサゾリル;2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−イミダゾリル;2,3,4,5−テトラヒドロ−5−オキソ−1H−ピラゾリル(例えば、2,3,4,5−テトラヒドロ−2−フェニル−5−オキソ−1H−ピラゾリル);2,3,4,5−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−1H−イミダゾリル(例えば、2,3,4,5−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−5−メチル−5−フェニル−1H−イミダゾリル);2,3−ジヒドロ−2−チオキソ−1,3,4−オキサジアゾリル(例えば、2,3−ジヒドロ−2−チオキソ−5−フェニル−1,3,4−オキサジアゾリル);4,5−ジヒドロ−5−オキソ−1H−トリアゾリル(例えば、4,5−ジヒドロ−3−メチル−4−アミノ5−オキソ−1H−トリアゾリル);1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソピリジニル(例えば、1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−3,3−ジエチルピリジニル);2,6−ジオキソ−ピペリジニル(例えば、2,6−ジオキソ−3−エチル−3−フェニルピペリジニル);1,6−ジヒドロ−6−オキソピリジミニル;1,6−ジヒドロ−4−オキソピリミジニル(例えば、2−(メチルチオ)−1,6−ジヒドロ−4−オキソ−5−メチルピリミジン−1−イル);1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソピリミジニル(例えば、1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−3−エチルピリミジニル);1,6−ジヒドロ−6−オキソ−ピリダジニル(例えば、1,6−ジヒドロ−6−オキソ−3−エチルピリダジニル);1,6−ジヒドロ−6−オキソ−1,2,4−トリアジニル(例えば、1,6−ジヒドロ−5−イソプロピル−6−オキソ−1,2,4−トリアジニル);2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−インドリル(例えば、3,3−ジメチル−2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−インドリルおよび2,3−ジヒドロ−2−オキソ−3,3’−スピロプロパン−1H−インドール−1−イル);1,3−ジヒドロ−1−オキソ−2H−イソ−インドリル;1,3−ジヒドロ−1,3−ジオキソ−2H−イソ−インドリル;1H−ベンゾピラゾリル(例えば、1−(エトキシカルボニル)−1H−ベンゾピラゾリル);2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズイミダゾリル(例えば、3−エチル−2,3−ジヒドロ−2−オキソ−1H−ベンズイミダゾリル);2,3−ジヒドロ−2−オキソ−ベンゾオキサゾリル(例えば、5−クロロ−2,3−ジヒドロ−2−オキソ−ベンゾオキサゾリル);2,3−ジヒドロ−2−オキソ−ベンゾオキサゾリル;2−オキソ−2H−ベンゾピラニル;1,4−ベンゾジオキサニル;1,3−ベンゾジオキサニル;2,3−ジヒドロ−3−オキソ,4H−1,3−ベンゾチアジニル;3,4−ジヒドロ−4−オキソ−3H−キナゾリニル(例えば、2−メチル−3,4−ジヒドロ−4−オキソ−3H−キナゾリニル);1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−3H−キナゾリル(例えば、1−エチル−1,2,3,4−テトラヒドロ−2,4−ジオキソ−3H−キナゾリル);1,2,3,6−テトラヒドロ−2,6−ジオキソ−7H−プリニル(例えば、1,2,3,6−テトラヒドロ−1,3−ジメチル−2,6−ジオキソ−7H−プリニル);1,2,3,6−テトラヒドロ−2,6−ジオキソ−1H−プリニル(例えば、1,2,3,6−テトラヒドロ−3,7−ジメチル−2,6−ジオキソ−1H−プリニル);2−オキソベンズ[c,d]インドリル;1,1−ジオキソ−2H−ナフト[1,8−c,d]イソチアゾリル;および1,8−ナフチレンジカルボキサミドが含まれる。さらなる複素環には、3,3a,4,5,6,6a−ヘキサヒドロ−ピロlo[3,4−b]ピロl−(2H)−イル、および2,5−ジアザビシクロ[2.2.1]ヘプタン−2−イル、ホモピペラジニル(またはジアゼパニル)、テトラヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、オキセパニル、チエパニル、アゾカニル、オキセカニル、およびチオカニルが含まれる。複素環基は、式:
の基も含み、式中、
E’は、−N−および−CH−からなる群から選択され、F’は、−N=CH−、−NH−CH2−、−NH−C(O)−、−NH−、−CH=N−、−CH2−NH−、−C(O)−NH−、−CH=CH−、−CH2−、−CH2CH2−、−CH2O−、−OCH2−、−O−、および−S−からなる群から選択され、G’は、−CH−および−N−からなる群から選択される。本明細書で言及されるヘテロシクリル基のうちのいずれかは、次のものからなる群から独立して選択される1、2、3、4、または5個の置換基で任意に置換されてもよい:(1)C1−7アシル(例えば、カルボキシアルデヒド);(2)C1−20アルキル(例えば、C1−6アルキル、C1−6アルコキシ−C1−6アルキル、C1−6アルキルスルフィニル−C1−6アルキル、アミノ−C1−6アルキル、アジド−C1−6アルキル、(カルボキシアルデヒド)−C1−6アルキル、ハロ−C1−6アルキル(例えば、ペルフルオロアルキル)、ヒドロキシ−C1−6アルキル、ニトロ−C1−6アルキル、またはC1−6チオアルコキシ−C1−6アルキル);(3)C1−20アルコキシ(例えば、ペルフルオロアルコキシ等のC1−6アルコキシ);(4)C1−6アルキルスルフィニル;(5)C6−10アリール;(6)アミノ;(7)C1−6アルク−C6−10アリール;(8)アジド;(9)C3−8シクロアルキル;(10)C1−6アルク−C3−8シクロアルキル;(11)ハロ;(12)C1−12ヘテロシクリル(例えば、C2−12ヘテロアリール);(13) (C1−12ヘテロシクリル)オキシ;(14)ヒドロキシ;(15)ニトロ;(16)C1−20チオアルコキシ(例えば、C1−6チオアルコキシ);(17)−(CH2)qCO2RA’(式中、qは、0〜4の整数であり、RA’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、(c)水素、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(18)−(CH2)qCONRB’RC’(式中、qは、0〜4の整数であり、RB’およびRC’は、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から独立して選択される);(19)−(CH2)qSO2RD’(式中、qは、0〜4の整数であり、RD’は、(a)C1−6アルキル、(b)C6−10アリール、および(c)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(20)−(CH2)qSO2NRE’RF’(式中、qは、0〜4の整数であり、RE’およびRF’の各々は、独立して、(a)水素、(b)C1−6アルキル、(c)C6−10アリール、および(d)C1−6アルク−C6−10アリールからなる群から選択される);(21)チオール;(22)C6−10アリールオキシ;(23)C3−8シクロアルコキシ;(24)アリールアルコキシ;(25)C1−6アルク−C1−12ヘテロシクリル(例えば、C1−6アルク−C1−12ヘテロアリール);(26)オキソ;(27)(C1−12ヘテロシクリル)イミノ;(28)C2−20アルケニル;ならびに(29)C2−20アルキニル。いくつかの実施形態において、これらの基の各々は、本明細書に記載されるようにさらに置換され得る。例えば、C1−アルカリールまたはC1−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、オキソ基でさらに置換されて、それぞれのアリーロイルおよび(ヘテロシクリル)オイル置換基をもたらすことができる。
本明細書で使用されるとき、「(ヘテロシクリル)イミノ」という用語は、イミノ基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基で置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「(ヘテロシクリル)オキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基で置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「(ヘテロシクリル)オイル」という用語は、カルボニル基を介して親分子基に結合される、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。いくつかの実施形態において、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義される1、2、3、または4個の置換基で置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「炭化水素」という用語は、炭素および水素原子のみからなる基を表す。
本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシ」という用語は、−OH基を表す。
本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシアルケニル」という用語は、1〜3個のヒドロキシ基によって置換された、本明細書に定義されるアルケニル基を表すが、但し、1個を超えるヒドロキシ基がアルキル基の単一の炭素原子に結合することはないことを条件とし、それはジヒドロキシプロペニル、ヒドロキシイソペンテニル等により例として示される。
本明細書で使用されるとき、「ヒドロキシアルキル」という用語は、1〜3個のヒドロキシ基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表すが、但し、1個を超えるヒドロキシ基が、アルキル基の単一の炭素原子に結合することはないことを条件とし、それはヒドロキシメチル、ジヒドロキシプロピル等により例として示される。
本明細書で使用されるとき、「異性体」という用語は、本発明の化合物のいずれかの任意の互変異性体、立体異性体、鏡像異性体、またはジアステレオマーを意味する。本発明の化合物は、1つ以上のキラル中心および/または二重結合を有することができ、したがって、二重結合異性体(すなわち、幾何E/Z異性体)またはジアステレオマー(例えば、鏡像異性体(すなわち、(+)または(−))またはシス/トランス異性体)等の立体異性体として存在し得ることが認識される。本発明に従って、本明細書に描写される化学構造、したがって本発明の化合物は、対応する立体異性体のすべて、つまり、立体異性的に純粋な形態(例えば、幾何的に純粋、鏡像異性的に純粋、またはジアステレオマー的に純粋)と、鏡像異性体混合物および立体異性体混合物、例えば、ラセミ体との両方を包含する。本発明の化合物の鏡像異性体混合物および立体異性体混合物は、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高性能液体クロマトグラフィー、キラル塩錯体としての化合物の結晶化、またはキラル溶媒中の化合物の結晶化等の周知の方法によって、典型的にそれらの構成要素の鏡像異性体または立体異性体へと分解することができる。鏡像異性体および立体異性体は、周知の不斉合成法によって、立体異性的または鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、および触媒からも得ることができる。
本明細書で使用されるとき、「N保護アミノ」という用語は、本明細書に定義される1つまたは2つのN保護基に結合している、本明細書に定義されるアミノ基を指す。
本明細書で使用されるとき、「N保護基」という用語は、合成手順中に、望ましくない反応に対してアミノ基を保護するよう意図される基を表す。一般的に使用されるN保護基は、参照により本明細書に組み込まれる、Greene,“Protective Groups in Organic Synthesis,” 3rd Edition(John Wiley & Sons,New York,1999)に開示されている。N保護基には、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、t−ブチルアセチル、2−クロロアセチル、2−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、o−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、4−クロロベンゾイル、4−ブロモベンゾイル、4−ニトロベンゾイル等の、アシル、アリーロイル、またはカルバミル基、および保護されたまたは保護されいないD、L、またはD等のキラル助剤、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン等のL−アミノ酸;ベンゼンスルホニル、p−トルエンスルホニル等のスルホニル含有基;ベンジルオキシカルボニル、p−クロロベンジルオキシカルボニル、p−メトキシベンジルオキシカルボニル、p−ニトロベンジルオキシカルボニル、2−ニトロベンジルオキシカルボニル、p−ブロモベンジルオキシカルボニル、3,4−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、3,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、2,4−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、4−メトキシベンジルオキシカルボニル、2−ニトロ−4,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、3,4,5−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、1−(p−ビフェニルyl)−1−メチルエトキシカルボニル、α,α−ジメチル−3,5−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、t−ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、2,2,2,−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、4−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−9−メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニル等のカルバメート形成基、ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチル等のアルカリール基、ならびにトリメチルシリル等のシリル基が含まれる。好ましいN保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、t−ブチルアセチル、アラニル、フェニルスルホニル、ベンジル、t−ブチルオキシカルボニル(Boc)、およびベンジルオキシカルボニル(Cbz)である。
本明細書で使用されるとき、「ニトロ」という用語は、−NO2基を表す。
本明細書で使用されるとき、「オキソ」という用語、=Oを表す。
本明細書で使用されるとき、「ペルフルオロアルキル」という用語は、アルキル基に結合した各水素ラジカルがフッ化物ラジカルによって置き換えられた、本明細書に定義されるアルキル基を表す。ペルフルオロアルキル基は、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチル等により例として示される。
本明細書で使用されるとき、「ペルフルオロアルコキシ」という用語は、アルコキシ基に結合した各水素ラジカルがフッ化物ラジカルによって置き換えられた、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。ペルフルオロアルコキシ基は、トリフルオロメトキシ、ペンタフルオロエトキシ等により例として示される。
本明細書で使用されるとき、「スピロシクリル」という用語は、その両端が親基の同じ炭素原子に結合してスピロ環式基を形成するC2−7アルキレンジラジカル、およびまた、その両端が同じ炭素原子に結合するC1−6ヘテロアルキレンジラジカルを表す。スピロシクリル基を形成するヘテロアルキレンラジカルは、窒素、酸素、および硫黄からなる群から独立して選択される1、2、3、または4個のヘテロ原子を含有することができる。いくつかの実施形態において、スピロシクリル基は、そのジラジカルが結合する炭素原子を除いて、1〜7個の炭素を含む。本発明のスピロシクリル基は、シクロアルキル基および/またはヘテロシクリル基に対する任意の置換基として本明細書に提供される1、2、3、または4個の置換基で任意に置換されてもよい。
本明細書で使用されるとき、「立体異性体」という用語は、化合物(例えば、本明細書に記載の任意の式の化合物)が有し得るすべての可能性のある様々な異性型ならびに立体配座型、特にすべての可能性のある立体化学的および立体配座的異性型、基本的な分子構造のすべてのジアステレオマー、鏡像異性体、および/または配座異性体を指す。本発明のいくつかの化合物は、異なる互変異性型として存在してもよく、後者のすべてが本発明の範囲内に含まれる。
本明細書で使用されるとき、「スルホアルキル」という用語は、−SO3Hのスルホ基によって置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「スルホニル」という用語は、−S(O)2−基を表す。
本明細書で使用されるとき、「チオアルカリール」という用語は、式−SRの化学置換基を表し、式中、Rは、アルカリール基である。いくつかの実施形態において、アルカリール基は、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「チオアルクヘテロシクリル」という用語は、式−SRの化学置換基を表し、式中、Rは、アルクヘテロシクリル基である。いくつかの実施形態において、アルクヘテロシクリル基は、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
本明細書で使用されるとき、「チオアルコキシ」という用語は、式−SRの化学置換基を表し、式中、Rは、本明細書に定義されるアルキル基である。いくつかの実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載の1、2、3、または4個の置換基でさらに置換され得る。
「チオール」という用語は、−SH基を表す。 化合物:本明細書で使用されるとき、「化合物」という用語は、描写される構造のすべての立体異性体、幾何異性体、互変異性体、および同位体を含むことが意図される。
本明細書に記載の化合物は、不斉であり得る(例えば、1つ以上の立体中心を有する)。別途指定されない限り、鏡像異性体およびジアステレオマー等の、すべての立体異性体が意図される。不斉置換炭素原子を含有する本開示の化合物は、光学活性型またはラセミ型で単離することができる。光学活性型を光学活性の出発物質からどのように調製するかに関する方法は、ラセミ混合物の分解によって、または立体選択的合成によって等、当技術分野で知られている。オレフィンの多くの幾何異性体、C=N二重結合等もまた、本発明に記載の化合物中に存在することができ、すべてのそのような安定な異性体が本開示において企図される。本開示の化合物のシスおよびトランス幾何異性体が記載され、それは異性体の混合物としてまたは分離した異性型として単離され得る。
本開示の化合物は、互変異性型も含む。互変異性型は、単結合の隣位二重結合との交換、およびプロトンの付随する移動からもたらされる。互変異性型は、同じ実験式および総電荷を有する異性体プロトン化状態である、プロトン互変異性体(prototropic tautomers)を含む。例示のプロトン互変異性体には、ケトン−エノール対、アミド−イミド酸対、ラクタム−ラクチム対、アミド−イミド酸対、エナミン−イミン対、およびプロトンが複素環式系の2つ以上の位置を占有し得る環状型、例えば、1H−および3H−イミダゾール、1H−、2H−、および4H−1,2,4−トリアゾール、1H−および2H−イソインドール、ならびに1H−および2H−ピラゾールが含まれる。互変異性型は、平衡し得るか、または適切な置換によって1つの形態へと立体的に固定され得る。
本開示の化合物は、中間体または最終化合物中で生じる原子の同位体もすべて含む。「同位体」は、同じ原子番号を有するが、核内の中性子の数が異なることに起因して異なる質量数を有する、原子を指す。例えば、水素の同位体には、トリチウムおよびジュウテリウムが含まれる。
本開示の化合物および塩は、通例の方法によって、溶媒または水分子と組み合わせて溶媒和物および水和物を形成することにより調製することができる。
保存される:本明細書で使用されるとき、「保存される」という用語は、比較されている2つ以上の配列の同じ位置において変化することなく生じる残基である、それぞれ、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基を指す。比較的保存されているヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列内の他の箇所に現れるヌクレオチドまたはアミノ酸よりも関連した配列の間で保存されているものである。
いくつかの実施形態において、2つ以上の配列は、それらが互いに100%同一である場合、「完全に保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、2つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも70%同一、少なくとも80%同一、少なくとも90%同一、または少なくとも95%同一である場合、「高度に保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、2つ以上の配列は、それらが互いに約70%同一、約80%同一、約90%同一、約95%、約98%、または約99%同一である場合、「高度に保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、2つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも30%同一、少なくとも40%同一、少なくとも50%同一、少なくとも60%同一、少なくとも70%同一、少なくとも80%同一、少なくとも90%同一、または少なくとも95%同一である場合、「保存される」と言われる。いくつかの実施形態において、2つ以上の配列は、それらが互いに約30%同一、約40%同一、約50%同一、約60%同一、約70%同一、約80%同一、約90%同一、約95%同一、約98%同一、または約99%同一である場合、「保存される」と言われる。配列の保存は、オリゴヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用してもよく、またはその一部分、領域、または特長に適用してもよい。
制御放出:本明細書で使用されるとき、「制御放出」という用語は、治療成果をもたらすために特定の放出パターンに適合する、薬学的組成物または化合物の放出プロファイルを指す。
環状または環化:本明細書で使用されるとき、「環状」という用語は、連続ループの存在を指す。環状分子は、円形である必要はなく、単に連結してサブユニットの途切れのない鎖を形成すればよい。本発明の操作されたRNAまたはmRNA等の環状分子は、単一ユニットであっても多量体であってもよく、または複合体もしくは高次構造の1つ以上の構成要素を含んでもよい。
細胞増殖抑制性:本明細書で使用されるとき、「細胞増殖抑制性」は、細胞(例えば、哺乳類細胞(例えば、ヒト細胞)、細菌、ウイルス、真菌、原虫、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせの成長、分裂、または増殖を阻害する、低減する、抑制することを指す。
細胞傷害性:本明細書で使用されるとき、「細胞傷害性」は、細胞(例えば、哺乳類細胞(例えば、ヒト細胞)、細菌、ウイルス、真菌、原虫、寄生虫、プリオン、またはこれらの組み合わせを死滅させるか、あるいはそれらに有害、有毒、または致命的な影響を引き起こすことを指す。
送達:本明細書で使用されるとき、「送達」は、化合物、物質、実体、部分、積荷、またはペイロードを送達する作用または様態を指す。
送達剤:本明細書で使用されるとき、「送達剤」は、標的とされる細胞へのポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのインビボ送達を少なくとも部分的に容易にする、任意の物質を指す。
不安定化される:本明細書で使用されるとき、「不安定な」、「不安定化する」、または「不安定化領域」という用語は、同じ領域または分子の出発形態、野生型、または天然型よりも安定性が低い領域または分子を意味する。
検出可能な標識:本明細書で使用されるとき、「検出可能な標識」は、放射線写真撮影、蛍光、化学発光、酵素的活性、吸光等を含む当技術分野で既知の方法によって容易に検出される別の実体と結合されるか、それとともに組み込まれるか、またはそれと会合される1つ以上のマーカー、シグナル、または部分を指す。検出可能な標識には、放射性同位体、フルオロフォア、発色団、酵素、色素、金属イオン、リガンド、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテン、量子ドット等が含まれる。検出可能な標識は、本明細書に開示のペプチドまたはタンパク質における任意の位置に位置してもよい。それらは、アミノ酸、ペプチド、もしくはタンパク質の内にあっても、またはN末端もしくはC末端に位置してもよい。
消化:本明細書で使用されるとき、「消化」という用語は、より小さい片または構成成分へと分解することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に言及するとき、消化は、ペプチドの産生をもたらす。
遠位:本明細書で使用されるとき、「遠位」という用語は、中心ら離れて、または目的とする点もしくは領域から離れて位置することを意味する。
投薬レジメン:本明細書で使用されるとき、「投薬レジメン」は、投与のスケジュール、または医師によって決定された治療、予防、もしくは緩和ケアのレジメンである。
用量分割係数(DSF)−用量分割治療のPUDを、総1日用量または単回単位用量のPUDで割った比率。値は、投薬レジメンの群の比較から導出される。
カプセル封入:本明細書で使用されるとき、「カプセル封入」という用語は、封入する、包囲する、または包み込むことを意味する。
コードされたタンパク質の切断シグナル:本明細書で使用されるとき、「コードされたタンパク質の切断シグナル」は、タンパク質切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
操作:本明細書で使用されるとき、本発明の実施形態は、それらが、構造的であろうと化学的であろうと、出発点分子、野生型分子、または天然分子から異なる特長または特性を有するように設計されるとき、「操作」される。
エクソソーム:本明細書で使用されるとき、「エクソソーム」は、哺乳類細胞によって分泌される小胞、またはRNA分解に関与する複合体である。
発現:本明細書で使用されるとき、核酸配列の「発現」は、次の事象のうちの1つ以上を指す:(1)DNA配列からのRNAテンプレートの生成(例えば、転写による)、(2)RNA転写のプロセシング(例えば、スプライシング、編集、5’キャップ形成、および/または3’末端プロセシングによる)、(3)RNAのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、および(4)ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
特長:本明細書で使用されるとき、「特長」は、特徴、特性、または特有の要素を指す。
製剤:本明細書で使用されるとき、「製剤」は、少なくともポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAと、送達剤とを含む。
断片:本明細書で使用されるとき、「断片」は、一部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された完全長タンパク質を消化することによって得られる、ポリペプチドを含み得る。
機能的:本明細書で使用されるとき、「機能的」生体分子は、それが特徴付けられる特性および/または活性を示す形態にある、生体分子である。
相同性:本明細書で使用されるとき、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子(例えば、DNA分子および/またはRNA分子)間、および/またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態において、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%同一または同様である場合、互いと「相同」であると見なされる。「相同」という用語は必然的に、少なくとも2つの配列(ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列)間の比較を指す。本発明に従って、2つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約20アミノ酸の少なくとも一続きにわたって少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%、95%、またはさらに99%である場合、相同であると見なされる。いくつかの実施形態において、相同ポリヌクレオチド配列は、少なくとも4〜5つの固有に指定されるアミノ酸の一続きをコードする能力によって特徴付けられる。60ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列について、相同性は、少なくとも4〜5つの固有に指定されるアミノ酸の一続きをコードする能力によって特徴付けられる。本発明に従って、2つのタンパク質配列は、タンパク質が、少なくとも約20アミノ酸の少なくとも一続きにわたって少なくとも約50%、60%、70%、80%、または90%同一である場合、相同であると見なされる。
同一性:本明細書で使用されるとき、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、オリゴヌクレオチド分子(例えば、DNA分子および/またはRNA分子)間、および/またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。2つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの算出は、例えば、最適な比較目的のために2つの配列を整列させることによって行うことができる(例えば、最適なアライメントのために第1および第2の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のために非同一配列を無視することができる)。ある特定の実施形態において、比較目的のために整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%である。対応するヌクレオチド位置におけるヌクレオチドが次いで比較される。第1の配列内の位置が、第2の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有されるとき、その分子は、その位置で同一である。2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れながら、配列によって共有される同一位置の数の関数である。2つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて遂行することができる。例えば、2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993、Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987、Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994、およびSequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991に記載の方法の等を用いて決定することができる。例えば、2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、MeyersおよびMiller(CABIOS,1989,4:11−17)のアルゴリズムを用いて決定することができ、それはPAM120重量残基表、12のギャップ長ペナルティ、および4のギャップペナルティを用いてALIGNプログラム(第2.0版)に組み込まれている。2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、あるいは、NWSgapdna.CMPマトリックスを使用するGCGソフトウェアパッケージにおけるGAPプログラムを用いて決定することができる。配列間の同一性パーセントを決定するために一般的に用いられる方法には、参照により本明細書に組み込まれるCarillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J Applied Math.,48:1073(1988)に開示の方法が含まれるが、これらに限定されない。同一性を決定するための技法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて成文化されている。2つの配列間の相同性を決定するための例示のコンピュータソフトウェアには、GCGプログラムパッケージ、Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research,12(1),387(1984))、BLASTP、BLASTN、およびFASTA、Altschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.、215、403(1990))が含まれるが、これらに限定されない。
遺伝子の発現を阻害する:本明細書で使用されるとき、「遺伝子の発現を阻害する」という表現は、遺伝子の発現産物の量の低減を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたRNA(例えば、mRNA)、または遺伝子から転写されたmRNAから翻訳されたポリペプチドであり得る。典型的に、mRNAのレベルの低減は、そこから翻訳されたポリペプチドのレベルの低減をもたらす。発現のレベルは、mRNAまたはタンパク質を測定するための標準的な技法を用いて決定されてもよい。
インビトロ:本明細書で使用されるとき、「インビトロ」という用語は、生物(例えば、動物、植物、または微生物)内ではなく、例えば、試験管または反応槽中、細胞培養物中、ペトリ皿中等の、人工的な環境で生じる事象を指す。
インビボ:本明細書で使用されるとき、「インビボ」という用語は、生物(例えば、動物、植物、もしくは微生物、またはその細胞もしくは組織)内で生じる事象を指す。
単離された:本明細書で使用されるとき、「単離された」という用語は、それが会合された(自然にであるか、実験的設定であるかにかかわらず)構成成分のうちの少なくとも一部から分離された物質または実体を指す。単離された物質は、それが会合した物質に関して様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質および/または実体は、それらが最初に会合されたその他の構成成分の少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、またはそれよりも多くから分離され得る。いくつかの実施形態において、単離された薬剤は、約80%超、約85%超、約90%超、約91%超、約92%超、約93%超、約94%超、約95%超、約96%超、約97%超、約98%超、約99%超、または約99%超純粋である。本明細書で使用されるとき、物質は、他の構成成分が実質的にない場合、「純粋」である。実質的に単離される:「実質的に単離される」とは、化合物が、それが形成されたまたは検出された環境から実質的に分離されることを意味する。部分的分離には、例えば、本開示の化合物を豊富に含んだ組成物が含まれ得る。実質的な分離には、少なくとも約50重量%、少なくとも約60重量%、少なくとも約70重量%、少なくとも約80重量%、少なくとも約90重量%、少なくとも約95重量%、少なくとも約97重量%、または少なくとも約99重量%の本開示の化合物、またはその塩を含有する組成物が含まれ得る。化合物およびそれらの塩を単離するための方法は、当技術分野で通例である。
リンカー:本明細書で使用されるとき、リンカーは、例えば、10〜1,000原子の原子団を指し、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、およびイミン等であるが、これらに限定されない、原子または群からなり得る。リンカーは、第1の末端で核酸塩基または糖部分上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドに、および第2の末端でペイロード、例えば、検出可能な薬剤または治療剤に、結合され得る。リンカーは、核酸配列への組み込みを干渉しないような十分な長さものもであり得る。リンカーは、任意の有用な目的のため、例えば、mmRNA多量体(例えば、2つ以上のポリヌクレオチド、一次構築物、もしくはmmRNA分子の連鎖を介して)またはmmRNA複合体を形成するため、かつ本明細書に記載のペイロードを投与するために使用することができる。リンカーに組み込むことができる化学基の例としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが挙げられるが、これらに限定されず、これらの各々は、本明細書に記載されるように任意に置換され得る。リンカーの例としては、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール(例えば、エチレンまたはプロピレングリコールモノマー単位、例えば、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール)、ならびにデキストランポリマーおよびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。他の例としては、還元剤または光分解を用いて切断され得る、例えば、ジスルフィド結合(−S−S−)またはアゾ結合(−N=N−)等の、リンカー内の切断可能部分が挙げられるが、これらに限定されない。選択的に切断可能な結合の非限定的な例としては、例えば、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、または他の還元剤および/もしくは光分解の使用によって切断され得る、アミド結合、ならびに例えば、酸性または塩基性加水分解によって切断され得る、エステル結合が挙げられる。
マイクロRNA(miRNA)結合部位:本明細書で使用されるとき、マイクロRNA(miRNA)結合部位は、miRNAの少なくとも「シード」領域が結合する、核酸転写物のヌクレオチド箇所または領域を表す。
修飾された:本明細書で使用されるとき、「修飾された」とは、本発明の分子の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、および機能的修飾を含む、多くの方式で修飾されてもよい。一実施形態において、本発明のmRNA分子は、例えば、それが天然リボヌクレオチドA、U、G、およびCに関わるとき、非天然ヌクレオシドおよび/またはヌクレオチドの導入によって修飾される。キャップ構造等の非標準のヌクレオチドは、それらがA、C、G、Uリボヌクレオチドの化学構造とは異なっていても「修飾される」と見なされない。
粘液:本明細書で使用されるとき、「粘液」は、粘性であり、ムチン糖タンパク質を含む、天然物質を指す。
天然に生じる:本明細書で使用されるとき、「天然に生じる」は、人工的補助を伴わずに自然界に存在することを意味する。
非ヒト脊椎動物:本明細書で使用されるとき、「非ヒト脊椎動物」には、野生種および家畜化された種を含む、ホモサピエンスを除くすべての脊椎動物が含まれる。非ヒト脊椎動物の例としては、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、水牛、およびヤク等の哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。
オフターゲット:本明細書で使用されるとき、「オフターゲット」は、任意の1つ以上の標的、遺伝子、または細胞転写物への任意の意図されない効果を指す。
オープンリーディングフレーム:本明細書で使用されるとき、「オープンリーディングフレーム」または「ORF」は、所与のリーディングフレーム内に終止コドンを含有しない配列を指す。
作動可能に連結される:本明細書で使用されるとき、「作動可能に連結される」という表現は、2つ以上の分子、構築物、転写物、実体、部分等の間の機能的結合を指す。
任意に置換される:本明細書において、「任意に置換されるX」(例えば、任意に置換されるアルキル)という形態の語句は、「Xであって、式中、Xは、任意に置換される」(例えば、「アルキル、式中、該アルキルは、任意に置換される」)と同等であることが意図される。特長「X」(例えば、アルキル)自体が任意であることを意味することは意図されない。
ペプチド:本明細書で使用されるとき、「ペプチド」は、50アミノ酸長以下、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50アミノ酸長である。
パラトープ:本明細書で使用されるとき、「パラトープ」は、抗体の抗原結合部位を指す。
患者:本明細書で使用されるとき、「患者」は、治療を求め得るもしくは治療を必要とし得る、治療を要する、治療を受けている、治療を受けることになる、または特定の疾患もしくは状態のために訓練を受けた専門家の看護下にある、対象を指す。
薬学的に許容される:「薬学的に許容される」という表現は、本明細書で、健全な医療判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに好適であり、妥当な便益/危険性比率に見合った、化合物、材料、組成物、および/または剤形を指すように用いられる。
薬学的に許容される賦形剤:本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される賦形剤」という表現は、本明細書に記載の化合物以外のものであり(例えば、活性化合物を懸濁させるまたは溶解させることが可能なビヒクル)、かつ患者において実質的に非毒性および非炎症性である特性を有する、任意の成分を指す。賦形剤には、例えば、粘着防止剤(antiadherents)、酸化防止剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤(compression aids)、崩壊剤、色素(色)、軟化剤、乳化剤、充填剤(希釈剤)、薄膜形成剤またはコーティング剤、香味剤、着香剤、流動促進剤(流動性促進剤)、滑沢剤、防腐剤、印刷インキ、吸着剤、懸濁化剤または分散化剤、甘味剤、および水和水が含まれてもよい。例示の賦形剤には、次のものが含まれるが、これらに限定されない:ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム(第二)、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋結合ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微小結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、α化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン(トウモロコシ)、ステアリン酸、ショ糖、タルク、二酸化チタン、ビタミンA、ビタミンE、ビタミンC、およびキシリトール。
薬学的に許容される塩:本開示は、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩も含む。本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される塩」は、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換する(例えば、遊離塩基を好適な有機酸と反応させることによって)ことによって親化合物が修飾される、開示される化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、アミン等の塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸等の酸性残基のアルカリ塩または有機塩等が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素、2−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリル酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチニン酸塩(ペクチンate)、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアネート、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が含まれる。代表的なアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等を含むが、これらに限定されない、非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオンが含まれる。本開示の薬学的に許容される塩には、例えば、非毒性無機酸または有機酸から形成される、親化合物の従来の非毒性塩が含まれる。本開示の薬学的に許容される塩は、従来の化学方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸型または遊離塩基型を、化学量論的量の適切な塩基または酸と、水中もしくは有機溶媒中で、またはその2つの混合物中で反応させることによって調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはブタノール)、またはアセトニトリル等の非水性媒体が好ましい。好適な塩の一覧は、各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる、Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,p.1418、Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl and C.G.Wermuth(eds.),Wiley−VCH,2008、およびBerge et al.,Journal of Pharmaceutical Science,66,1−19(1977)において見出される。
薬学的に許容される溶媒和物:本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される溶媒和物」という用語は、好適な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれる、本発明の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投薬量で生理学的に耐性がある。例えば、溶媒和物は、結晶化、再結晶化、または沈殿によって、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液から調製されてもよい。好適な溶媒の例としては、エタノール、水(例えば、一、二、および三水和物)、N−メチルピロリジノン(NMP)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、N,N’−ジメチルホルムアミド(DMF)、N,N’−ジメチルアセトアミド(DMAC)、1,3−ジメチル−2−イミダゾリジノン(DMEU)、1,3−ジメチル−3,4,5,6−テトラヒドロ−2−(1H)−ピリミジノン(DMPU)、アセトニトリル(ACN)、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、2−ピロリドン、ベンジル安息香酸塩等が挙げられる。水が溶媒であるとき、その溶媒和物は、「水和物」と称される。
薬物動態:本明細書で使用されるとき、「薬物動態」は、生存生物に投与される物質の運命の決定に関わるような、分子または化合物の任意の1つ以上の特性を指す。薬物動態は、吸収、分布、代謝、および排泄の程度および速度を含む、いくつかの領域に分割される。これは、一般的に、ADMEと称され、ここで(A)吸収は、物質が血液循環に進入するプロセスであり、(D)分布は、身体の流体および組織全体にわたる物質の分散または散布であり、(M)代謝(または生体内変換)は、親化合物の娘代謝産物への不可逆的な変換であり、(E)排泄(または排除)は、身体からの物質の排除を指す。まれな場合において、いくつかの薬物は、身体組織内に不可逆的に蓄積する。
物理化学:本明細書で使用されるとき、「物理化学」は、物理特性および/または化学特性のものまたはそれに関わることを意味する。
単位薬物当たりのポリペプチド(PUD):本明細書で使用されるとき、PUDまたは単位薬物当たり生成物は、通常は体液中の測定値で割ったpmol/mL、mmol/mL等の濃度単位で定義される、体液または組織内で測定するときの、生成物(ポリペプチド等)の総1日用量の細分割された部分(通常は1mg、pg、kg等)として定義される。
予防する:本明細書で使用されるとき、「予防する」という用語は、感染、疾患、障害、および/もしくは状態の発症を部分的もしくは完全に遅延させること;特定の感染、疾患、障害、および/もしくは状態の1つ以上の症状、特長、もしくは臨床徴候の発症を部分的もしくは完全に遅延させること;特定の感染、疾患、障害、および/もしくは状態の1つ以上の症状、特長、もしくは徴候の発症を部分的もしくは完全に遅延させること;感染からの、特定の疾患、障害、および/もしくは状態の進行を部分的もしくは完全に遅延させること;ならびに/または感染、疾患、障害、および/もしくは状態に関連した病理を発症する危険性を減少さることを指す。
プロドラッグ:本開示は、本明細書に記載の化合物のプロドラッグも含む。本明細書で使用されるとき、「プロドラッグ」は、化学的または物理的変化を経ると治療薬として作用する物質、分子、または実体に属する形態にある、任意の物質、分子、または実体を指す。プロドラッグは、何らかの方式で共有結合されるかまたは隔離され得、哺乳類対象に投与される前、投与されると、または投与された後に、活性薬物を放出するか、または活性薬物部分に変換される。プロドラッグは、化合物中に存在する官能基を、修飾部分が通例の操作でまたはインビボでのいずれかで親化合物へと切断されるような方式で修飾することによって、調製することができる。プロドラッグは、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基が任意の基に結合される化合物であり、それは哺乳類対象に投与されると、切断されてそれぞれ遊離ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基を形成する。プロドラッグの調製および使用は、両方とも参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、T.Higuchi and V.Stella,“Pro−drugs as Novel Delivery Systems,”Vol.14 of the A.C.S.Symposium Seriesに、およびBioreversible Carriers in Drug Design,ed.Edward B.Roche,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987で論じられている。
増殖する:本明細書で使用されるとき、「増殖する」という用語は、成長する、拡大する、もしくは増加する、または急速な成長、拡大、もしくは増加を引き起こすことを意味する。「増殖性」は、増殖する能力を有することを意味する。「抗増殖性」は、増殖特性に反するか、または増殖特性に不適切である特性を有することを意味する。
タンパク質切断部位:本明細書で使用されるとき、「タンパク質切断部位」は、化学的、酵素的、または光化学的手段によってアミノ酸鎖の制御された切断が遂行される部位を指す。
タンパク質切断シグナル:本明細書で使用されるとき、「タンパク質切断シグナル」は、切断のためにポリペプチドにフラグまたはマークを付ける少なくとも1つのアミノ酸を指す。
目的とするタンパク質:本明細書で使用されるとき、「目的とするタンパク質」または「所望のタンパク質」という用語は、本明細書に提供されるもの、ならびにそれらの断片、変異体、変異形、および改変体を含む。
近位:本明細書で使用されるとき、「近位」という用語は、中心の、または目的とする点もしくは領域のより近くに位置することを意味する。
シュードウリジン:本明細書で使用されるとき、シュードウリジンは、ヌクレオシドウリジンのC−グリコシド異性体を指す。「シュードウリジン類似体」は、シュードウリジンの任意の修飾、変異形、アイソフォーム、または誘導体である。例えば、シュードウリジン類似体には、1−カルボキシメチル−シュードウリジン、1−プロピニル−シュードウリジン、1−タウリノメチル−シュードウリジン、1−タウリノメチル−4−チオ−シュードウリジン、1−メチルシュードウリジン(m1ψ)、1−メチル−4−チオ−シュードウリジン(m1s4ψ)、4−チオ−1−メチル−シュードウリジン、3−メチル−シュードウリジン(m3ψ)、2−チオ−1−メチル−シュードウリジン、1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロシュードウリジン、2−チオ−ジヒドロシュードウリジン、2−メトキシウリジン、2−メトキシ−4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−シュードウリジン、4−メトキシ−2−チオ−シュードウリジン、N1−メチル−シュードウリジン、1−メチル−3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)シュードウリジン(acp3ψ)、および2’−O−メチル−シュードウリジン(ψm)が含まれるが、これらに限定されない。
精製される:本明細書で使用されるとき、「精製する」、「精製される」、「精製」は、実質的に純粋にするか、または望ましくない構成成分、汚染材料、混和物、もしくは不完全性を取り除くことを意味する。
試料:本明細書で使用されるとき、「試料」または「生体試料」という用語は、その組織、細胞、または構成部分の部分集合(例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液、および精液を含むが、これらに限定されない体液)を指す。試料には、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸器管、腸管、および尿生殖器管、涙液、唾液、乳、血液細胞、腫瘍、器官を含むが、これらに限定されない、全生物、またはその組織、細胞、もしくは構成部分の部分集合、またはその画分もしくは一部分から調製される、ホモジネート、可溶化液、または抽出物がさらに含まれ得る。試料はさらに、タンパク質または核酸分子等の細胞構成成分を含有し得る、栄養ブロスまたはゲル等の培地を指す。
シグナル配列:本明細書で使用されるとき、「シグナル配列」という表現は、タンパク質の輸送または局在化を指示することができる配列を指す。
単回単位用量:本明細書で使用されるとき、「単回単位用量」は、1回用量/一度に/単一経路/単一接触点、すなわち、単一の投与事象において投与される、任意の治療薬の用量である。
類似性:本明細書で使用されるとき、「類似性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子(例えば、DNA分子および/またはRNA分子)間、および/またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。ポリマー分子の互いとの類似性パーセントの算出は、同一性パーセントの算出と同様に行うことができるが、当技術分野で理解されるように、類似性パーセントの算出が保存的置換を考慮に入れることを除く。
分割用量:本明細書で使用されるとき、「分割用量」は、単回単位用量または総1日用量の、2つ以上の用量への分割である。
安定した:本明細書で使用されるとき、「安定した」は、反応混合物から有用な純度で単離後に残存するのに十分に強固であり、好ましくは効果的な治療剤へと製剤可能である、化合物を指す。
安定化される:本明細書で使用されるとき、「安定化」、「安定化される」、「安定化領域」という用語は、安定させるまたは安定となることを意味する。
対象:本明細書で使用されるとき、「対象」または「患者」という用語は、本発明に従う組成物が、例えば、実験、診断、予防、および/または治療目的のために投与され得る、任意の生物を指す。典型的な対象には、動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒト等の哺乳動物)および/または植物が含まれる。
実質的に:本明細書で使用されるとき、「実質的に」という用語は、目的とする特徴または特性の全範囲もしくは程度またはほぼ全範囲もしくは程度を示す、定性的状態を指す。生物学技術分野の専門家であれば、生物学的および化学的現象が、完了するかつ/もしくは完了まで進行する、または絶対的な結果を達成するもしくはそれを回避することは、あってもまれであることを理解するであろう。「実質的に」という用語は、したがって、多くの生物学的および化学的現象に本来的に存在するの完全性の潜在的な欠如を捕捉するように本明細書で使用される。
実質的に等しい:それが用量間の時差に関するように本明細書で使用されるとき、この用語は、プラス/マイナス2%を意味する。
実質的に同時に:本明細書で使用され、かつそれが複数の用量に関するとき、この用語は、2秒以内を意味する。
を患う:疾患、障害、および/または状態「を患う」個体は、疾患、障害、および/もしくは状態であると診断されているか、または疾患、障害、および/もしくは状態の1つ以上の症状を呈する。
に罹患しやすい:疾患、障害、および/または状態「に罹患しやすい」個体は、疾患、障害、および/もしくは状態であると診断されておらず、かつ/または疾患、障害、および/もしくは状態の症状を呈しないことがあるが、疾患もしくはその症状を発症する傾向を内部に持つ。いくつかの実施形態において、疾患、障害、および/または状態(例えば、癌)に罹患しやすい個体は、次のうちのうちの1つ以上によって特徴付けられ得る:(1)疾患、障害、および/または状態の発症に関連した遺伝子突然変異、(2)疾患、障害、および/または状態の発症に関連した遺伝子多型、(3)疾患、障害、および/または状態に関連したタンパク質および/または核酸の増加したおよび/または減少した発現および/または活性、(4)疾患、障害、および/または状態の発症に関連した習慣および/または生活様式、(5)疾患、障害、および/または状態の家族歴、ならびに(6)疾患、障害、および/または状態の発症に関連した微生物への曝露および/またはその微生物への感染。いくつかの実施形態において、疾患、障害、および/または状態に罹患しやすい個体は、その疾患、障害、および/または状態を発症することになる。いくつかの実施形態において、疾患、障害、および/または状態に罹患しやすい個体は、その疾患、障害、および/または状態を発症することにはならない。
持続放出:本明細書で使用されるとき、「持続放出」という用語は、特定の一定期間にわたる放出速度に適合する、薬学的組成物または化合物放出プロファイルを指す。
合成:「合成」という用語は、人間の手によって生成される、調製される、および/または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的であっても酵素的であってもよい。
標的とされる細胞:本明細書で使用されるとき、「標的とされる細胞」は、目的とする任意の1つ以上の細胞を指す。この細胞は、インビトロで、インビボで、インサイツで、または生物の組織もしくは器官内で見つけられ得る。生物は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、最も好ましくは患者であり得る。
治療剤:「治療剤」という用語は、対象に投与されたときに、治療、診断、および/もしくは予防効果を有し、かつ/または所望の生物学的および/もしくは薬理学的効果を誘発する、任意の薬剤を指す。
治療上有効量:本明細書で使用されるとき、「治療上有効量」という用語は、感染、疾患、障害、および/または状態を患うか、またはそれらに罹患しやすい対象に投与されたときに、感染、疾患、障害、および/または状態を治療する、その症状を改善する、診断する、予防する、かつ/またはその発症を遅延させるのに十分である、送達対象の薬剤(例えば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤等)の量を意味する。
治療上有効成果:本明細書で使用されるとき、「治療上有効成果」という用語は、感染、疾患、障害、および/または状態を患うか、またはそれらに罹患しやすい対象において、感染、疾患、障害、および/または状態を治療し、その症状を改善し、診断し、予防し、かつ/またはその発症を遅延させるのに十分である成果を意味する。
総1日用量:本明細書で使用されるとき、「総1日用量」は、24時間の期間に与えられるまたは処方される量である。それは、単回単位用量として投与されてもよい。
転写因子:本明細書で使用されるとき、「転写因子」という用語は、例えば、転写の活性化または抑制によって、DNAのRNAへの転写を調節する、DNA結合タンパク質を指す。いくつかの転写因子は、転写の調節を単独でもたらす一方で、他の転写因子は、他のタンパク質と協働して作用する。いくつかの転写因子は、ある特定の条件下で、転写の活性化および抑制の両方を行うことができる。一般に、転写因子は、標的遺伝子の調節領域内の特定のコンセンサス配列に非常に類似した、特定の標的配列(単数または複数)に結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写を単独でまたは他の分子と複合して調節し得る。
治療する:本明細書で使用されるとき、「治療する」という用語は、特定の感染、疾患、障害、および/もしくは状態の1つ以上の症状または特徴を、部分的にまたは完全に緩和すること、寛解させること、改善すること、軽減すること、その発症を遅延させること、その進行を阻害すること、その重症度を低減すること、および/またはその発生率を低減することを指す。例えば、癌を「治療する」とは、腫瘍の生存、成長、および/または転移を阻害することを指し得る。治療は、疾患、障害、および/または状態に関連した病理を発症する危険性を減少させる目的のために、疾患、障害、および/もしくは状態の徴候を呈しない対象に、ならびに/または疾患、障害、および/もしくは状態の早期徴候のみを呈する対象に投与されてもよい。
未修飾:本明細書で使用されるとき、「未修飾」は、任意の方式で変化させられる前の任意の物質、化合物、または分子を指す。未修飾は、生体分子の野生型または天然型を指し得るが、必ずしもそうとは限らない。分子は、一連の修飾を経てもよく、それによって各修飾分子は、その後の修飾のための「未修飾」出発分子としての役目を果たし得る。
均等物および範囲 当業者であれば、ほんの日常的な実験を用いて、本明細書に記載の本発明に従う具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、解明することができる。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるようには意図されず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されるように限定されることが意図される。
特許請求の範囲において、「a」、「an」、および「the」等の冠詞は、それとは反対の指定があるか、または文脈から別途明白でない限り、1つまたは2つ以上を意味し得る。群の1つ以上の構成員の間に「または」を含む特許請求項または記述は、それとは反対の指定があるか、または文脈から別途明白でない限り、その群の構成員のうちの1つ、2つ以上、またはすべてが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、それにおいて用いられるか、あるいはそれと関連性がある場合、満たされると見なされる。本発明は、群の厳密に1つの構成員が所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、それにおいて用いられるか、あるいはそれと関連性のある実施形態を含む。本発明は、群の構成員のうちの1つを超えるものまたはすべてが所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、それにおいて用いられるか、あるいはそれと関連性のある実施形態を含む。
また、「含む」という用語は、制限がないことが意図され、さらなる要素またはステップの組み込みを許容するが、それを必要とするわけではないことに留意する。「含む」という用語が本明細書で使用されるとき、「からなる」という用語もそれ故に包含され、開示される。
範囲が与えられる場合、端点が含まれる。さらに、別途指定されるか、または文脈および当業者の理解から別途明白でない限り、範囲として表される値は、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、本発明の異なる実施形態において定められる範囲内で、その範囲の下限の単位の10分の1までの任意の具体的な値または部分範囲をとることができることを理解されたい。
さらに、先行技術の範囲内に該当する本発明の任意の特定の実施形態が、請求項のうちの任意の1つ以上から明示的に除外されてもよいことを理解されたい。そのような実施形態は当業者に既知であるとされるため、その除外が本明細書に明示的に記載されないとしても、それらは除外されてもよい。本発明の組成物の任意の特定の実施形態(例えば、任意の核酸またはそれによってコードされるタンパク質、任意の産生方法、任意の使用方法等)が、先行技術の存在に関連するか否かに関わらず、任意の理由で、任意の1つ以上の請求項から除外され得る。
すべての引用される情報源、例えば、参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリ、および本明細書に引用される技術は、引用文に明示的に述べられないとしても、参照により本出願に組み込まれる。引用される情報源および本出願の相反する記述がある場合には、本出願における記述が優先されるものとする。
節および表の見出しは、限定するようには意図されない。
実施例1.修飾mRNAの産生 本発明に従う修飾mRNA(mmRNA)は、標準的な実験室方法および材料を用いて作製することができる。目的とする遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)は、ポリA尾部の鋳型付加のために、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有し得る5’非翻訳領域(UTR)および/またはオリゴ(dT)配列を含み得るα−グロビン3’UTRに隣接し得る。修飾mRNAは、細胞の自然免疫応答を低減させるように修飾され得る。細胞の応答を低減させる修飾には、シュードウリジン(ψ)および5−メチル−シチジン(5meC、5mc、またはm5C)が含まれ得る(それぞれ、参照により全体が本明細書に組み込まれる、Kariko K et al.Immunity 23:165−75(2005)、Kariko K et al.Mol Ther 16:1833−40(2008)、Anderson BR et al.NAR(2010)を参照のこと)。
ORFは、DNA2.0(Menlo Park,CA)等であるが、これに限定されない最適化サービスから購入することができる、様々な上流または下流付加(β−グロビン、タグ等であるがこれらに限定されない)も含み得、XbaI認識を有し得る複数のクローニング部位も含有し得る。構築物を受容すると、それが再構築され、化学的にコンピテントな大腸菌に変換され得る。
本発明には、NEB DH5−αコンピテント大腸菌を使用する。変換は、NEBの指示に従って、100ngのプラスミドを用いて行う。プロトコルは次の通りである。 1 氷上のNEB 5−αコンピテント大腸菌細胞の管を10分間解凍する。 2 1pg〜100ngのプラスミドDNAを含有する1〜5μLを細胞混合物に添加する。管を慎重に4〜5回振り、細胞とDNAを混合する。ボルテックスしないこと。 3 混合物を30分間氷上に置く。混ぜないこと。 4 42℃で正確に30秒間熱ショックを与える。混ぜないこと。 5 5分間氷上に置く。混ぜないこと。 6 室温のSOCを950μLピペットで混合物に入れる。 7 37℃で60分間置く。激しく振盪させる(250rpm)か、または回転させる。 8 選択プレートを37℃に温める。 9 管を振り、逆さにすることによって完全に細胞を混合する。
50〜100μLの各希釈物を選択プレートに広げ、37℃で一晩インキュベートする。あるいは、30℃で24〜36時間または25℃で48時間インキュベートする。
次いで、単一コロニーを使用し、適切な抗生物質を用いて5mLのLB成長培地を接種し、5時間成長させる(250RPM、37℃)。次いで、これを使用して、200mLの培養培地を接種し、同じ条件下で一晩成長させる。
プラスミドを単離するために(最大850μg)、製造業者の指示に従ってInvitrogen PURELINK(商標)HiPure Maxiprep Kit(Carlsbad,CA)を用いてマキシプレップを行う。
インビトロ転写(IVT)のためのcDNAを生成するために、プラスミド(この例は図3に示される)を、XbaI等の制限酵素を用いてまず線形化する。XbaIでの典型的な制限消化には、以下が含まれる:プラスミド1.0μg;10倍緩衝液1.0μL;XbaI1.5μL;dH20最大10μL;37℃で1時間のインキュベーション。実験室規模(5μg未満)で行う場合、製造業者の指示に従ってInvitrogenのPURELINK(商標)PCR Micro Kit(Carlsbad,CA)を用いて、反応物を浄化する。より大規模な精製は、Invitrogenの標準的PURELINK(商標)PCR Kit(Carlsbad,CA)等、より大きな充填容量を有する製品を用いて行う必要があり得る。浄化した後、線形化されたベクターを、NanoDropを用いて定量化し、アガロースゲル電気泳動を用いて分析して線形化を確認する。
本明細書に記載の修飾mRNA作製方法を用いて、長い分子を含むすべての大きさの分子を産生することができる。記載の方法を用いて、酸性αグルコシダーゼ(GAA)(3.2kb)、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)(4.7kb)、第VII因子(7.3kb)、リソソーム酸リパーゼ(45.4kDa)、グルコセレブロシダーゼ(59.7kDa)、およびイズロン酸2−スルファターゼ(76kDa)を含む異なる大きさの分子の修飾mRNAが作製された。
非限定的な例として、G−CSFは、目的とするポリペプチドを表し得る。実施例1〜5に概説されるステップに使用される配列を、表11に示す。開始コドン(ATG)は、表11の各配列中に下線で示されていることに留意されたい。 表11.G−CSFの配列
実施例2:cDNA産生のためのPCR cDNAの調製のためのPCR手順を、Kapa Biosystems(Woburn,MA)による2×KAPA HIFI(商標)HotStart ReadyMixを用いて行う。このシステムには、2×KAPA ReadyMix12.5μL、順方向プライマー(10uM)0.75μL、逆方向プライマー(10uM)0.75μL、鋳型cDNA100ng、および25.0μLに希釈したdH20が含まれる。反応条件は、95℃で5分間、98℃で20秒間を25サイクル、その後58℃で15秒間、続いて72℃で45秒間、次いで72℃で5分間、次いで4℃で終了までである。
本発明の逆方向プライマーは、mRNAにおけるポリA120のためのポリT120を組み込む。より長いかまたは短いポリ(T)路を有する他の逆方向プライマーを使用して、mRNAにおけるポリ(A)尾部の長さを調節することができる。
反応物を、製造業者の指示に従ってInvitrogenのPURELINK(商標)PCR Micro Kit(Carlsbad,CA)を用いて浄化する(5μgまで)。より大規模な反応は、より大容量の製品を用いて浄化する必要がある。浄化した後、cDNAを、NANODROP(商標)を用いて定量化し、アガロースゲル電気泳動によって分析して、cDNAが予測した大きさであることを確認する。次いで、cDNAを、シークエンシング分析に出した後に、インビトロ転写反応を進める。
実施例3.インビトロ転写(IVT) インビトロ転写反応により、修飾ヌクレオチドまたは修飾RNAを含有するmRNAを生成する。投入するヌクレオチドトリホスフェート(NTP)混合物は、天然および非天然のNTPを用いてで自家作製したものである。
典型的なインビトロ転写反応物には、次のものが含まれる。 1 鋳型cDNA 1.0μg 2 10倍転写緩衝液(400mM Tris−HCl pH8.0、190mM MgCl2、50mM DTT、10mMスペルミジン) 2.0μL 3 カスタムNTP(25mMずつ) 7.2μL 4 RNase阻害剤 20U 5 T7 RNAポリメラーゼ 3000U 6 dH20 最大20.0μL 7 37℃で3時間〜5時間のインキュベーション。
粗製IVT混合物を、翌日の浄化のために4℃で一晩保管され得る。次いで、1UのRNase不含DNaseを使用して、元の鋳型を消化させる。37℃で15分間のインキュベーションの後、mRNAを、製造業者の指示に従ってAmbionのMEGACLEAR(商標)Kit(Austin,TX)を用いて精製する。このキットは、最大500μgのRNAを精製することができる。浄化させた後、RNAを、NanoDropを用いて定量化し、アガロースゲル電気泳動によって分析して、RNAが適正な大きさであること、およびRNAの分解が生じていないことを確認する。
実施例4.mRNAの酵素キャッピング mRNAのキャッピングを、次のように行い、混合物には、IVT RNAが60μg〜180μgおよびdH20が最大72μL含まれる。混合物を、65℃で5分間インキュベートしてRNAを変性させ、その後すぐに氷上に移す。
このプロトコルは、次いで、10倍キャッピング緩衝液(0.5M Tris−HCl(pH8.0)、60mM KCl、12.5mM MgCl2)(10.0μL)、20mM GTP(5.0μL)、20mM S−アデノシルメチオニン(2.5μL)、RNase阻害剤(100U)、2’−O−メチルトランスフェラーゼ(400U)、ワクシニアキャッピング酵素(グアニリルトランスフェラーゼ)(40U)、dH20(28μLまで)、および60μgのRNAについては37℃で30分間のインキュベーションまたは180μgのRNAでは最大2時間のインキュベーションを伴う。
次いで、mRNAを、製造業者の指示に従ってAmbionのMEGACLEAR(商標)Kit(Austin,TX)を用いて精製する。浄化させた後、RNAを、NANODROP(商標)(ThermoFisher,Waltham,MA)を用いて定量化し、アガロースゲル電気泳動によって分析して、RNAが適正な大きさであること、およびRNAの分解が生じていないことを確認する。また、配列決定のためのcDNAを生成するために、RNA産物に、逆転写PCRを実行して配列決定を行ってもよい。
実施例5.ポリAテーリング反応 cDNAにポリTがない場合、最終産物を浄化する前に、ポリAテーリング反応を行う必要がある。これは、キャップされたIVT RNA(100μL)、RNase阻害剤(20U)、10倍テーリング緩衝液(0.5M Tris−HCl(pH8.0)、2.5M NaCl、100mM MgCl2)(12.0μL)、20mM ATP(6.0μL)、ポリAポリメラーゼ(20U)、dH20最大123.5μLを混合し、37℃で30分間インキュベートすることによって行う。ポリA尾部が既に転写物中に存在する場合、テーリング反応を省略し、直接AmbionのMEGACLEAR(商標)kit(Austin,TX)(最大500μg)での浄化に進んでもよい。ポリAポリメラーゼは、好ましくは、酵母に発現される組み換え酵素である。
本明細書において実行および記載される研究においては、ポリA尾部は、160ヌクレオチド長を含むように、IVT鋳型にコードされる。しかしながら、ポリAテーリング反応の進行性または完全性は、常に正確に160個のヌクレオチドをもたらすわけではないことを理解されたい。したがって、約160ヌクレオチド、例えば、約150〜165、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、または165のポリA尾部は、本発明の範囲内である。
実施例6.天然の5’キャップおよび5’キャップ類似体 修飾RNAの5’キャッピングは、製造業者のプロトコルに従って、次の化学的RNAキャップ類似体を用いたインビトロ転写反応の際に付随して完了し得、5’グアノシンキャップ構造が生成される:3’−O−Me−m7G(5’)ppp(5’)G[ARCAキャップ]、G(5’)ppp(5’)A、G(5’)ppp(5’)G、m7G(5’)ppp(5’)A、m7G(5’)ppp(5’)G(New England BioLabs,Ipswich,MA)。修飾RNAの5’キャッピングは、ワクシニアウイルスキャッピング酵素を用いて転写後に完了し、「キャップ0」構造:m7G(5’)ppp(5’)G(New England BioLabs,Ipswich,MA)を生成し得る。キャップ1構造は、ワクシニアウイルスキャッピング酵素および2’−Oメチルト−ランスフェラーゼの両方を用いて生成され得、m7G(5’)ppp(5’)G−2’−O−メチルが得られる。キャップ2構造は、2’−Oメチル−トランスフェラーゼを用いて、5’末端から3番目のヌクレオチドの2’−O−メチル化の後に、キャップ1構造から生成され得る。キャップ3構造は、2’−Oメチル−トランスフェラーゼを用いて、5’末端から4番目のヌクレオチドの2’−O−メチル化の後に、キャップ2構造から生成され得る。酵素は、好ましくは組み換え源に由来する。
哺乳動物細胞にトランスフェクトする場合、修飾mRNAは、12〜18時間、または18時間を超える、例えば、24、36、48、60、72、もしくは72時間を超える安定性を有する。
実施例7.キャッピング A.タンパク質発現アッセイ ARCA(3’O−Me−m7G(5’)ppp(5’)G)キャップ類似体またはキャップ1構造を含有する、ヒトG−CSFをコードする合成mRNA(cDNAは配列番号26165に示され、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾されたmRNA配列は配列番号26168に示され、約160ヌクレオチド(nucletoidie)長のポリA尾部は配列内には示されない)を、等濃度でヒト初代ケラチノサイトにトランスフェクトすることができる。トランスフェクションの6、12、24、および36時間後に、培養培地に分泌されたG−CSFの量を、ELISAによってアッセイすることができる。培地中により高レベルのG−CSFを分泌する合成mRNAは、より高度は翻訳的にコンピテントなキャップ構造を有する合成mRNAに対応する。
B.純度分析合成 ARCAキャップ類似体またはキャップ1構造の粗製合成産物を含有する、ヒトG−CSFをコードする合成mRNA(cDNAは配列番号26165に示され、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾されたmRNA配列は配列番号26168に示され、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない)を、変性アガロース−尿素ゲル電気泳動またはHPLC分析を用いて、純度について比較することができる。電気泳動により単一の集約された帯域を有する合成mRNAは、複数の帯域または筋状の帯域を有する合成mRNAと比較して、より高い純度の産物に対応する。単一のHPLCピークを有する合成mRNAもより高い純度の産物に対応する。より高効率のキャッピング反応により、より純粋なmRNA集団が得られる。
C.サイトカイン分析 ARCAキャップ類似体またはキャップ1構造を含有する、ヒトG−CSFをコードする合成mRNA(cDNAは配列番号26165に示され、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換により完全に修飾されたmRNA配列は配列番号26168に示され、約160ヌクレオチド長のポリA尾部は配列内に示されない)を、複数の濃度でヒト初代ケラチノサイトにトランスフェクトすることができる。トランスフェクションの6、12、24、および36時間後に、培養培地に分泌されたTNF−αおよびIFN−β等の炎症促進性サイトカインの量を、ELISAによってアッセイすることができる。培地中により高レベルの炎症促進性サイトカインを分泌する合成mRNAは、免疫活性化キャップ構造を有する合成mRNAに対応する。
D.キャッピング反応効率 ARCAキャップ類似体またはキャップ1構造を含有する、ヒトG−CSFをコードする合成mRNA(cDNAは配列番号26165に示される、5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換により完全に修飾されたmRNA配列は各シトシンにおける配列番号26168に示され、約160ヌクレオチド長のポリA尾部は、配列内に示されない)を、キャップされたmRNAのヌクレアーゼ処理の後に、LC−MSによってキャッピング反応効率について分析することができる。キャップされたmRNAのヌクレアーゼ処理により、LC−MSによって検出可能な遊離ヌクレオチドとキャップされた5’−5−トリホスフェートキャップ構造の混合物が得られる。LC−MSスペクトル上のキャップされた生成物の量は、反応からの全mRNAの割合として表すことができ、キャッピング反応効率に対応するであろう。より高いキャッピング反応効率を有するキャップ構造は、LC−MSにより、より高い量のキャップされた生成物を有するであろう。
実施例8.修飾RNAまたはRT PCR産物のアガロースゲル電気泳動 個々の修飾RNA(20μL体積中200〜400ng)または逆転写されたPCR産物(200〜400ng)を、非変性1.2%アガロースE−ゲル(Invitrogen,Carlsbad,CA)のウェルに充填し、製造業者のプロトコルに従って12〜15分間泳動させる。
実施例9.Nanodrop修飾RNAの定量化およびUVスペクトルデータ TE緩衝液(1μL)中の修飾RNAを、Nanodrop UV吸光読み取りに使用して、インビトロ転写反応からの各RNAの収率を定量化する。
実施例10.リピドイドを用いた修飾mRNAの製剤化 修飾mRNA(mmRNA)を、細胞に添加する前に、設定された比率でmmRNAとリピドイドとを混合することによってインビトロでの実験用に製剤化する。インビボ製剤は、身体全体への循環を促進するために、追加の成分の添加を要する場合がある。インビボでの働きに好適な粒子を形成するこれらのリピドイドの能力を試験するために、siRNA−リピドイド製剤に使用される標準的な製剤化プロセスを、起始点として使用した。初期mmRNA−リピドイド製剤は、42%リピドイド、48%コレステロール、および10%PEGから構成される粒子からなり得、比率のさらなる最適化が可能である。粒子の形成後にmmRNAを添加し、複合体と一体化させる。カプセル封入効率を、標準的な色素排除アッセイを用いて判定する。
実施例11〜15の材料および方法 A.脂質合成 6つの脂質、DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、およびDLin−MC3−DMAを、修飾RNAとともに製剤化するために、当技術分野で概説される方法によって合成した。DLin−DMAおよび前駆体を、Heyes et.al,J.Control Release,2005,107,276−287に記載されるように合成した。DLin−K−DMAおよびDLin−KC2−DMA、ならびに前駆体を、Semple et.al,Nature Biotechnology,2010,28,172−176に記載されるように合成した。98N12−5および前駆体を、Akinc et.al,Nature Biotechnology,2008,26,561−569に記載されるように合成した。
C12−200および前駆体を、Love et.al,PNAS,2010,107,1864−1869に概説される方法に従って合成した。2−エポキシドデカン(5.10g、27.7mmol、8.2当量)を、Amine 200(0.723g、3.36mmol、1当量)および撹拌子を含有するバイアルに添加した。バイアルを密封し、80℃に温めた。反応物を、80℃で4日間撹拌した。次いで、混合物を、純粋ジクロロメタン(DCM)からDCM:MeOH 98:2の勾配を用いてシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。標的化合物をRP−HPLCによってさらに精製して、所望の化合物を得た。
DLin−MC3−DMAおよび前駆体を、参照により全体が本明細書に組み込まれるWO2010054401号に記載の手順に従って合成した。10mLのDMF中のジリノレイルメタノール(1.5g、2.8mmol、1当量)、N,N−ジメチルアミノ酪酸(1.5g、2.8mmol、1当量)、DIPEA(0.73mL、4.2mmol、1.5当量)、およびTBTU(1.35g、4.2mmol、1.5当量)の混合物を、室温で10時間撹拌した。次いで、反応混合物をエーテル中に希釈し、水で洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物を、DCMからDCM:MeOH 98:2の勾配を用いてシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。続いて、標的化合物を、さらなるRP−HPLC精製に供し(これはYMC-Pack C4カラムを用いて行った)、標的化合物を得た。
B.修飾RNAナノ粒子の製剤化 合成脂質、1,2−ジステアロイル−3−ホスファチジルコリン(DSPC)(Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL)、コレステロール(Sigma−Aldrich,Taufkirchen,Germany)、およびα−[3’−(1,2−ジミリストイル−3−プロパノキシ)−カルボキサミド−プロピル]−ω−メトキシ−ポリオキシエチレン(PEG−c−DOMG)(NOF,Bouwelven,Belgium)の溶液を、エタノール中50mMの濃度で調製し、−20℃で保管した。脂質を合わせて、50:10:38.5:1.5(脂質:DSPC:コレステロール:PEG−c−DOMG)のモル比を得、25mMの最終脂質濃度までエタノールで希釈した。水中1〜2mg/mLの濃度の修飾mRNAの溶液を、pH3で50mMのクエン酸ナトリウム緩衝液中に希釈して、修飾mRNAのストック溶液を形成した。合成脂質溶液と修飾mRNA溶液を、10:1、15:1、20:1、および30:1の総脂質対修飾mRNAの重量比で合わせることによって、脂質および修飾mRNAの製剤を調製した。脂質エタノール溶液を、修飾mRNA水溶液に迅速に注入して、33%のエタノールを含有する懸濁液を得た。溶液は、手動(MI)またはシリンジポンプ(SP)を用いてのいずれかで注入した(Harvard Pump 33 Dual Syringe Pump Harvard Apparatus Holliston,MA)。
エタノールを除去し、緩衝液交換を達成するために、製剤を、10kDの分子量カットオフ(MWCO)で、Slide−A−Lyzerカセット(Thermo Fisher Scientific Inc.Rockford,IL)を用いて、一次産物の200倍の体積でpH7.4においてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に対して2回透析した。1回目の透析は、室温で3時間行い、次いで、製剤を4℃で一晩透析した。結果として得られたナノ粒子懸濁液を、0.2μmの滅菌フィルター(Sarstedt,Numbrecht,Germany)を通して濾過してガラスバイアルに入れ、圧着密閉した。
C.製剤の特徴付け Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)を使用して、修飾mRNAナノ粒子の粒径、多分散指標(PDI)、およびゼータ電位を、粒径の判定時は1倍PBS中、およびゼータ電位の判定時は15mMのPBS中において、判定した。
紫外可視分光法を用いて、修飾mRNAナノ粒子製剤の濃度を判定した。1倍PBS中に希釈した100μLの製剤を、900μLの4:1(v/v)のメタノールとクロロホルムの混合物に添加した。混合した後、溶液の吸光度スペクトルを、DU 800分光光度計(Beckman Coulter,Beckman Coulter,Inc.,Brea,CA)において、230nm〜330nmで記録した。ナノ粒子製剤中の修飾RNAの濃度を、製剤に使用した修飾RNAの減衰係数および260nmの波長での吸光度と330nmの波長でのベースラインとの間の差に基づいて計算した。
QUANT−IT(商標)RIBOGREEN(登録商標)RNAアッセイ(Invitrogen Corporation Carlsbad,CA)を用いて、ナノ粒子による修飾RNAのカプセル封入を評価した。試料を、TE緩衝液(10mM Tris−HCl、1mM EDTA、pH7.5)中約5μg/mLの濃度に希釈した。50μLの希釈試料を、ポリスチレン96ウェルプレートに移し、次いで、50μLのTE緩衝液または50μLの2%Triton X−100溶液のいずれかを添加した。プレートを37℃の温度で15分間インキュベートした。RIBOGREEN(登録商標)試薬を、TE緩衝液中1:100で希釈し、100μLのこの溶液を、各ウェルに添加した。蛍光強度を、約480nmの励起波長および約520nmの発光波長で、蛍光プレートリーダー(Wallac Victor 1420 Multilablel Counter;Perkin Elmer,Waltham,MA)を用いて測定した。試薬ブランクの蛍光値を、各試料のそれぞれのものから差し引き、遊離修飾RNAの割合(%)は、無傷な試料(Triton X−100の添加なし)の蛍光強度を分断した試料(Triton X−10の添加によって引き起こされた)の蛍光値で除すことによって判定した。
D.インビトロインキュベーション ヒト胎児腎臓上皮(HEK293)および肝細胞癌上皮(HepG2)細胞(LGC standards GmbH,Wesel,Germany)を、96−ウェルプレート(Greiner Bio−one GmbH,Frickenhausen,Germany)に播種し、HEK293細胞のプレートは1型コラーゲンで事前コーティングされていた。100μLの細胞培養培地中、HEK293は1ウェル当たり30,000細胞の密度で播種し、HepG2は35,000細胞の密度で播種した。HEK293については、細胞培養培地は、2mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、および1x非必須アミノ酸(Biochrom AG,Berlin,Germany)、ならびに1.2mg/mLの重炭酸ナトリウム(Sigma−Aldrich,Munich,Germany)を添加した、DMEM、10%FCSであり、HepG2については、培養培地は、2mM L−グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、および1x非必須アミノ酸(Biochrom AG,Berlin,Germanyを添加した、MEM(Gibco Life Technologies,Darmstadt,Germany)、10%FCSであった。mCherry mRNA(mRNA配列は配列番号26169に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、細胞を播種した直後に四重に添加し、インキュベートした。インビトロ転写(IVT)に使用される、T7プロモーター、5’非翻訳領域(UTR)、および3’UTRを有するmCherry cDNAを、配列番号26170に示す。mCherry mRNAを、各シトシンにおける5meCおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で修飾した。
培養培地上清を96ウェルPro−Bind U底プレート(Beckton Dickinson GmbH,Heidelberg,Germany)に移すことによって、細胞を収集した。細胞を、半量のトリプシン/EDTA(Biochrom AG,Berlin,Germany)でトリプシン化し、それぞれの上清とともにプールし、1回量のPBS/2%FCS(いずれもBiochrom AG,Berlin,Germany)/0.5%ホルムアルデヒド(Merck,Darmstadt,Germany)を添加することによって固定した。次いで、試料を、LSRIIサイトメーター(Beckton Dickinson GmbH,Heidelberg,Germany)において、532nmの励起レーザーおよびPE−Texas Red用の610/20フィルターを用いてフローサイトメーター測定にかけた。すべてのイベントの平均蛍光強度(MFI)および4つの独立したウェルの標準偏差を、分析した試料について提示する。
実施例11.ナノ粒子製剤の精製 HEK293およびHepG2においてDLin−KC2−DMAおよび98N12−5のナノ粒子製剤を試験し、平均蛍光強度(MFI)が脂質と修飾RNAの比、および/または精製に依存するかどうかを判定した。DLin−KC2−DMAの3つの製剤と98N12−5の2つの製剤を、シリンジポンプを用いて表12に記載される仕様に生成した。精製試料は、SEPHADEX(商標)G−25 DNAグレード(GE Healthcare,Sweden)によって精製した。精製の前および後(aP)の各製剤を、24ウェルプレートにおいて、1ウェル当たり250ngの修飾RNAの濃度で試験した。各製剤およびバックグラウンド試料についてフローサイトメーターによって分析したときにFL4チャネルのマーカーが陽性である細胞の割合(FL4陽性%)、ならびに各製剤およびバックグラウンド試料についてのFL4チャネルのマーカーのMFIを、表13に示す。精製されている製剤は、精製前に試験した製剤よりもわずかに高いMFIを有した。 表12.製剤
表13.HEK293およびHepG2、24ウェル、250ngの修飾RNA/ウェル
実施例12.濃度応答曲線 98N12−5(NPA−005)およびDLin−KC2−DMA(NPA−003)のナノ粒子製剤を、種々の濃度で試験して、広範な濃度にわたり、FL4またはmCherry(mRNA配列は配列番号26169に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)のMFIを判定した。試験した製剤を表14に概要説明する。98N12−5のナノ粒子製剤の最適な濃度を判定するために、様々な濃度の製剤化された修飾RNA(1ウェル当たり100ng、10ng、1.0ng、0.1ng、および0.01ng)を、24ウェルプレートのHEK293において試験し、各用量のFL4 MFIの結果を表15に示す。同様に、DLin−KC2−DMAのナノ粒子製剤の最適な濃度を判定するために、様々な濃度の製剤化された修飾RNA(1ウェル当たり250ng 100ng、10ng、1.0ng、0.1ng、および0.01ng)を、24ウェルプレートのHEK293において試験し、各用量のFL4 MFIの結果を表16に示す。DLin−KC2−DMAのナノ粒子製剤も、様々な濃度の製剤化された修飾RNA(1ウェル当たり250ng、100ng、および30ng)で24ウェルプレートのHEK293において試験し、FL4 MFIの結果を表17に示す。98N12−5については1ng/ウェルの用量、およびDLin−KC2−DMAについては10ng/ウェルの用量が、バックグランドのFL4 MFIに類似していることがわかった。
濃度がバックグラウンドにどの程度類似しているかを判定するために、mCherry発現の検出用に最適化されたフィルターセットを有するフローサイトメーターを利用し、バックグラウンドレベルと比較して増加した感受性で結果を得ることができた。25ng/ウェル、0.25ng/ウェル、0.025ng/ウェル、および0.0025ng/ウェルの用量を、98N12−5(NPA−005)およびDLin−KC2−DMA(NPA−003)について分析して、mCherryのMFIを判定した。表18に示されるように、0.025ng/ウェルおよびそれ以下の濃度は、約386.125であるmCherryのバックグラウンドMFIレベルに類似している。 表14.製剤
表15.HEK293、NPA−005、24ウェル、n=4
表16.HEK293、NPA−003、24ウェル、n=4
表17.HEK293、NPA−003、24ウェル、n=4
表18.濃度およびMFI
実施例13.手動注入およびシリンジポンプ製剤 DLin−KC2−DMAおよび98N12−5の2つの製剤を、手動注入(MI)およびシリンジポンプ注入(SP)によって調製し、バックグラウンド試料とともに分析して、異なる製剤のmCherry(mRNA配列は配列番号26169に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)のMFIを比較した。表19は、シリンジポンプ製剤が、同じ脂質および脂質/RNA比の手動注入製剤と比較して、高いMFIを有したことを示す。 表19.製剤およびMFI
実施例14.脂質ナノ粒子製剤 DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、およびDLin−MC3−DMAの製剤を、HEK293のプレートでは60ng/ウェルまたは62.5ng/ウェルの濃度で、HepG2細胞のプレートでは62.5ng/ウェルの濃度で、24時間インキュベートして、各製剤についてmCherry(mRNA配列は配列番号26169に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)のMFIを判定した。試験した製剤を、以下の表20に概略説明する。60ng/ウェルについては表21に、62.5ng/ウェルについては表22、23、24、および25に示されるように、NPA−003およびNPA−018の製剤が、最も高いmCherry MFIを有し、NPA−008、NPA−010、およびNPA−013の製剤は、バックグラウンド試料のmCherry MFI値に最も類似している。 表20.製剤
表21.HEK293、96ウェル、60ngの修飾RNA/ウェル
表22.HEK293、62.5ng/ウェル
表23.HEK293、62.5ng/ウェル
表24.HepG2、62.5ng/ウェル
表25.HepG2、62.5ng/ウェル
実施例15.インビボ製剤研究 齧歯動物(n=5)に、修飾mRNAおよび脂質を含有する製剤の単回用量を、静脈内、皮下、または筋肉内投与する。齧歯動物に投与する修飾mRNAは、G−CSF(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)、エリスロポエチン(EPO)(mRNA配列は配列番号26171に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)、第IX因子(mRNA配列は配列番号26172に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)、またはmCherry(mRNA配列は配列番号26169に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)から選択される。インビトロ転写(IVT)に使用される、T7プロモーター、5’非翻訳領域(UTR)、および3’UTRを有するエリスロポエチンcDNAを、配列番号26173および配列番号26174に示す。
各製剤はまた、DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、DLin−MC3−DMA、reLNP、ATUPLEX(登録商標)、DACC、およびDBTCのうちの1つから選択される脂質を含有する。齧歯動物に、100μg、10μg、または1μgの製剤化された修飾mRNAを注入し、試料を指定時間間隔で採取する。
ヒトG−CSF修飾mRNAを含有する製剤を投与した齧歯動物からの血清を、特異的G−CSF ELISAによって測定し、ヒト第IX因子修飾RNAを投与したマウスからの血清を、特異的第IX因子ELISAまたは発色アッセイによって分析する。mCherry修飾mRNAを投与したマウスからの肝臓および脾臓を、免疫組織化学(IHC)または蛍光活性化細胞選別(FACS)によって分析する。対照として、1つのマウス群にはいずれの製剤も注入せずに、それらの血清および組織を採取し、ELISA、FACS、および/またはIHCによって分析する。
A.経時変化 齧歯動物に、少なくとも1つの修飾mRNAを含有する製剤を投与して、投与した製剤のタンパク質発現の経時変化を研究する。齧歯動物に、修飾mRNA製剤の投与の前後に指定時間間隔で採血を行って、タンパク質発現および全血球数を判定する。試料を、修飾mRNA製剤を皮下または筋肉内投与した齧歯動物の投与部位からも採取して、組織内のタンパク質発現を判定する。
B.用量応答 齧歯動物に、少なくとも1つの修飾mRNAを含有する製剤を投与して、各製剤の用量応答を判定する。齧歯動物に、修飾mRNA製剤の投与の前後に指定時間間隔で採血を行って、タンパク質発現および全血球数を判定する。さらに、齧歯動物を屠殺して、修飾mRNA製剤の内部組織への作用を分析する。試料を、修飾mRNA製剤を皮下または筋肉内投与した齧歯動物の投与部位からも採取して、組織内のタンパク質発現を判定する。
C.毒性 齧歯動物に、少なくとも1つの修飾mRNAを含有する製剤を投与して、各製剤の毒性を研究する。齧歯動物に、修飾mRNA製剤の投与の前後に指定時間間隔で採血を行って、タンパク質発現および全血球数を判定する。さらに、齧歯動物を屠殺して、修飾mRNA製剤の内部組織への作用を分析する。試料を、修飾mRNA製剤を皮下または筋肉内投与した齧歯動物の投与部位からも採取して、組織内のタンパク質発現を判定する。
実施例16.PLGAマイクロスフェア製剤 PLGAマイクロスフェアの製剤化に使用されるパラメータの最適化により、マイクロスフェアにカプセル封入された修飾RNAの完全性を維持すると同時に、調整可能な放出速度および高いカプセル封入効率を可能にすることができる。粒径、回収率、およびカプセル封入効率等であるがこれらに限定されないパラメータを最適化して、最適な製剤を達成することができる。
A.PLGAマイクロスフェアの合成 ポリ乳酸グリコール酸(PLGA)マイクロスフェアを、PLGA(Lactel、カタログ番号B6010−2、固有粘度0.55〜0.75、50:50のLA:GA)、ポリビニルアルコール(PVA)(Sigma、カタログ番号348406−25G、MW 13−23k)、ジクロロメタン、および水を使用して、当技術分野で既知の水/油/水の二重乳化法を用いて合成した。手短に、0.1mLの水(W1)を、PLGAの濃度範囲50〜200mg/mLで、ジクロロメタン(DCM)(O1)中に溶解させた2mLのPLGAに添加した。W1/O1エマルションを、速度4(約15,000rpm)で30秒間均質化させた(IKA Ultra−Turrax hom*ogenizer,T18)。次いで、W1/O1エマルションを100〜200mLの0.3〜1%のPVA(W2)に添加し、種々の速度で1分間均質化させた。製剤をそのまま3時間撹拌させ、次いで、遠心分離により洗浄した(20〜25分間、4,000rpm、4℃)。上清を廃棄し、PLGAのペレットを5〜10mLの水に再懸濁させ、これを2回繰り返した。各製剤の平均粒径(20〜30個の粒子を表す)を、洗浄後の顕微鏡検査により判定した。表26は、PLGA濃度の増加が、より大きな粒径のマイクロスフェアをもたらしたことを示す。200mg/mLのPLGA濃度は、14.8μmの平均粒径をもたらし、100mg/mLでは8.7μmであり、50mg/mLのPLGAでは4.0μmの平均粒径をもたらした。 表26.PLGA濃度の変化
表27は、5(約20,000rpm)から速度4(約15,000rpm)への均質化速度の減少により、14.8μmから29.7μmへの粒径増加がもたらされたことを示す。 表27.均質化速度の変化
表28は、W2の体積を増加させること(すなわち、W2:O1の比を50:1から100:1に増加させること)により、平均粒径がわずかに減少したことを示す。0.3から1重量%へのPVA濃度の変化は、PLGAマイクロスフェアの大きさにほとんど影響を及ぼさなかった。 表28.W2の体積および濃度の変化
B.修飾mRNAのカプセル封入 修飾G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を、2mg/mL(W3)の濃度で水中に溶解させた。3つのバッチのPLGAマイクロスフェア製剤を、次のパラメータに従って上述のように作製した:2mg/mLで0.1mLのW3、200mg/mLで1.6mLのO1、1%で160mLのW2、ならびに第1のエマルション(W3/O1)は速度3で均質化、および第2のエマルション(W3/O1/W2)は速度5で均質化。遠心分離によって洗浄した後、製剤を液体窒素中で凍結させ、次いで3日間凍結乾燥させた。製剤のカプセル封入効率を試験するために、凍結乾燥材料を、DCM中で6時間脱製剤化(deformulated)させた後、一晩水中に抽出した。次いで、試料中の修飾RNAの濃度をOD260によって判定した。カプセル封入効率は、修飾RNAの実際の量を取得し、修飾RNAの開始時の量で除すことによって計算した。試験した3つのバッチでは、59.2、49.8、および61.3のカプセル封入効率であった。
C.PLGAマイクロスフェアにカプセル封入された修飾mRNAの完全性 修飾第IX因子mRNA(mRNA配列は配列番号26172に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を、種々の濃度で水中に溶解させて(W4)製剤中の充填重量パーセント(mg 修飾RNA/mg PLGA*100)を変化させ、カプセル封入効率を判定した。表29のパラメータを使用して、第1のエマルション(W4/O1)は均質化速度4で、第2のエマルション(W4/O1/W2)は均質化速度5で、4つの異なるバッチのPLGAマイクロスフェア製剤を作製した。 表29.第IX因子PLGAマイクロスフェア製剤のパラメータ
凍結乾燥させた後、PLGAマイクロスフェアを、約10μgの修飾RNAに対応するように2mLのエッペンドルフ管に計量した。凍結乾燥は、PLGAマイクロスフェアの全体的な構造を破壊しないことがわかった。PLGAマイクロスフェアの充填重量パーセント(重量%)を増加させるために、漸増量の修飾RNAを試料に添加した。1.0mLのDCMを各管に添加し、次いで試料を6時間振盪させることによって、PLGAマイクロスフェアを脱製剤化した。修飾RNAの抽出のために、0.5mLの水を各試料に添加し、試料を一晩振盪させた後、試料中の修飾RNAの濃度をOD260によって判定した。抽出プロセスの回収率を判定するために、製剤化されていない第IX因子修飾RNA(mRNA配列は配列番号26172に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)(脱製剤化対照)をDCM中に添加し、脱製剤化プロセスに供した。表30は、試料の充填およびカプセル封入効率を示す。すべてのカプセル封入効率試料を、脱製剤化対照に対して正規化した。 表30.充填重量パーセントおよびカプセル封入効率
D.PLGAマイクロスフェアにカプセル封入された修飾mRNAの放出研究
第IX因子修飾RNA(mRNA配列は配列番号26172に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)とともに製剤化したPLGAマイクロスフェアを、上述のように脱製剤化し、抽出された修飾RNAの完全性を自動化電気泳動(Bio−Rad Experion)によって判定した。抽出した修飾mRNAを、カプセル封入された修飾mRNAの完全性を研究するために、製剤化されていない修飾mRNAおよび脱製剤化対照に対して比較した。図4に示されるように、修飾RNAの大半が、バッチ識別子A、B、C、およびD、脱製剤化した対照(脱製剤化対照)、ならびに製剤化されていない対照(非製剤化対照)について、無傷であった。
E.PLGAマイクロスフェアにカプセル封入された修飾mRNAのタンパク質発現 第IX因子修飾RNA(mRNA配列は配列番号26172に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)とともに製剤化されたPLGAマイクロスフェアを、上述のように脱製剤化し、抽出された修飾RNAのタンパク質発現をインビトロトランスフェクションアッセイによって判定した。HEK293細胞に、RNAiMAX(Invitrogen)と複合体形成した250ngの第IX因子修飾RNAを、三重に逆トランスフェクトした。
第IX因子修飾RNAをヌクレアーゼ不含水中で25ng/μLの濃度に希釈し、RNAiMAXを血清不含EMEM中で13.3倍希釈した。等体積の希釈修飾RNAおよび希釈RNAiMAXを、一緒に混合し、20〜30分間室温に置いた。続いて、250ngの第IX因子修飾RNAを含有する20μLのトランスフェクション混合物を、30,000の細胞を含有する80μLの細胞懸濁液に添加した。細胞を、加湿37℃/5%CO2の細胞培養インキュベーターで16時間インキュベートした後、細胞培養上清を収集した。細胞上清中の第IX因子のタンパク質発現を、特に第IX因子用のELISAキット(Molecular Innovations、カタログ番号HFIXKT−TOT)によって分析し、タンパク質発現を表31および図5に示す。試験したすべてのPLGAマイクロスフェアバッチにおいて、第IX因子修飾RNAは活性なままであり、PLGAマイクロスフェアへの製剤化および続く脱製剤化の後に、第IX因子タンパク質を発現した。 表31.タンパク質発現
F.PLGAマイクロスフェアにカプセル封入された修飾mRNAの放出研究 第IX因子修飾RNA(mRNA配列は配列番号26172に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)とともに製剤化されたPLGAマイクロスフェアを、24mg/mLのPLGAマイクロスフェア濃度まで水中に再懸濁した。再懸濁した後、150μLのPLGAマイクロスフェア懸濁液を、エッペンドルフ管にアリコート化した。試料を、研究過程の間、37℃でインキュベートおよび振盪し続けた。三連の試料を、0.2、1、2、8、14、および21日で取り出した。PLGAマイクロスフェアから放出された修飾RNAの量を判定するために、試料を遠心分離し、上清を除去し、上清中の修飾RNAの濃度をOD260によって判定した。表32に示される放出パーセントは、各試料中の総修飾RNA量に基づいて計算した。31日後、第IX因子修飾RNAの96%が、PLGAマイクロスフェア製剤から放出された。 表32.放出パーセント
G.PLGAマイクロスフェアの粒径再現性 3つのバッチの第IX因子修飾RNA(mRNA配列は配列番号26172に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)PLGAマイクロスフェアを、表29に示されるバッチDに関して記載のものと同じ条件を用いて作製した(4mg/mLで0.4mLのW4、200mg/mLで2.0mLのO1、1%で200mLのW2、およびW4/O1/W2エマルションは速度5で均質化)。PLGAマイクロスフェア懸濁液の均質性を改善するために、遠心分離の前に濾過を組み込んだ。3時間撹拌した後、遠心分離の前に、すべての製剤化材料を100μmのナイロンメッシュ篩(Fisherbrand Cell Strainer、カタログ番号22−363−549)に通して大きな凝集物を取り除いた。水で洗浄し、再懸濁した後、100〜200μLのPLGAマイクロスフェア試料を、レーザー回折による製剤の粒径測定に使用した(Malvern Mastersizer2000)。試料の粒径を表33に示す。 表33.粒径の要約
濾過を用いた3つのPLGAマイクロスフェアバッチの結果を、濾過なしの同じ条件下で作製したPLGAマイクロスフェアバッチと比較した。洗浄前に濾過ステップを組み込むことで、平均粒径が減少し、3つのPLGAマイクロスフェアバッチ間で一貫した粒径分布が示された。
H.第IX因子PLGAマイクロスフェアの血清安定性 緩衝液(TE)もしくは90%血清(Se)中の第IX因子mRNA RNA(mRNA配列は配列番号26172に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)、または緩衝液、90%血清、もしくは1%血清中のPLGA中の第IX因子mRNAを、緩衝液、90%血清、または1%血清中において、総体積70μL中50ng/μLのmRNA濃度でインキュベートした。試料を、0、30、60、または120分で取り出した。25μLの4倍プロテイナーゼK緩衝液(0.4mLの1M TRIS−HCl pH7.5、0.1mLの0.5M EDTA、0.12mLの5M NaCl、および0.4mLの10%SDS)および8μLのプロテイナーゼKを20mg/mLで添加することによって、RNaseを55℃で20分間プロテイナーゼK消化により不活性化した。バイオアナライザーで分析する前に、第IX因子mRNAを、沈殿させた(250μLの95%エタノールを1時間添加し、13krpmで10分間遠心分離し、上清を除去し、200μLの70%エタノールをペレットに添加し、13krpmで5分間再度遠心分離し、上清を除去し、ペレットを70μLの水中に再懸濁させた)か、またはPLGAマイクロスフェアから抽出した(13krpmで5分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを1mLの水で洗浄し、13krpmで5分間遠心分離し、上清を除去し、280μLのジクロロメタンをペレットに添加し、15分間振盪させ、70μLの水を添加し、次いで2時間振盪させ、水相を除去した)。PLGAマイクロスフェアは、2時間にわたり、第IX因子修飾mRNAを90%および1%の血清中での分解から保護する。第IX因子修飾mRNAは、開始時点で90%の血清中で完全に分解される。
実施例17.脂質ナノ粒子のインビボ研究 G−CSF(インビトロ転写に使用される、T7プロモーター、5’非翻訳領域(UTR)、および3’UTRを有するcDNAは配列番号26167に示される。mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)および第IX因子(インビトロ転写に使用される、T7プロモーター、5’UTR、および3’UTRを有するcDNAは配列番号26175に示される。mRNA配列は配列番号26172に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)修飾mRNAを、シリンジポンプ法を用いて脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化した。LNPは、最終的な脂質モル比50:10:38.5:1.5(DLin−KC2−DMA:DSPC:コレステロール:PEG−c−DOMG)で、総脂質と修飾mRNAの重量比20:1で製剤化した。表34に列挙される製剤を、粒径、ゼータ電位、およびカプセル封入によって特徴付けた。 表34.製剤
LNP製剤を、100、10、または1μgの修飾mRNA用量でマウス(n=5)に静脈内投与した。マウスを投薬の8時間後に屠殺した。血清を、心穿刺によってG−CSFまたは第IX因子修飾mRNA製剤を投与したマウスから採取した。タンパク質発現をELISAによって判定した。
G−CSFまたは第IX因子の投与群に、有意な体重減少はなかった(5%未満)。G−CSFまたは第IX因子の投与群のタンパク質発現を、ELISAによって標準曲線から判定した。血清試料を希釈して(G−CSFについては約20〜2500倍および第IX因子については約10〜250倍)、試料が確実に標準曲線の線形範囲内に入るようにした。表35に示されるように、ELISAによって判定されたG−CSFタンパク質発現は、それぞれ、1、10、および100μgの用量群について、約17、1200、および4700ng/mLであった。表36に示されるように、ELISAによって判定された第IX因子タンパク質発現は、それぞれ、1、10、および100μgの用量群について、約36、380、および3000〜11000ng/mLであった。 表35.G−CSFタンパク質発現
表36.第IX因子タンパク質発現
表37に示されるように、上述のLNP製剤は、同じ投薬量の修飾mRNAの静脈内(IV)リポプレックス製剤の投与、および生理食塩水中の同じ用量の修飾mRNAの筋肉内(IM)または皮下(SC)投与と比較して、タンパク質産生に約10,000〜100,000倍の増加を有する。表37に使用される際、記号「約(〜)」は、約を意味する。 表37.タンパク質産生
実施例18〜23の材料および方法 G−CSF(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチド(nulceotide)のポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)およびEPO(mRNA配列は配列番号26171に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)修飾mRNAを、シリンジポンプ法を用いて脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化した。LNPは、最終的な脂質モル比50:10:38.5:1.5(DLin−KC2−DMA:DSPC:コレステロール:PEG−c−DOMG)で、総脂質と修飾mRNAの重量比20:1で製剤化した。表38に列挙される製剤を、粒径、ゼータ電位、およびカプセル封入によって特徴付けた。 表38.製剤
実施例18.修飾mRNAを用いた脂質ナノ粒子のインビボ研究 表38(上述)に示されるLNP製剤を、0.05mg/kgの単回修飾mRNA用量で、ラット(n=5)に静脈内(IV)、筋肉内(IM)、または皮下(SC)投与した。対照群のラット(n=4)は未処理であった。ラットに、2時間、8時間、24時間、48時間、および96時間、ならびにそれらにG−CSFまたはEPO修飾mRNA製剤を投与した後に採血を行って、ELISAによってタンパク質発現を判定した。EPO修飾mRNAを静脈内投与したラットを7日目にも採血した。
表39に示されるように、修飾EPOmRNAを静脈内投与したラットにおけるEPOタンパク質発現は、5日に達するまで検出可能であった。修飾G−CSF mRNAを静脈内投与したラットにおけるG−CSFは、7日まで検出可能であった。EPO修飾mRNAの皮下および筋肉内投与は、少なくとも24時間まで検出可能であり、G−CSF修飾mRNAは、少なくとも8時間まで検出可能であった。表39において、「OSC」は標準曲線の外側であった値を指し、「NT」は未試験を意味する。 表39.G−CSFおよびEPOのタンパク質発現
実施例19.経時的インビボ研究 表38(上述)に示されるLNP製剤を、0.5、0.05、または0.005mg/kgの単回修飾mRNA用量で、マウス(n=5)に静脈内(IV)投与した。マウスに、G−CSFまたはEPO修飾mRNA製剤を投与した8時間、24時間、72時間、および6日後に採血を行って、ELISAを用いてタンパク質発現を判定した。
表40に示されるように、修飾mRNAを静脈内投与したマウスにおけるEPOおよびG−CSFタンパク質発現は、0.005mg/kgおよび0.05mg/kgの修飾mRNAを投与したマウスでは72時間に達するまで、かつEPO修飾mRNAを投与したマウスでは6日に達するまで検出可能であった。表40において、「>」は、それよりも大きいことを意味し、「ND」は検出されなかったことを意味する。 表40.タンパク質発現
実施例20.齧歯動物におけるLNP製剤のインビボ研究 A.マウスにおけるLNP製剤 表38(上述)に示されるLNP製剤を、0.05mg/kgまたは0.005mg/kgの単回修飾mRNA用量で、マウス(n=4)に静脈内(IV)投与した。未処理の対照マウス群(n=4)も3つ存在した。マウスに、G−CSFまたはEPO修飾mRNA製剤を投与した2時間、8時間、24時間、48時間、および72時間後に採血を行って、タンパク質発現を判定した。G−CSFおよびEPOのタンパク質発現を、ELISAを用いて判定した。
表41に示されるように、マウスにおけるEPOおよびG−CSFのタンパク質発現は、0.005mg/kgの用量の修飾RNAを受容したマウスでは少なくとも48時間に達するまで、および0.05mg/kgの用量の修飾RNAを受容したマウスでは72時間まで、検出可能であった。表41において、「OSC」は標準曲線の外側であった値を指し、「NT」は未試験を意味する。 表41.マウスにおけるタンパク質発現
B.齧歯動物におけるLNP製剤 表38(上述)に示されるLNP製剤を、0.05mg/kgの単回修飾mRNA用量で、ラット(n=4)に静脈内(IV)投与する。未処理の対照ラット群(n=4)も存在する。ラットに、G−CSFまたはEPO修飾mRNA製剤を投与した2時間、8時間、24時間、48時間、72時間、および14日後に採血を行って、タンパク質発現を判定する。G−CSFおよびEPOのタンパク質発現を、ELISAを用いて判定する。
実施例21.LNPの早期経時的研究 表38(上述)に示されるLNP製剤を、0.5mg/kg、0.05mg/kg、または0.005mg/kgの単回修飾mRNA用量で、哺乳動物に静脈内(IV)、筋肉内(IM)、または皮下(SC)投与する。対照哺乳動物群は未処理である。哺乳動物に、修飾mRNA LNP製剤を投与した5分、10分、20分、30分、45分、1時間、1.5時間、および/または2時間後に、採血を行って、ELISAを用いてタンパク質発現を判定する。さらに、哺乳動物に採血を行い、顆粒球レベルおよび赤血球数等の全血球数を判定する。
実施例22.非ヒト霊長類のインビボ研究。 表38(上述)に示されるLNP製剤を、必要に応じてシリンジ/abbocathまたはバタフライに取り付けることができる皮下注射針を用いて約30秒間にわたる静脈内ボーラス注入(IV)として非ヒト霊長類(NHP)(カニクイザル)(n=2)に投与した。NHPに、0.5mL/kgの投薬量で、0.05mg/kgのEPOもしくはG−CSF、または0.005mg/kgのEPOの単回修飾mRNA IV用量を投与した。NHPに、修飾mRNA LNP製剤を投薬する5〜6日前に採血を行って、血清中のタンパク質発現およびベースラインの全血球数を判定した。修飾mRNA製剤を投与した後、8、24、48、および72時間でNHPに採血を行い、タンパク質発現を判定した。投与の24および72時間後には、NHPの全血球数もまた判定した。G−CSFおよびEPOのタンパク質発現をELISAによって判定した。NHPの尿を、実験の全過程にわたり採取し、分析して臨床的安定性を評価した。NHPにG−CSFまたはEPO修飾mRNA製剤を投与した後に、それらから試料を採取して、ELISAを用いてタンパク質発現を判定した。非ヒト霊長類の臨床化学、血液学、尿検査、およびサイトカインについても分析した。
表42に示されるように、0.05mg/kgを投与したNHPにおけるEPOタンパク質発現は、72時間に達するまで検出可能であり、0.005mg/kgのEPO製剤の投薬では、48時間に達するまで検出可能である。表42において、「<」は、所与の値未満であることを意味する。G−CSFタンパク質発現は、修飾mRNA製剤を投与した24時間後まで見られた。予備的に、顆粒球および網状赤血球のレベルの増加が、修飾mRNA製剤の投与後にNHPに見られた。 表42.非ヒト霊長類におけるタンパク質発現
実施例23.G−CSFおよびEPOに関する非ヒト霊長類のインビボ研究 表38(上述)に示されるLNP製剤を、静脈内注入(IV)として、非ヒト霊長類(NHP)(カニクイザル)(n=2)に投与した。NHPに、0.5mL/kgの投薬量で、0.5mg/kg、0.05mg/kg、または0.005mg/kgのG−CSFまたはEPOの単回修飾mRNA IV用量を投与した。NHPに、修飾mRNA LNP製剤を投薬する前に採血を行って、血清中のタンパク質発現およびベースラインの全血球数を判定した。G−CSF修飾mRNA製剤を投与した後、8、24、48、および72時間でNHPに採血を行い、タンパク質発現を判定した。EPO修飾mRNA製剤を投与した後、8、24、48、72時間、および7日でNHPに採血を行い、タンパク質発現を判定した。
NHPにG−CSFまたはEPO修飾mRNA製剤を投与した後に採取した試料を、ELISAによって分析してタンパク質発現を判定した。好中球および網状赤血球の数も、G−CSFまたはEPO製剤の投与前、投与の24時間、3日、7日、14日、および18日後に判定した。
表43に示されるように、G−CSFタンパク質発現は、72時間を超えると検出されなかった。表43において、「<39」とは、検出下限である39pg/mLよりも低い値を指す。 表43.G−CSFタンパク質発現
表44に示されるように、EPOタンパク質発現は、7日を超えると検出されなかった。表44において、「<7.8」とは、検出下限である7.8pg/mLよりも低い値を指す。 表44.EPOタンパク質発現
表45に示されるように、すべてのG−CSF群で、投薬前のレベルと比較して、好中球の増加があった。 表45.NHPにおけるG−CSF mRNAの薬理学的効果
表46に示されるように、すべてのEPO群で、投薬の24時間後の網状赤血球レベルと比較して、投薬の3日〜14/18日後の網状赤血球の増加があった。 表46.好中球数に対するEPO mRNAの薬理学的効果
表47〜49に示されるように、EPO修飾RNAの投与は、ヘモグロビン(HGB)、ヘマトクリット(HCT)、および赤血球(RBC)数を含む、他の赤血球形成パラメータに対して効果を有した。 表47.ヘモグロビンに対するEPO mRNAの薬理学的効果
表48.ヘマトクリットに対するEPO mRNAの薬理学的効果
表49.赤血球に対するEPO mRNAの薬理学的効果
表50および51に示されるように、修飾RNAの投与は、アラニントランスアミナーゼ(ALT)およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)を含む血清化学パラメータに対して効果を有した。 表50.アラニントランスアミナーゼに対するEPO mRNAの薬理学的効果
表51.アスパラギン酸トランスアミナーゼに対するEPO mRNAの薬理学的効果
表52に示されるように、高用量(0.5mg/kg)での脂質ナノ粒子−製剤化修飾RNAの投与は、修飾mRNAの投与後に、サイトカインすなわちインターフェロンα(IFN−α)の増加を引き起こした。 表52.アラニントランスアミナーゼに対するEPO mRNAの薬理学的効果
実施例24.非ヒト霊長類における筋肉内および/または皮下投与の研究 生理食塩水中に修飾EPO mRNA(mRNA配列は配列番号26171に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)またはG−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を含有する製剤を、非ヒト霊長類(カニクイザル)(NHP)に筋肉内(IM)または皮下(SC)投与した。0.05mg/kgまたは0.005mg/kgの単回修飾mRNA用量は、0.5mL/kgの投薬量でのものであった。非ヒト霊長類に、投薬の5〜6日前に採血を行って、血清タンパク質濃度およびベースラインの全血球数を判定する。修飾mRNA製剤を投与した後、8時間、24時間、48時間、72時間、7日、および14日でNHPに採血を行い、タンパク質発現を判定する。G−CSFおよびEPOのタンパク質発現を、ELISAによって判定する。投与の24時間、72時間、7日、および14日後に、NHPの全血球数もまた判定する。全実験過程にわたってNHPから尿を採取し、分析して臨床的安定性を評価する。注入部位付近の組織もまた採取し、分析してタンパク質発現を判定する。
実施例25.修飾mRNAの輸送 修飾mRNAの局在化および/または輸送を判定するために、次のように研究を行うことができる。
siRNAおよび修飾mRNAのLNP製剤を、当技術分野で既知および/または本明細書に記載の方法に従って製剤化する。LNP製剤には、G−CSF、EPO、第VII因子等のタンパク質、および/または本明細書に記載の任意のタンパク質をコードし得る少なくとも1つの修飾mRNAが含まれ得る。製剤は、筋肉内または皮下注入を用いて、哺乳動物の筋肉内に局所投与することができる。修飾mRNAの用量およびLNPの大きさは、哺乳動物の身体への輸送を判定するため、および/または炎症等であるがこれに限定されない生物学的反応に対する影響を評価するために、多様であり得る。哺乳動物に、異なる時点で採血を行って、血清中に存在する投与されたmRNAによってコードされるタンパク質の発現を判定する、および/または哺乳動物における全血球数を判定することができる。
例えば、肝臓内で発現し血清中に分泌される第VII因子をコードする修飾mRNAを、筋肉内および/または皮下投与することができる。修飾mRNA投与と同時かまたはその前に、siRNAを投与して、内因性第VII因子をノックアウトする。血液中の修飾mRNAの筋肉内および/または皮下注入により生じる第VII因子を投与し、測定する。さらに、注入部位付近の組織における第VII因子のレベルも測定する。第VII因子が血液中に発現する場合、修飾mRNAの輸送が存在する。第VII因子が組織中に発現するが血液中には発現しない場合、第VII因子の局所発現のみが存在する。
実施例26.複数の修飾mRNAの製剤 修飾mRNAのLNP製剤を、当技術分野で既知および/または本明細書に記載もしくは当技術分野で既知の方法に従って製剤化する。LNP製剤には、G−CSF、EPO、トロンボポエチン等のタンパク質、および/または本明細書に記載の任意のタンパク質をコードし得る、少なくとも1つの修飾mRNAが含まれ得る。少なくとも1つの修飾mRNAには、1、2、3、4、または5つの修飾mRNA分子が含まれ得る。少なくとも1つの修飾mRNAを含有する製剤は、単回または複数回の投薬レジメンで、静脈内、筋肉内、または皮下投与することができる。血液および/または血清等であるがこれらに限定されない生体試料を、少なくとも1つの修飾mRNA製剤の投与の前および/後の様々な時点で採取し、分析することができる。タンパク質をコードする少なくとも1つの修飾mRNAを含有する製剤を哺乳動物に投与した後、50〜200pg/mLの生体試料における前記タンパク質の発現は、生物学的に有効であると考えられるであろう。
実施例27.ポリエチレングリコール比の研究 A.PEG LNPの製剤化および特徴付け 脂質ナノ粒子(LNP)を、シリンジポンプ法を用いて製剤化した。LNPを、総脂質と修飾G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)の重量比20:1で製剤化した。製剤のモル比範囲を、表53に示す。 表53.モル比
2種類のPEG脂質、1,2−ジミリストイル−sn−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール(PEG−DMG、NOFカタログ番号SUNBRIGHT(登録商標)GM−020)および1,2−ジステアロイル−sn−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール(PEG−DSG、NOFカタログ番号SUNBRIGHT(登録商標)GS−020)を、1.5または3.0mol%で試験した。LNPの形成および修飾G−CSF mRNAのカプセル封入の後、LNP製剤を、粒径、ゼータ電位、およびカプセル封入率によって特徴付けし、結果を表54に示す。 表54.LNP製剤の特徴付け
B.PEG LNPのインビボスクリーニング
表55に記載のPEG LNPの製剤を、0.5mg/kgの用量で、マウス(n=5)に静脈内投与した。血清を、製剤を投与した2時間、8時間、24時間、48時間、72時間、および8日後にマウスから採取した。血清をELISAによって分析してG−CSFのタンパク質発現を判定し、発現レベルを表55に示す。PEG−DMGを用いたLNP製剤は、実質的にPEG−DSAを用いたLNP製剤よりも高いレベルのタンパク質発現を呈した。 表55.タンパク質発現
実施例28.カチオン性脂質製剤研究 A.カチオン性脂質ナノ粒子の製剤化および特徴付け 脂質ナノ粒子(LNP)を、シリンジポンプ法を用いて製剤化した。LNPを、20:1の総脂質と修飾mRNAの重量比で製剤化した。カチオン性脂質、DSPC、コレステロール、およびPEG−c−DOMGの最終的な脂質のモル比範囲を、表56に概略説明する。 表56.モル比
エタノール中25mMの脂質溶液およびpH3で50mMのクエン酸塩中の修飾RNAを混合して、自発的小胞形成をもたらした。小胞をエタノール中で安定化させた後に、エタノールを除去し、透析による緩衝液交換を行った。次いで、LNPを、粒径、ゼータ電位、およびカプセル封入率によって特徴付けた。表57は、DLin−MC3−DMA、DLin−DMA、またはC12−200をカチオン性脂質として使用して、EPO修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26171に示される約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)またはG−CSF修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチド(nucleotdie)のポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)をカプセル封入したLNPの特徴付けについて記載する。 表57.カチオン性脂質製剤の特徴付け
B.カチオン性LNP製剤のインビボスクリーニング 表57に記載されるカチオン性脂質製剤の製剤を、0.5mg/kgの用量で、マウス(n=5)に静脈内投与した。血清を、製剤を投与した2時間、24時間、72時間、および/または7日後にマウスから採取した。血清をELISAによって分析してEPOまたはG−CSFのタンパク質発現を判定し、発現レベルを表58に示す。 表58.タンパク質発現
カチオン性脂質C12−200(NPA−075−1およびNPA−076−1)を用いたLNP製剤を投与したマウスに毒性が確認され、これらは、矮小な被毛、萎縮挙動、および10%を上回る体重減少といった症状を示したため、24時間で屠殺した。C12−200は、より毒性であると予測されていたが、短期間で高レベルの発現も有した。カチオン性脂質DLin−DMA(NPA−073−1およびNPA−074−1)は、試験した3つのカチオン性脂質の中で最も低い発現を有した。DLin−MC3−DMA(NPA−071−1およびNPA−072−1)は、3日目まで良好な発現を示し、EPO製剤については7日に達するまでバックグラウンド試料を上回った。
実施例29.タンパク質発現のスクリーニング方法 A.エレクトロスプレーイオン化 対象に投与した修飾RNAによってコードされるタンパク質を含有し得る生体試料を調製し、1、2、3、または4個の質量分析器を用いて、エレクトロスプレーイオン化(ESI)のための製造業者のプロトコルに従って分析する。生体試料はまた、タンデムESI質量分析システムを用いて分析することもできる。 タンパク質断片のパターン、または総タンパク質を、所与のタンパク質について既知の対照と比較し、素性を比較により判定する。
B.マトリックス支援レーザー脱離/イオン化 対象に投与した修飾RNAによってコードされるタンパク質を含有し得る生体試料を調製し、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)のための製造業者のプロトコルに従って分析する。
タンパク質断片のパターン、または総タンパク質を、所与のタンパク質について既知の対照と比較し、素性を比較により判定する。
C.液体クロマトグラフィータンデム質量分析(Liquid Chromatography−Mass spectrometry−Mass spectrometry) 修飾RNAをによってコードされるタンパク質を含有し得る生体試料を、トリプシン酵素で処理して、中に含有されるタンパク質を消化させる。結果として得られるペプチドを、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC/MS/MS)によって分析する。ペプチドを断片化して質量分析計に入れ、コンピュータアルゴリズムを介してタンパク質配列のデータベースとマッチさせることが可能な特徴的なパターンを生成する。消化した試料を希釈して、所与のタンパク質について1ng以下の出発物質を得ることができる。単純な緩衝液のバックグラウンド(例えば、水または揮発性塩)を含有する生体試料は、直接的な溶液中での消化に適しており、より複雑なバックグラウンド(例えば、界面活性剤、不揮発性塩、グリセロール)は、試料分析を容易にするための追加の浄化ステップを要する。
タンパク質断片のパターン、または総タンパク質を、所与のタンパク質について既知の対照と比較し、素性を比較により判定する。
実施例30.脂質ナノ粒子のインビボ研究 mCherry mRNA(mRNA配列は配列番号26176に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を、シリンジポンプ法を用いて脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化した。LNPは、最終的な脂質のモル比50:10:38.5:1.5(DLin−KC2−DMA:DSPC:コレステロール:PEG−c−DOMG)で、総脂質と修飾mRNAの重量比20:1で製剤化した。表59に列挙されるmCherry製剤を、粒径、ゼータ電位、およびカプセル封入によって特徴付けた。 表59.mCherry製剤
LNP製剤を、100μgの修飾mRNA用量で、マウス(n=5)に静脈内投与した。マウスを投薬の24時間後に屠殺した。mCherry修飾mRNA製剤を投与したマウスからの肝臓および脾臓を、免疫組織化学(IHC)、ウエスタンブロット、または蛍光活性化細胞選別(FACS)によって分析した。
肝臓の組織学は、切片全体で均一なmCherry発現を示したが、未処理の動物はmCherryを発現しなかった。また、ウエスタンブロットを使用して、処理動物におけるmCherryの発現を確認したが、mCherryは未処理動物には検出されなかった。チューブリンを対照マーカーとして使用し、これは処理および未処理の両方のマウスに検出され、肝細胞における正常なタンパク質発現は影響を受けていなかったことが示された。
さらに、FACSおよびIHCもmCherryおよび未処理のマウスの脾臓に行った。FACS分析により、すべての白血球細胞集団がmCherry発現において陰性であった。また、IHCにより、mCherry処理マウスと未処理マウスとの間で、脾臓において脾臓において観察できる差は存在しなかった。
実施例31.シリンジポンプインビボ研究 mCherry修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26169に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、シリンジポンプ法を用いて脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化する。LNPは、最終的な脂質のモル比50:10:38.5:1.5(DLin−KC2−DMA:DSPC:コレステロール:PEG−c−DOMG)で、総脂質と修飾mRNAの重量比20:1で製剤化する。mCherry製剤を、粒径、ゼータ電位、およびカプセル封入によって特徴付ける。
LNP製剤を、10または100μgの修飾mRNA用量でマウス(n=5)に静脈内投与する。マウスを投薬の24時間後に屠殺する。mCherry修飾mRNA製剤を投与したマウスからの肝臓および脾臓を、免疫組織化学(IHC)、ウエスタンブロット、および/または蛍光活性化細胞選別(FACS)によって分析する。
実施例32.インビトロおよびインビボ発現 A.リピドイド製剤を用いたヒト細胞におけるインビトロ発現 インビトロトランスフェクションについて試験するために使用されるmmRNAとリピドイドの比を、異なるリピドイド:mmRNA比で実験的に試験する。siRNAおよびリピドイドを用いた以前の研究では、2.5:1、5:1、10:1、および15:1のリピドイド:siRNAの重量:重量比を用いていた。siRNAと比較してmmRNAの長さがより長いことを考慮すると、より低いリピドイドとmmRNAの重量:重量比が有効であり得る。さらに、比較のために、RNAIMAX(商標)(Invitrogen,Carlsbad,CA)またはTRANSIT−mRNA(Mirus Bio,Madison,WI)カチオン性脂質送達ビヒクルを用いたmmRNAもまた製剤化した。
所望のタンパク質産物を発現する、リピドイド製剤化したルシフェラーゼ(IVT cDNA配列は配列番号26177に示される通り;mRNA配列は 配列番号26178に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)、緑色蛍光タンパク質(GFP)(IVT cDNA配列は配列番号26179に示される通り;mRNA配列は配列番号26180に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)、G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26169に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)、およびEPO mRNA(mRNA配列は配列番号26171に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)の能力を、ルシフェラーゼ発現については発光、GFP発現についてはフローサイトメトリー、ならびにG−CSFおよびエリスロポエチン(EPO)の分泌についてはELISAによって、確認することができる。
B.静脈内注入後のインビボ発現 製剤の全身静脈内投与を、98N12−5、C12−200、およびMD1を含むがこれらに限定されない種々の異なるリピドイドを用いて行う。
mmRNAを含有するリピドイド製剤を、動物に静脈内注入する。修飾mRNA(mmRNA)によりコードされるタンパク質の発現を、動物から採取した血液ならびに/または肝臓および脾臓といった他の器官の試料において評価する。単回静脈内投与研究の実施は、所望される生成物の発現の規模、用量応答性、および有効期間の評価を可能にするであろう。
一実施形態において、98N12−5、C12−200、MD1、および他のリピドイドのリピドイド系製剤を、動物へのルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、mCherry蛍光タンパク質、分泌されたアルカリホスファターゼ(sAP)、ヒトG−CSF、ヒト第IX因子、またはヒトエリスロポエチン(EPO)mmRNAの送達に使用する。前述のように、脂質を用いてmmRNAを製剤化した後、動物を群に分け、生理食塩水製剤、またはルシフェラーゼ、GFP、mCherry、sAP、ヒトG−CSF、ヒト第IX因子、およびヒトEPOから選択される様々なmmRNAのうちの1つを含有するリピドイド製剤のいずれかを受容させる。動物に注入する前に、mmRNA含有リピドイド製剤をPBS中に希釈する。次いで、動物に、10mg/kgの用量から1ng/kgと同程度に低い用量範囲、好ましくは10mg/kg〜100ng/kgの範囲の単回用量の製剤化mmRNAを投与し、mmRNAの用量は、20グラムのマウスは最大で0.2mLの製剤を受容する等、動物の体重に依存する(投薬は、体重1kg当たりのmmRNAに基づく)。mmRNA−リピドイド製剤を投与した後に、血清、組織、および/または組織ライセートを取得し、mmRNAによりコードされる生成物のレベルを、単一および/またはある範囲の時間間隔で判定する。所望のタンパク質産物を発現するリピドイド製剤化ルシフェラーゼ、GFP、mCherry、sAP、G−CSF、第IX因子、およびEPO mmRNAの能力を、ルシフェラーゼの発現については発光、GFPの発現およびmCherry発現についてはフローサイトメトリー、sAPについては酵素活性、またはG−CSF、第IX因子、および/もしくはEPOの分泌についてはELISAによって確認する。
また、複数回用量レジメンに関するさらなる研究を行って、mmRNAの最大発現を判定し、mmRNAに駆動される発現の飽和性を評価し(対照および活性なmmRNA製剤を同時または順次に与えることによって)、反復薬物投与の実行可能性を判定する(数週または数ヶ月離れた投与でmmRNAを与え、次いで、発現レベルが免疫原性等の要因によって影響を受けるかどうかを判定することによって)。G−CSFおよびEPO等のタンパク質の生理学的機能の評価も、試験した動物に由来する試料の分析、ならびに顆粒球および赤血球数それぞれの増加を検出することによって判定する。第IX因子等の発現したタンパク質産物の動物における活性も、第IX因子酵素活性(活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ)および凝固時間の影響の分析を介して評価することができる。
C.筋肉内および/皮下注入後のインビトロ発現 mRNAを含むオリゴヌクレオチドを筋肉内注入経路または皮下注入経路を介して送達するためにリピドイド製剤を使用することは、これまでに報告されていないため、評価する必要がある。mmRNAの筋肉内および/または皮下注入を評価して、mmRNA含有リピドイド製剤が、所望されるタンパク質の局所的および全身的発現の両方をもたらすことができるかどうかを判定する。
ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、mCherry蛍光タンパク質、分泌されたアルカリホスファターゼ(sAP)、ヒトG−CSF、ヒト第IX因子、またはヒトエリスロポエチン(EPO)mmRNAから選択されるmmRNAを含有する、98N12−5、C12−200、およびMD1のリピドイド製剤を、動物に筋肉内および/または皮下注入する。mmRNAによりコードされるタンパク質の発現を、筋肉または皮下組織内、ならびに血液および他の組織、例えば肝臓および脾臓において全身的にの両方で、評価する。単回投与研究は、所望される生成物の発現の規模、用量応答性、および有効期間の評価を可能にする。
動物を群に分け、生理食塩水製剤または修飾mRNAを含有する製剤のいずれかを受容させる。注入の前に、mmRNA含有リピドイド製剤をPBS中に希釈する。動物に、50mg/kgから1ng/kgという低い用量の範囲、好ましくは10mg/kg〜100ng/kgの範囲の単回筋肉内用量の製剤化mmRNAを投与する。マウスの筋肉内投与の最大用量は、マウスの後肢への筋肉内注入では概ね1mgのmmRNAまたは0.02ngという低いmmRNAである。皮下投与については、動物に、400mg/kgから1ng/kgという低い用量範囲、好ましくは80mg/kg〜100ng/kgの範囲の単回皮下用量の製剤化mmRNAを投与する。マウスの皮下投与の最大用量は、概ね8mgのmmRNAまたは0.02ngという低いmmRNAである。
20グラムのマウスでは、単回筋肉内注入の量は最大で0.025mLであり、単回皮下注入では最大で0.2mLである。投与されるmmRNAの最適な用量は、動物の体重から計算する。mmRNA−リピドイドを投与した後、種々の時点で、血清、組織、および組織ライセートを取得し、mmRNAによりコードされる生成物のレベルを判定する。所望のタンパク質産物を発現する、リピドイド製剤化ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、mCherry蛍光タンパク質、分泌されたアルカリホスファターゼ(sAP)、ヒトG−CSF、ヒト第IX因子、またはヒトエリスロポエチン(EPO)mmRNAの能力を、ルシフェラーゼ発現については発光、GFPおよびmCherry発現についてはフローサイトメトリー、sAPについては酵素活性、ならびにG−CSF、第IX因子、およびエリスロポエチン(EPO)の分泌についてはELISAによって確認する。
また、複数回用量レジメンに関するさらなる研究を行って、mmRNAを用いた最大発現を判定し、mmRNAに駆動される発現の飽和性を評価し(対照および活性なmmRNA製剤を同時または順次に与えることによって達成される)、反復薬物投与の実行可能性を判定する(数週または数ヶ月離れた投与でmmRNAを与え、次いで、発現レベルが免疫原性等の要因によって影響を受けるかどうかを判定することによって)。1回で複数の皮下または筋肉内注入を用いる研究も、さらにmmRNAの薬物曝露を増加させ、タンパク質産生を改善するために利用される。GFP、mCherry、sAP、ヒトG−CSF、ヒト第IX因子、およびヒトEPO等のタンパク質の生理学的機能の評価を、試験した動物に由来する試料を分析し、顆粒球および/または赤血球数における変化を検出することによって判定する。第IX因子等の発現したタンパク質産物の動物における活性も、第IX因子酵素活性(活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ)および凝固時間の影響の分析を介して評価することができる。
実施例33.二機能性mmRNA 本明細書に記載の教示および合成方法を使用して、修飾RNAを、二機能性であり、それによって1つ以上の細胞傷害性タンパク質分子をコードし、同様に細胞傷害性ヌクレオシドを用いて合成されるように、設計および合成する。
二機能性修飾mRNAの投与は、生理食塩水または脂質担体のいずれかを用いて達成する。投与されると、二機能性修飾mRNAは、翻訳されて、コードされた細胞傷害性ペプチドを産生する。送達された修飾mRNAが分解されると、これもまた対象に治療的利益をもたらす細胞傷害性ヌクレオシドが放出される。
実施例34.修飾mRNAのトランスフェクション A.逆トランスフェクション 24ウェルのコラーゲンコーティング組織培養プレートで行われる実験については、ケラチノサイトを1×105の細胞密度で播種する。96ウェルのコラーゲンコーティング組織培養プレートで行われる実験については、ケラチノサイトを0.5×105の細胞密度で播種する。トランスフェクトする各修飾mRNA(mmRNA)のために、記載されるように修飾mRNA:RNAIMAX(商標)を調製し、細胞が組織培養プレートに付着する前に、細胞番種期間内、例えば6時間以内に、マルチウェルプレートで細胞と混合する。
B.順トランスフェクション 24ウェルのコラーゲンコーティング組織培養プレートにおいて、ケラチノサイトを0.7×105の細胞密度で播種する。96ウェルのコラーゲンコーティング組織培養プレートについては、ケラチノサイトを0.3×105の細胞密度で播種する。ケラチノサイトを、24時間にわたり、70%を上回るコンフルエンシーに成長させる。トランスフェクトする各修飾mRNA(mmRNA)のために、記載されるように修飾mRNA:RNAIMAX(商標)を調製し、細胞の播種および組織培養プレートへの付着後に、24時間にわたりマルチウェルプレートにおいて細胞にトランスフェクトする。
C.修飾mRNAの翻訳スクリーニング:G−CSF ELISA ケラチノサイトを、Invitrogen(Carlsbad,CA)からのSupplement S7を有するEPILIFE培地において、70%を上回るコンフルエンスで成長させる。ケラチノサイトに、InvitrogenからのRNAIMAX(商標)と複合体形成した300ngの化学修飾mRNA(mmRNA)を逆トランスフェクトした。別のセットのケラチノサイトに、InvitrogenからのRNAIMAX(商標)と複合体形成した300ngの修飾mRNAを順トランスフェクトした。修飾mRNA:RNAIMAX(商標)の複合体は、まず、RNAを、5倍体積希釈物中、補充物質不含のEPILIFE(登録商標)培地とともに室温で10分間インキュベートすることによって形成する。
第2のバイアルにおいて、RNAIMAX(商標)試薬を、10倍体積希釈物中、補充物質不含のEPILIFE(登録商標)培地とともに室温で10分間インキュベートした。次いで、RNAのバイアルをRNAIMAX(商標)のバイアルと混合し、室温で20〜30分間インキュベートした後、滴下方式で細胞に添加した。培養培地中に分泌されたヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の濃度を、化学修飾mRNAのそれぞれについて、トランスフェクションの18時間後に三重に測定する。
トランスフェクトを行ったヒトケラチノサイトからのヒトG−CSFの分泌を、製造業者が推奨する指示に従って、InvitrogenまたはR&D Systems(Minneapolis,MN)からのELISAキットを用いて定量化する。 D.修飾mRNAの用量および持続期間:G−CSF ELISA
ケラチノサイトを、InvitrogenからのSupplement S7を有するEPILIFE(登録商標)培地において、70%を上回るコンフルエンスで成長させる。ケラチノサイトに、Invitrogen(Carlsbad,CA)からのRNAIMAX(商標)と複合体形成した、0ng、46.875ng、93.75ng、187.5ng、375ng、750ng、または1500ngのいずれかの修飾mRNAを逆トランスフェクトする。修飾mRNA:RNAIMAX(商標)複合体を、記載のように形成する。培養培地中に分泌されたヒトG−CSFの濃度を、各修飾mRNAの各濃度について、トランスフェクションの0、6、12、24、および48時間後に三重に測定する。トランスフェクトを行ったヒトケラチノサイトからのヒトG−CSFの分泌を、製造業者が推奨する指示に従ってInvitrogenまたはR&D SystemsからのELISAキットを用いて定量化する。
実施例35.分割用量研究 1回で複数の皮下または筋肉内注入部位を用いる研究を設計して実行し、mmRNAの薬物曝露を増加させ、タンパク質産生を改善する手段について調べた。発現したタンパク質産物の検出に加えて、タンパク質の生理学的機能の評価も、試験した動物に由来する試料の分析を介して判定した。
驚くべきことに、mmRNAの分割投薬は、単回単位投薬または複数回投薬スキームによりもたらされるものよりも高いタンパク質産生および表現型応答をもたらすことがわかった。
単回単位用量、複数回用量、および分割用量実験の設計は、緩衝液単独中で投与されるヒトエリスロポエチン(EPO)mmRNA(mRNAは配列番号26171に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)の使用を伴った。投薬ビヒクル(F緩衝液)は、150mMのNaCl、2mMのCaCl2、2mMのNa+−ホスフェート(1.4mMの第一リン酸ナトリウム;0.6mMの第二リン酸ナトリウム)、および0.5mMのEDTA、pH6.5からなった。pHは水酸化ナトリウムを用いて調節し、最終的な溶液を濾過滅菌した。mmRNAを、各シトシンにおける5meCおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で修飾した。
動物(n=5)に、100μgの単回単位用量をIM(筋肉内)注入した。複数回投薬については、100μgの3用量および100μgの6用量という2つのスケジュールを用いた。分割投薬スキームについては、33.3μgで3用量、および16.5μgのmmRNAの6用量という2つのスケジュールを用いた。対照投薬は、6用量で緩衝液のみの使用を伴った。対照mmRNAは、100μgで6回投薬されるルシフェラーゼmmRNA(IVT cDNA配列は配列番号26177に示される;mRNA配列は配列番号26178に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)の使用を伴った。血液および筋肉組織を、注入の13時間後に評価した。
ヒトEPOタンパク質を、緩衝液中のEPO mmRNAの単回、複数回、または分割筋肉内投薬の13時間後にマウス血清において測定した。7つの群のマウス(1群当たりn=5マウス)に処理を行い、評価した。結果を表60に示す。 表60.分割用量研究
分割係数は、単位薬物当たりの単回用量生成物(PUD)で除した単位薬物当たりの生成物として定義される。例えば、処理群2では、単位薬物(mmRNA)当たりの生成物(EPO)の値0.28を、単位薬物当たりの単回用量生成物0.14で除す。結果は2である。同様に、例えば、処理群4については、単位薬物(mmRNA)当たりの生成物(EPO)の値1.1を、単位薬物当たりの単回用量生成物0.14で除す。結果は7.9である。結果として、用量分割係数(DSF)は、分割用量レジメンの有効性の指標として使用することができる。総1日用量のいずれの単回投与についても、DSFは1と等しくなるはずである。したがって、分割用量レジメンにおいてこの値よりも大きいいずれのDSFも、向上した有効性を示す。
用量応答傾向、注入部位の影響、および注入のタイミングの影響を判定するために、研究を行う。これらの研究において、1μg、5μg、10μg、25μg、50μg、およびこれら間の値である様々な用量を用いて、用量応答結果を判定する。100μgの総用量の分割投薬には、1.6μg、4.2μg、8.3μg、16.6μg、または選択された総用量の投与に等しい値および総用量の3または6回用量が含まれる。
注入部位は、四肢または注入に好適な十分な面積を呈する任意の体表面から選択される。これはまた、真皮(皮内)、上皮(表皮)、皮下組織(SC)、または筋肉(IM)を標的とするための注入深度の選択も含み得る。注入角度は、標的とされる送達部位に基づいて多様であり、皮内部位を標的とする注入は皮膚表面の面から10〜15度の角度であり、皮下注入については皮膚表面の面から20〜45度であり、実質的に筋肉内への注入については60〜90度の角度である。
実施例36.エクソソームにおける定量化 本発明のmmRNAの数および局在化は、単離エクソソーム中の量(初期、経時、または残留ベースで)を測定することによって判定することができる。この研究では、mmRNAが、典型的にはコドン最適化されており、配列が内因性mRNAとははっきりと異なるため、mmRNAのレベルを、その内容が参照により全体が本明細書に組み込まれるGibbingsのPCT/IB2009/005878号の方法を用いて、天然または野生型のmRNAの内因性レベルと比較して定量化する。
これらの研究において、この方法は、まず、エクソソームまたは小胞を、好ましくは既に本発明のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAの治療を受けた患者の体液から単離し、次いで、mRNAマイクロアレイ、qRT−PCR、または好適な抗体もしくは免疫組織化学の方法を含む当技術分野におけるRNA測定のための他の方法のうちの1つによって、前記エクソソーム中のポリヌクレオチド、一次構築物、またはmmRNAのレベルを測定することによって行われる。
実施例37.細胞生存率、細胞傷害性、およびアポトーシスに対する修飾mRNAの効果 この実験により、ヒトケラチノサイト細胞にインビトロでトランスフェクトした、はっきりと異なる修飾mRNAの細胞生存率、細胞傷害性、およびアポトーシスを示す。ケラチノサイトを、Invitrogen(Carlsbad,CA)からのヒドロコルチゾンを含まないヒトケラチノサイト成長補充物質を有するEPILIFE(登録商標)培地において、70%を上回るコンフルエンスで成長させる。ケラチノサイトに、InvitrogenからのRNAIMAX(商標)と複合体形成した0ng、46.875ng、93.75ng、187.5ng、375ng、750ng、1500ng、3000ng、または6000ngの修飾mRNAを逆トランスフェクトする。修飾mRNA:RNAIMAX(商標)複合体を形成する。培養培地中に分泌されたヒトG−CSFの濃度を、各修飾mRNAの各濃度について、トランスフェクションの0、6、12、24、および48時間後に三重に測定する。トランスフェクトを行ったヒトケラチノサイトからのヒトG−CSFの分泌を、製造業者が推奨する指示に従ってInvitrogenまたはR&D SystemsからのELISAキットを用いて定量化する。
細胞生存率、細胞傷害性、およびアポトーシスを、製造業者の指示に従ってPromega(Madison,WI)からのAPOTOX−GLO(商標)キットを用いて、トランスフェクションの0、12、48、96、および192時間後に測定する。
実施例38.ELISAアッセイを用いた修飾mRNAに対する細胞の自然免疫応答の検出 インビトロでトランスフェクションを行ったヒトケラチノサイト細胞から分泌されるヒト腫瘍壊死因子α(TNF−α)、ヒトインターフェロンβ(IFN−β)、およびヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を、細胞の自然免疫応答の検出について試験する。ケラチノサイトを、Invitrogen(Carlsbad,CA)からのヒドロコルチゾンを含まないヒトケラチノサイト成長補充物質を有するEPILIFE(登録商標)培地において、70%を上回るコンフルエンスで成長させる。分泌されたTNF−αケラチノサイトに、記載されるように、InvitrogenからのRNAIMAX(商標)と複合体形成した0ng、93.75ng、l87.5ng、375ng、750ng、1500ng、または3000ngの化学修飾mRNA(mmRNA)を、三重に逆トランスフェクトする。培養培地中に分泌されたTNF−αを、製造業者のプロトコルに従ってInvitrogenからのELISAキットを用いて、化学修飾mRNAのそれぞれについて、トランスフェクションの24時間後に測定する。
同じ培養培地中に分泌されたIFN−βを、製造業者のプロトコルに従ってInvitrogenからのELISAキットを用いて、化学修飾mRNAのそれぞれについて、トランスフェクションの24時間後に測定する。同じ培養培地中に分泌されたヒトG−CSFの濃度を、化学修飾mRNAのそれぞれについて、トランスフェクションの24時間後に測定する。トランスフェクションを行ったヒトケラチノサイトからのヒトG−CSFの分泌を、製造業者が推奨する指示に従ってInvitrogenまたはR&D Systems(Minneapolis,MN)からのELISAキットを用いて定量化する。これらのデータは、例示的な1型サイトカインであるTNF−αおよびIFN−βを測定することによって、どの修飾mRNA(mmRNA)が、天然および他の化学修飾ポリヌクレオチドまたは参照化合物と比較して、細胞の自然免疫応答の低下を誘発することができるかを示す。
実施例39.ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)修飾mRNAに誘導される細胞増殖のアッセイ ヒトケラチノサイトを、InvitrogenからのSupplement S7を有するEPILIFE(登録商標)培地において、24ウェルのコラーゲンコーティングTRANSWELL(登録商標)(Coming,Lowell,MA)共培養組織培養プレート中で、70%を上回るコンフルエンスで成長させる。ケラチノサイトに、記載されるように、InvitrogenからのRNAIMAXと複合体形成した、750ngの示される化学修飾mRNA(mmRNA)を逆トランスフェクトする。修飾mRNA:RNAIMAX複合体を、記載のように形成する。ケラチノサイトの培地を、トランスフェクションの6〜8時間後に交換する。トランスフェクションの42時間後に、0.4μm細孔の半透過性ポリエステル膜を有する24ウェルのTRANSWELL(登録商標)プレート挿入物を、ヒトG−CSF修飾mRNAをトランスフェクトしたケラチノサイトを含有する培養プレートに入れる。
ヒト骨髄芽球細胞であるKasumi−1細胞またはKG−1(0.2×105細胞)を挿入ウェルに播種し、細胞増殖を、96ウェルプレートにおいて100〜120μL体積で、CyQuant Direct Cell Proliferation Assay(Invitrogen,Carlsbad,CA)を用いて共培養開始42時間後に定量化する。ヒトG−CSFをコードする修飾mRNAに誘導される骨髄芽球細胞増殖を、トランスフェクトされていないケラチノサイト/骨髄芽球の共培養対照ウェルに対して正規化した細胞増殖パーセントとして表す。ケラチノサイトおよび骨髄芽球の両方の挿入共培養ウェルにおいて分泌されたヒトG−CSFの濃度を、各修飾mRNAについて、共培養開始42時間後に二重に測定する。ヒトG−CSFの分泌を、製造業者が推奨する指示に従ってInvitrogenからのELISAキットを用いて定量化する。
ヒトケラチノサイトフィーダー細胞にトランスフェクトしたヒトG−CSF修飾mRNAおよびトランスフェクトされていないヒト骨髄芽球細胞を、RT −PCRにより検出する。試料細胞からの全RNAを、製造業者の指示に従ってRNEASY(登録商標)キット(Qiagen,Valencia,CA)を用いて抽出し、溶解する。抽出した全RNAを、ヒトG−CSF特異的プライマーを用いて、製造業者の指示に従ってPROTOSCRIPT(登録商標)M−MuLV Taq RT−PCRキット(New England BioLabs,Ipswich,MA)を用いて、修飾mRNA−G−CSFの特異的増幅のためにRT−PCRにかける。RT−PCR産物を、1.2%アガロースゲル電気泳動によって可視化させる。
実施例40:共培養アッセイ ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)をコードする、化学的にはっきりと異なるヌクレオチドから構成される修飾mRNAは、共培養環境においてトランスフェクション非コンピテント細胞の細胞増殖を刺激することができる。共培養には、ヒトケラチノサイト等の高度にトランスフェクト可能な細胞型と、白血球(WBC)等のトランスフェクション非コンピテントな細胞型とが含まれる。G−CSFをコードする修飾mRNAを、高度にトランスフェクト可能な細胞にトランスフェクトし、G−CSFタンパク質の産生および細胞外環境への分泌を可能にし、ここで、G−CSFは、パラクリン様の方式で、G−CSF受容体を発現する白血球を刺激して増殖させるように作用する。拡大したWBC集団を使用して、免疫が低下した患者を治療するか、または免疫抑制された患者のWBC集団を部分的に再構築し、そうすることで日和見感染症の危険性を低減することができる。別の実施例では、線維芽細胞等の高度にトランスフェクト可能な細胞に、難トランスフェクト性の胚幹細胞または誘導型多能性幹細胞の成長、維持、または分化を支持および刺激する、ある特定の成長因子をトランスフェクトする。
実施例41:ヒトIgG抗体の検出アッセイ A.ヒトIgG抗体のELISA検出 この実施例は、ヒトIgG修飾mRNA(mmRNA)をトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)およびヒト胎児腎臓(HEK、HER−2陰性)293細胞に由来するヒトIgGのELISAについて説明する。ヒト胎児胎児腎臓(HEK)293を、InvitrogenからのL−グルタミンの補充物質を有するCD293培地において、80〜90%のコンフルエントに達するまで成長させる。CHO細胞を、L−グルタミン、ヒポキサンチン、およびチミジンの補充物質を有するCD CHO培地において成長させる。一態様において、2×106細胞に、7mLの培地中、Corningからの75cm2の培養フラスコにおいて、InvitrogenからのRNAIMAX(商標)と複合体形成した24μgの修飾mRNAをトランスフェクトする。別の態様では、80,000の細胞に、24ウェルプレートにおいて、InvitrogenからのRNAIMAX(商標)と複合体形成した1μgの修飾mRNAをトランスフェクトする。修飾mRNA:RNAIMAX(商標)複合体は、mmRNAを、5倍体積希釈物中、CD293またはCD CHOいずれかの培地とともに室温で10分間バイアルにおいてインキュベートすることによって形成する。第2のバイアルにおいて、RNAIMAX(商標)試薬を、10倍体積希釈物中、CD293培地またはCD CHO培地とともに室温で10分間インキュベートする。次いで、mmRNAのバイアルをRNAIMAX(商標)のバイアルと混合し、室温で20〜30分間インキュベートした後、滴下方式でCHOまたはHEK細胞に添加する。培養上清を摂氏4度で保管する。24μgのmmRNAトランスフェクションでは、培養培地中に分泌されたヒトIgGの濃度をトランスフェクションの12、24、36時間後に測定し、1μgのmmRNAトランスフェクションは、36時間で測定する。トランスフェクトしたHEK293細胞からのトラスツズマブの分泌を、製造業者が推奨する指示に従ってAbcam(Cambridge,MA)からのELISAキットを用いて定量化する。データは、ヒト化IgG抗体(トラスツズマブ等)のmmRNAがHEK細胞において翻訳され得ること、およびトラスツズマブが細胞から分泌され、細胞外環境に放出されることを示す。さらに、データは、分泌タンパク質の産生のためにトラスツズマブをコードするmmRNAを細胞にトランスフェクトすることが、バイオリアクターまたは大規模な細胞培養条件に拡大可能であることを示す。
B.修飾mRNAにより産生されたヒトIgG抗体のウエスタン検出 ウエスタンブロットのCHO−K1細胞に、トラスツズマブ修飾mRNA(mmRNA)の重鎖および軽鎖をそれぞれ1μgずつ共トランスフェクトする。CHO細胞を、24−ウェルプレートにおいて標準的なプロトコルを用いて増殖させる。細胞上清または細胞ライセートを、トランスフェクションの24時間後に採取し、12%SDS−Pageゲルで分離させ、Invitrogen(Carlsbad,CA)によるIBOT(登録商標)を用いてニトロセルロース膜上に移す。細胞を、ウサギポリクローナル抗体とDYLIGHT594(ab96904,abcam,Cambridge,MA)に接合されるヒトIgGとの第1の複合体、およびヤギポリクローナル抗体とアルカリホスファターゼと接合されるRb IgGとの第2の複合体とともにインキュベートする。インキュベーションの後、抗体を、Invitrogen(Carlsbad,CA)によるNovex(登録商標)アルカリホスファターゼ発色基質を用いて検出する。
C.修飾mRNAにより産生されるトラスツズマブおよびリツキシマブの細胞免疫染色 CHO−K1細胞に、トラスツズマブまたはリツキシマブいずれかの重鎖および軽鎖をそれぞれ10ngずつ共トランスフェクトする。細胞を、GIBCO(登録商標)(Grand Island,NY)からのF−12K培地および10%FBSにおいて増殖させる。細胞を、PBS中の4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中の0.1% Triton X−100で5〜10分間室温で透過性にさせ、細胞を室温のPBSで3回洗浄する。トラスツズマブおよびリツキシマブの染色を、製造業者が推奨する希釈に従ってDYLIGHT(登録商標)594(ab96904,abcam,Cambridge,MA)に接合されたヒトIgGに対するウサギポリクローナル抗体を用いて行う。核DNA染色を、Invitrogen(Carlsbad,CA)からのDAPI色素を用いて行う。トラスツズマブおよびリツキシマブのタンパク質は、修飾mRNAのトランスフェクション後に翻訳され、細胞質に局在化される。トランスフェクションの13時間後に写真を撮影する。
D.修飾mRNAにより産生されるトラスツズマブおよびリツキシマブの結合免疫ブロットアッセイ トラスツズマブおよびリツキシマブを、結合免疫ブロット検出アッセイを用いて検出する。種々の濃度(100ng/μL〜0ng/μL)のErB2ペプチド(ab40048,abeam,Cambridge,MA)、トラスツズマブおよびCD20ペプチドの抗原(ab97360,abeam,Cambridge,MA)、リツキシマブの抗原を、12%SDS−Pageゲル上で泳動させ、InvitrogenからのiBlotを用いて膜に移す。膜を、トラスツズマブまたはリツキシマブいずれかの重鎖および軽鎖をそれぞれ500ngずつ共トランスフェクトしたCHO−K1細胞からの、それぞれの細胞上清とともに1時間インキュベートする。膜を1%BSAでブロッキングし、アルカリホスファターゼ(abcam,Cambridge,MA)と接合した二次抗ヒトIgG抗体を添加する。抗体検出を、Invitrogen(Carlsbad,CA)によるNOVEXアルカリホスファターゼ発色基質を用いて行う。データは、修飾mRNAから生成されたヒト化IgG抗体が、それらのそれぞれの抗原を認識し、そこに結合することができることを示す。
E.細胞増殖アッセイ HER2/neu受容体を過剰発現する、ヒト乳腺癌由来の付着細胞であるSK−BR−3細胞株を使用して、修飾mRNA(mmRNA)により生成されたトラスツズマブの抗増殖特性を比較することができる。修飾mRNAから生成された種々の濃度の精製トラスツズマブおよびトラスツズマブを、細胞培養液に添加し、細胞増殖に及ぼすそれらの作用を、三連の細胞傷害性および生存率アッセイで評価する。
実施例42:細胞培養液への修飾mRNAのバルクトランスフェクション A.カチオン性脂質送達ビヒクル RNAトランスフェクションを、RNAIMAX(商標)(Invitrogen,Carlsbad,CA)またはTRANSIT−mRNA(Mirus Bio,Madison,WI)カチオン性脂質送達ビヒクルを用いて実行する。RNAおよび試薬を、まず、Opti−MEM基本培地(Invitrogen,Carlsbad,CA)中に希釈する。100ng/μLのRNAを5倍希釈し、RNA1μg当たり5μLのRNAIMaxを10倍希釈する。希釈した成分をプールし、室温で15分間インキュベートした後、培養培地に分注する。TRANSIT−mRNAのトランスフェクションについては、100ng/μLのRNAをOpti−MEM中に10倍希釈し、BOOST試薬を添加し(RNA1μg当たり2μLの濃度で)、TRANSIT−mRNAを添加し(RNA1μg当たり2μLの濃度で)、次いで、RNA−脂質複合体を、室温で2分間インキュベートした後、培養培地に送達する。RNAのトランスフェクションは、RiPSの誘導についてはNutristem xenofree hES培地(Stemgent,Cambridge,MA)において、ケラチノサイトの実験についてはDermal Cell Basal Medium plus Keratinocyte Growth Kitを加えたDermal Cell Basal培地(ATCC)において、そしてすべての他の実験については2%FBSを加えたOpti−MEMにおいて行う。宿主細胞への修飾mRNA(mmRNA)の導入の成功は、蛍光マーカー、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)等、様々な既知の方法を用いて監視することができる。修飾mRNAのトランスフェクションの成功はまた、例えば、ウエスタンブロットまたは免疫細胞化学により標的ポリペプチドのタンパク質発現レベルを測定することによっても判定することができる。同様の方法が、同様のRNA−脂質複合体比に従って複数リットル(5〜10,000L)の培養形式に拡大した大規模なものにも適用され得る。
B.外因性合成mRNA転写物のエレクトロポレーション送達 エレクトロポレーションのパラメータを、MRC−5線維芽細胞にインビトロ合成修飾mRNA(mmRNA)転写物をトランスフェクトし、特に外因性転写物を検出するように設計されたプライマーを用いた定量的RT−PCRによりトランスフェクト効率を測定することによって、最適化する。2mmのギャップを有する標準的なエレクトロポレーションキュベットにおいて、Fに蓄電した150μFのコンデンサを50μLのOpti−MEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中に懸濁させた2.5x106の細胞に放電することは、高い生存率(70%超)を維持しながら、標準曲線法を用いて判定される細胞当たり10,000コピーを超える修飾mRNA転写物の反復送達に十分である。さらなる実験により、細胞にmmRNA転写物を効率よくトランスフェクトするために必要な電圧が、エレクトロポレーション時の細胞密度に依存し得ることが明らかになり得る。細胞密度は、1x106細胞l/50μLから2.5x106細胞/50μLの密度まで多様であり、細胞当たりの転写物コピーで測定される同様の効率で細胞をトランスフェクトするには110V〜145Vが必要である。大規模な流動エレクトロポレーション戦略に類似し、上述の制約で説明された方法に類似した大規模な複数リットル(5〜10,000L)のエレクトロポレーションを行うことができる(Li et al.2002、Geng et al.,2010)。
実施例43:リポプレックスを用いたインビボ送達 A.ヒトEPO修飾RNAのリポプレックス 100μgの修飾ヒトエリスロポエチンmRNA(mRNAは配列番号26171に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)(EPO;完全修飾5−メチルシトシン;N1−メチル−シュードウリジン)を含有する製剤を、50〜70μL中30体積%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成させ(リポプレックス−h−Epo−46;2世代目またはGen2)、4匹のC57/BL6マウスに筋肉内送達した。他の群は、100μgの修飾ルシフェラーゼmRNAを含有する対照群として機能し、30体積%のRNAiMAX(商標)とリポプレックス形成したリポプレックス化修飾ルシフェラーゼmRNA(リポプレックス−luc)(IVT cDNA配列は配列番号26177に示される;mRNA配列は配列番号26178に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)の注入を受容するマウス、または65μLの投薬量で陰性対照として製剤緩衝液の注入を受容するマウスから構成された。筋肉内注入の13時間後、血清を各マウスから採取して、ヒトEPO ELISAによりマウス血清中のヒトEPOタンパク質の量を測定し、結果を表61に示す。 表61.ヒトEPO産生(筋肉内注入経路)
B.ヒトG−CSF修飾RNAリポプレックス 修飾ヒトG−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)(5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF(G−CSF)または5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF(G−CSF−N1)の2つの形態のうちの1つを100μg含有する製剤を、30体積%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成させ、C57/BL6マウスに、150μLを筋肉内(I.M)、150μLを皮下(S.C)、および225μLを静脈内(I.V)送達した。
3つの対照群に、100μgの修飾ルシフェラーゼmRNA(IVT cDNA配列は配列番号26177に示される;mRNA配列は配列番号26178に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に置換)を筋肉内(Luc−unsp I.M.)、または150μgの修飾ルシフェラーゼmRNAを静脈内(Luc−unsp I.V.)、または150μLの製剤緩衝液を筋肉内(緩衝液I.M.)のいずれかで、投与した。製剤を投与した6時間後に、血清を各マウスから採取して、ヒトG−CSF ELISAによりマウス血清中のヒトG−CSFタンパク質を測定し、結果を表62に示す。
これらの結果は、5−メチルシトシン/シュードウリジンおよび5−メチルシトシン/N1−メチル−シュードウリジンの両方の修飾ヒトG−CSF mRNAが、リポプレックス製剤で静脈内または筋肉内の投与経路を介して送達した場合に、血清中で特異的なヒトG−CSFタンパク質発現をもたらし得ることを示す。 表62.血清中のヒトG−CSF(I.M.、I.V.、S.C.注入経路)
C.ヒトG−CSF修飾RNAリポプレックスの比較 5−メチルシトシン(5mc)およびシュードウリジン(ψ)修飾を有する30体積%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成した修飾ヒトG−CSF mRNA(G−CSF−Gen1−リポプレックス)、生理食塩水中の5mcおよびψ修飾を有する修飾ヒトG−CSF mRNA(G−CSF−Gen1−生理食塩水)、30体積%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成したN1−5−メチルシトシン(N1−5mc)およびψ修飾を有する修飾ヒトG−CSF mRNA(G−CSF−Gen2−リポプレックス)、生理食塩水中のN1−5mcおよびψ修飾を有する修飾ヒトG−CSF mRNA(G−CSF−Gen2−生理食塩水)、30体積%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成した5mcおよびψ修飾を有する修飾ルシフェラーゼ(Luc−リポプレックス)、または生理食塩水中の5mcおよびψ修飾を有する修飾ルシフェラーゼmRNA(Luc−生理食塩水)のいずれかを100μg含有する製剤を、筋肉内(I.M.)または皮下(S.C.)送達し、各投与方法の対照群には、80μLの用量の製剤緩衝液(F緩衝液)をC57/BL6マウスに与えた。注入の13時間後に、注入部位からの血清および組織をマウスから採取し、G−CSF ELISAによって分析して、ヒトG−CSFタンパク質レベルを比較した。筋肉内投与から得られたマウス血清中のヒトG−CSFタンパク質の結果、および皮下投与の結果を、表63に示す。
これらの結果は、5−メチルシトシン/シュードウリジンおよび5−メチルシトシン/N1−メチル−シュードウリジン修飾ヒトG−CSF mRNAが、生理食塩水製剤かリポプレックス製剤かにかかわらず、筋肉内または皮下の投与経路で送達した場合に、血清中に特異的なヒトG−CSFタンパク質発現をもたらし得ることを示す。表63に示されるように、5−メチルシトシン/N1−メチル−シュードウリジン修飾ヒトG−CSF mRNAは、概して、5−メチルシトシン/シュードウリジン修飾ヒトG−CSF mRNAと比較して、増加したヒトG−CSFタンパク質産生を示す。 表63.マウス血清におけるヒトG−CSFタンパク質
D.mCherry修飾RNAリポプレックスの比較 筋肉内および皮下投与 30体積%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成した修飾mCherry mRNA(mRNA配列は配列番号26169に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)または生理食塩水中の修飾mCherry mRNAのいずれかを100μg含有する製剤を、マウスに筋肉内および皮下送達する。製剤緩衝液も、筋肉内または皮下のいずれかで対照マウス群に投与する。マウスへの注入部位を、切片化のために注入の17時間後に採取して、タンパク質の産生に関与する細胞型(複数可)を判定する。
硝子体内投与 RNAIMAX(商標)とリポプレックス形成した修飾mCherry mRNA、製剤緩衝液中の修飾mCherry mRNA、RNAMAX(商標)とリポプレックス形成した修飾ルシフェラーゼmRNA、製剤緩衝液中の修飾ルシフェラーゼのいずれかを10μg含有する製剤を、5μL/眼の投薬量でラットに硝子体内注入(IVT)により投与することができる。製剤緩衝液も、5μL/眼の投薬量で対照ラット群にIVTにより投与する。処理を受けたラットの眼を、切片化および溶解のために注入の18時間後に採取して、mmRNAが、インビボで眼に効果的に送達され、タンパク質産生をもたらし得るかどうかを判定し、さらに、インビボでのタンパク質の産生に関与する細胞型(複数可)を判定することができる。
鼻腔内投与 30体積%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成した修飾mCherry mRNA、生理食塩水中の修飾mCherry mRNA、30体積%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成した修飾ルシフェラーゼmRNA、または生理食塩水中の修飾ルシフェラーゼmRNAのいずれかを100μg含有する製剤を、鼻腔内送達する。製剤緩衝液も対照群に鼻腔内投与する。点滴注入の約13時間後に、切片化(mCherry mRNAを受容したものについて)または均質化(ルシフェラーゼmRNAを受容したものについて)のために肺を採取することができる。これらの試料を用いて、mmRNAが、インビボで肺に効果的に送達され、タンパク質産生をもたらし得るかどうかを判定し、さらに、インビボでのタンパク質の産生に関与する細胞型(複数可)を判定することができる。
実施例44:種々の脂質比を使用したインビボ送達 修飾mRNAを、C57/BL6マウスに送達して、種々の脂質比および結果として得られるタンパク質発現を評価した。10%、30%、もしくは50%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成した100μgの修飾ヒトEPO mRNA(mRNAは配列番号26171に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)、10%、30%、もしくは50%のRNAIMAX(商標)とリポプレックス形成した100μgの修飾ルシフェラーゼmRNA(IVT cDNA配列は配列番号26177に示される;mRNA配列は配列番号26178に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)、または製剤緩衝液の製剤を、単回70μL用量で、マウスに筋肉内投与した。血清を、注入の13時間後に採取し、ヒトEPO ELISAを行って、各マウスにおけるヒトEPOタンパク質レベルを判定した。表64に示されるヒトEPO ELISAの結果は、筋肉内で発現された修飾ヒトEPOが、異なる割合のRNAIMAX(商標)のそれぞれについて、血清中に分泌されることを示す。 表64.マウス血清中のヒトEPOタンパク質(IM注入経路)
実施例45:哺乳動物における筋肉内および皮下インビボ送達 製剤緩衝液中に製剤化された修飾ヒトEPO mRNA(mRNA配列は配列番号26171に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を、C57/BL6マウスまたはスプラーグドーリーラットのいずれかに送達して、ヒトEPO産生への用量依存性を評価した。ラットに、表65の投薬表に記載されるように、50μLの修飾ヒトEPO mRNA(h−EPO)、修飾ルシフェラーゼmRNA(Luc)(IVT cDNA配列は配列番号26177に示される;mRNA配列は配列番号26178に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)、または製剤緩衝液(F緩衝液)を筋肉内注入した。
マウスに、表66の投薬表に記載されるように、50μLの修飾ヒトEPO mRNA(h−EPO)、修飾ルシフェラーゼmRNA(Luc)、または製剤緩衝液(F緩衝液)を筋肉内または皮下注入した。注入した13時間後に、血液を採取し、血清を分析して、各マウスまたはラットのヒトEPO量を判定した。ラットの研究についてのpg/mL単位での平均および幾何平均も表65に示す。 表65.ラット研究
表66.マウス研究
実施例46:筋肉内インビボ送達後の活性持続期間 製剤緩衝液中に製剤化された修飾ヒトEPO mRNA(mRNA配列は配列番号26171に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を、スプラーグドーリーラットに送達して、用量応答の持続期間を判定した。ラットに、表67の投薬表に記載されるように、50μLの修飾ヒトEPO mRNA(h−EPO)、修飾ルシフェラーゼmRNA(IVT cDNA配列は配列番号26177に示される;mRNA配列は配列番号26178に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)(Luc)、または製剤緩衝液(F緩衝液)を筋肉内注入した。ラットに、筋肉内注入の2、6、12、24、48、および72時間後に採血を行って、所与の時点での血清中のヒトEPOの濃度を判定した。この研究についてのpg/mL単位での平均および幾何平均も表67に示す。 表67.投薬表
実施例47:投与の経路 さらなる研究を行って、異なる投与経路を使用した投薬について調べた。実施例35に概説したプロトコルに従って、1群当たり4匹のマウスに、表68に概説される投薬表に従って筋肉内(I.M.)、静脈内(IV)、または皮下(S.C.)投薬を行った。血清を注入の13時間後にすべてのマウスから採取し、組織を筋肉内および皮下投与群の注入部位から採取し、脾臓、肝臓、および腎臓を静脈内群から採取した。筋肉内群および皮下群からの結果を、表69に示す。 表68.投薬表
表69.マウス血清中のヒトEPOタンパク質(I.M.注入経路)
実施例48.急速排出脂質ナノ粒子(reLNP)の研究 A.修飾RNA reLNPの製剤化 合成脂質、1,2−ジステアロイル−3−ホスファチジルコリン(DSPC)(Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL)、コレステロール(Sigma−Aldrich,Taufkirchen,Germany)、およびα−[3’−(1,2−ジミリストイル−3−プロパノキシ)−カルボキサミド−プロピル]−ω−メトキシ−ポリオキシエチレン(PEG−c−DOMG)(NOF,Bouwelven,Belgium)の溶液を調製し、−20℃で保管する。合成脂質は、内部エステルを有するDLin−DMA、末端エステルを有するDLin−DMA、DLin−MC3−DMA−内部エステル、および末端エステルを有するDLin−MC3−DMAから選択される。reLNPを、50:10:38.5:1.5(reLNP:DSPC:コレステロール:PEG−c−DOMG)のモル比が得られるように合わせる。脂質溶液と修飾mRNA溶液とを10:1、15:1、20:1、および30:1の総脂質対修飾mRNAの重量比で合わせることによって、reLNPおよび修飾mRNAの製剤を調製する。
B.製剤の特徴付け Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)を用いて、修飾mRNAナノ粒子の粒径、多分散指標(PDI)、およびゼータ電位を、粒径の判定時は1倍PBS中、およびゼータ電位の判定時は15mM PBS中において、判定する。
紫外可視分光法を用いて、修飾mRNAナノ粒子製剤の濃度を判定する。混合した後、溶液の吸光度スペクトルを、DU 800分光光度計(Beckman Coulter,Beckman Coulter,Inc.,Brea,CA)において、230nm〜330nmで記録する。ナノ粒子製剤中の修飾RNAの濃度を、製剤中に使用した修飾RNAの減衰係数および260nmの波長での吸光度と330nmの波長でのベースラインとの間の差に基づいて、計算する。
QUANT−IT(商標)RIBOGREEN(登録商標)RNAアッセイ(Invitrogen Corporation Carlsbad,CA)を用いて、ナノ粒子による修飾RNAのカプセル封入を評価する。試料を希釈し、ポリスチレン96ウェルプレートに移し、次いで、TE緩衝液または2%Triton X−100溶液のいずれかを添加する。プレートをインキュベートし、RIBOGREEN(登録商標)試薬をTE緩衝液中に希釈し、この溶液を各ウェルに添加する。蛍光強度を、蛍光プレートリーダー(Wallac Victor 1420 Multilablel Counter;Perkin Elmer,Waltham,MA)を用いて測定する 試薬ブランクの蛍光値を、試料のそれぞれから差し引き、遊離修飾RNAの割合を、無傷な試料の蛍光強度を分断された試料の蛍光値で除すことによって判定する。
C.インビトロインキュベーション ヒト胎児腎臓上皮(HEK293)および肝細胞癌上皮(HepG2)細胞(LGC standards GmbH,Wesel,Germany)を、96ウェルプレート(Greiner Bio−one GmbH,Frickenhausen,Germany)に播種し、HEK293細胞のプレートを、1型コラーゲンで事前コーティングする。100μLの細胞培養培地中、HEK293は1ウェル当たり約30,000の細胞密度、HepG2は約35,000の細胞密度で、播種する。mCherry mRNA(mRNA配列は配列番号26169に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、細胞を播種した直後に添加し、インキュベートする。インビトロ転写(IVT)に使用される、T7プロモーター、5’非翻訳領域(UTR)、および3’UTRを有するmCherry cDNAを、配列番号26170に示す。
培養培地上清を96ウェルPro−Bind U底プレート(Beckton Dickinson GmbH,Heidelberg,Germany)に移すことによって、細胞を収集する。細胞を、半量のトリプシン/EDTA(Biochrom AG,Berlin,Germany)でトリプシン化し、それぞれの上清とともにプールし、1回量のPBS/2%FCS(いずれもBiochrom AG,Berlin,Germany)/0.5%ホルムアルデヒド(Merck,Darmstadt,Germany)を添加することによって固定する。次いで、試料を、LSRIIサイトメーター(Beckton Dickinson GmbH,Heidelberg,Germany)において、励起レーザーおよびPE−Texas Red用のフィルターを用いてフローサイトメーター測定にかける。すべてのイベントの平均蛍光強度(MFI)および4つの独立したウェルの標準偏差を、分析した試料について提示する。
D.インビボ製剤研究 マウスに、修飾mRNAおよびreLNPを含有する製剤の単回用量を静脈内投与する。マウスに投与する修飾mRNAは、G−CSF(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)、第IX因子(mRNAは配列番号26172に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)、またはmCherry(mRNA配列は配列番号26169に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)から選択される。
マウスに、100μg、10μg、または1μgの製剤化修飾mRNAを注入し、製剤を投与した8時間後に屠殺する。ヒトG−CSF修飾mRNAを含有する製剤を投与したマウスからの血清を、特異的G−CSF ELISAによって測定し、ヒト第IX因子修飾RNAを投与したマウスからの血清を、特異的第IX因子ELISAまたは発色アッセイによって分析する。mCherry修飾mRNAを投与したマウスからの肝臓および脾臓を、免疫組織化学(IHC)または蛍光活性化細胞選別(FACS)によって分析する。対照として、1つのマウス群にはいずれの製剤も注入せずに、それらの血清および組織を採取し、ELISA、FACS、および/またはIHCによって分析する。
実施例49.VEGF−Aのインビトロトランスフェクション ヒト血管内皮成長因子アイソフォームA(VEGF−A)修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26181に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、24マルチウェルプレートにおいて、逆トランスフェクションを介してヒトケラチノサイト細胞にトランスフェクトした。ヒトケラチノサイト細胞を、Invitrogen(Carlsbad,CA)からのSupplement S7を有するEPILIFE(登録商標)培地において、50〜70%のコンフルエンスに達するまで増殖させた。細胞に、Invitrogen(Carlsbad,CA)からのRNAIMAX(商標)と複合体形成した、0、46.875、93.75、187.5、375、750、および1500ngのVEGF−Aをコードする修飾mRNA(mmRNA)をトランスフェクトした。RNA:RNAIMAX(商標)複合体は、まず、RNAを、5倍体積希釈物中、補充物質不含のEPILIFE(登録商標)培地とともに室温で10分間インキュベートすることによって形成した。第2のバイアルにおいて、RNAIMAX(商標)試薬を、10倍体積希釈物中、補充物質不含のEPILIFE(登録商標)培地とともに室温で10分間インキュベートした。次いで、RNAのバイアルをRNAIMAX(商標)のバイアルと混合し、室温で20〜30分間インキュベートした後、滴下方式で細胞に添加した。
ヒトケラチノサイト細胞にトランスフェクトした、完全に最適化されたVEGF−AをコードするmRNA(mRNA配列は配列番号26181に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)には、翻訳時の修飾、例えば、天然ヌクレオシドトリホスフェート(NTP)、各ウリジン部位におけるシュードウリジンおよび各シトシン部位における5−メチルシトシン(シュード−U/5mC)、ならびに各ウリジン部位におけるN1−メチル−シュードウリジンおよび各シトシン部位における5−メチルシトシン(N1−メチル−シュード−U/5mC)が含まれた。細胞に、VEGF−AをコードするmmRNAをトランスフェクトし、培養培地中に分泌されたVEGF−Aの濃度(ρg/mL)を、製造業者が推奨する指示に従ってInvitrogen(Carlsbad,CA)からのELISAキットを用いて、濃度のそれぞれについて、トランスフェクションの6、12、24、および48時間後に測定した。表70および図6A、6B、および6Cに示されるこれらのデータは、VEGF−Aをコードする修飾mRNAがヒトケラチノサイト細胞において翻訳され得ること、およびVEGF−Aが細胞から輸送され、細胞外環境に放出されることを示す。 表70.VEGF−Aの投薬およびタンパク質の分泌
実施例50.第IX因子のインビボ研究 製剤緩衝液中に製剤化したヒト第IX因子mmRNA(Gen1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を、筋肉内注入を介してマウスに送達した。結果は、投与の13時間後に測定したとき、血清中の第IX因子タンパク質が上昇していたことを示す。
この研究において、マウス(第IX因子についてはN=5、ルシフェラーゼまたは緩衝液対照についてはN=3)に、2x100μg/マウスで、50μLの第IX因子mmRNA(mRNA配列は配列番号26172に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)、ルシフェラーゼ(IVT cDNA配列は配列番号26177に示される;mRNA配列は配列番号26178に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)、または製剤緩衝液(F緩衝液)を筋肉内注射した。マウスに、筋肉内注射の13時間後に採血を行って、pg/mL単位での血清中のヒトポリペプチドの濃度を判定した。結果は、第IX因子mmRNAの投与が、ルシフェラーゼまたは緩衝液対照のいずれかの投与による100pg/mL未満の第IX因子と比較して、13時間で、1600pg/mLのレベルをもたらしたことを明らかにした。
実施例51.複数部位の投与:筋肉内および皮下 Gen1またはGen2(5−メチルシトシン(5mc)およびシュードウリジン(ψ)修飾、G−CSF−Gen1;またはN1−5−メチルシトシン(N1−5mc)およびψ修飾、G−CSF−Gen2)のいずれかとして修飾された、製剤緩衝液中に製剤化されたヒトG−CSF修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、筋肉内(IM)または皮下(SC)注入を介してマウスに送達した。3日間(24時間間隔)、1日4用量または2×50μg(2つの部位)の注入を行った。4用量は、血液採取およびCBC分析の6時間前に投与した。対照には、ルシフェラーゼ(IVT cDNA配列は配列番号26177に示される;mRNA配列は配列番号26178に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)、または製剤緩衝液(F緩衝液)が含まれた。マウスに、1回目のmRNA注入の72時間後(最後の修飾mRNA投薬の6時間後)に採血を行って、好中球数に対するmRNAにコードされるヒトG−CSFの作用を判定した。投薬レジメンを表71に示し、結果として得られた好中球数も同様に示す(1000単位/μL)。表71において、アスタリスク(*)は、p<0.05での統計的有意性を示す。
筋肉内投与については、データは、Gen1 G−CSF mRNAでは3日目の時点で対照を上回る4倍、Gen2 G−CSF mmRNAでは2倍の好中球数の増加を示す。皮下投与については、データは、Gen2 G−CSF mRNAでは3日目の時点で対照を上回る2倍の好中球数の増加を示す。
これらのデータは、5−メチルシチジン/シュードウリジンおよび5−メチルシチジン/N1−メチル−シュードウリジン−修飾mRNAのいずれも、血中好中球数における特異的な増加から明らかなように、生物学的に活性であり得ることを示す。 表71.投薬レジメン
実施例52.静脈内投与 5−メチルシトシン(5mc)およびシュードウリジン(ψ)修飾(Gen1)で修飾されたか、または修飾を有さない、10%リポプレックス(RNAiMax)中に製剤化されたヒトG−CSF修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、50μgのRNAの用量および100μL体積で静脈内(IV)注入を介して、0、2、および4日目にマウスに送達した。好中球を、1、5、および8日目に測定した。対照には、非特異的哺乳動物RNAまたは製剤緩衝液単独(F緩衝液)が含まれた。マウスに、1、5、および8日目に採血を行って、好中球数を増加させる修飾mRNAによりコードされるヒトG−CSFの作用を判定した。投薬レジメンを表72に示し、結果として得られた好中球数も同様に示す(1000単位/μL、K/μL)。
静脈内投与については、データは、G−CSF修飾mRNAでは5日目の時点で対照を上回る4〜5倍の好中球数の増加を示すが、未修飾G−CSF mRNAまたは非特異的対照では示さない。血球数は、最後の注入の4日後にベースラインに戻った。白血球集団に他の変化は観察されなかった。
表72において、アスタリスク(*)は、緩衝液と比較して、p<0.001での統計的有意性を示す。
これらのデータは、リポプレックス製剤化5−メチルシチジン/シュードウリジン−修飾mRNAが、血中好中球数における特異的な増加にから明らかなように、静脈内の投与経路を通じて送達した場合に、生物学的に活性であり得ることを示す。他の細胞サブセットは、有意に変化されなかった。同様に投与された未修飾G−CSF mRNAは、好中球数に対する薬理学的効果を示さなかった。 表72.投薬レジメン
実施例53.生理食塩水製剤:筋肉内投与 A.タンパク質発現 ヒトG−CSF修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)とヒトEPO mmRNA(mRNA配列は配列番号26171に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)、G−CSF修飾mRNA(5−メチルシトシン(5mc)およびシュードウリジン(ψ)で修飾)とEPO修飾mRNA(N1−5−メチルシトシン(N1−5mc)およびψ修飾で修飾)を、製剤緩衝液(150mMの塩化ナトリウム、2mMの塩化カルシウム、2mMのリン酸塩、0.5mMのEDTA、pH6.5で)中で製剤化し、100μgの用量で筋肉内(IM)注入を介してマウスに送達した。
対照には、ルシフェラーゼ(IVT cDNA 配列は配列番号26177に示される;mRNA配列は配列番号26178に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)または製剤緩衝液(F緩衝液)が含まれた。マウスに、注入の13時間後に採血を行って、pg/mL単位で血清中のヒトポリペプチドの濃度を判定した。(G−CSF群では、マウス血清中のヒトG−CSFを測定し、EPO群では、マウス血清中のヒトEPOを測定した)。データを表73に示す。 表73.投薬レジメン
B.用量応答 ヒトEPO修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26171に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を、製剤緩衝液中に製剤化し、筋肉内(IM)注入を介してマウスに送達した。
対照には、ルシフェラーゼ(mRNA配列は配列番号26178に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)または製剤緩衝液(F緩衝液)が含まれた。マウスに、注入の13時間後に採血を行って、pg/mL単位で血清中のヒトポリペプチドの濃度を判定した。用量および発現を表74に示す。 表74.投薬レジメンおよび発現
実施例54.EPO複数回用量/複数回投与 1回で複数の筋肉内注入部位を用いる研究を設計し、実行した。
単一の複数回用量実験の設計は、製剤緩衝液で投与されるヒトエリスロポエチン(EPO)mmRNA(mRNA配列は配列番号26171に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)またはG−CSF mmRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)の使用を伴った。投薬ビヒクル(F緩衝液)を対照として用いた。EPOおよびG−CSF修飾mRNAを、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で修飾した。
動物(n=5)、すなわちスプラーグドーリーラットに、100μgの単回単位用量(1つの大腿に送達)をIM(筋肉内)注射した。複数回投薬については、100μgの6用量(2つの大腿に送達)を、EPOおよびG−CSF mmRNAの両方に用いた。対照への投薬には、単回用量で緩衝液の使用が含まれた。ヒトEPOの血液レベルを、注入の13時間後に評価した。
ヒトEPOタンパク質を、筋肉内注入の13時間後にラットの血清において測定した。5つの群のラットを処理し、評価した。結果を表75に示す。 表75.複数回用量研究
実施例55.シグナル配列交換研究 ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)をコードするmmRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)の複数の変異体を、修飾ヌクレオチドシュードウリジンおよび5−メチルシトシン(シュード−U/5mC)を用いて合成した。これらの変異体には、野生型N末端分泌シグナルペプチド配列(MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEA;配列番号95)、または非分泌シグナルペプチド配列、または他のmRNAから得た分泌シグナルペプチド配列のいずれかをコードするG−CSF構築物が含まれた。これらは、野生型G−CSFシグナルペプチド配列がヒトα−1−抗トリプシン(AAT)(MMPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA;配列番号94)、ヒト第IX因子(FIX)(MQRVNMIMAESPSLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKR;配列番号96)、ヒトプロラクチン(Prolac)(MKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP;配列番号97)、またはヒトアルブミン(Alb)(MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR;配列番号98)のいずれかのシグナルペプチド配列で置換された配列を含んでいた。
各G−CSF変異体をコードする250ngの修飾mRNAを、1μLのLipofectamine 2000(Life Technologies)を用いて、各ウェルが300,000の細胞を含有する24ウェルプレートにおいてHEK293A(表中293A)、マウス筋芽細胞(表中MM)(C2C12、CRL−1772、ATCC)、およびラット筋芽細胞(表中RM)(L6株、CRL−1458、ATCC)の細胞株にトランスフェクトした。上清を24時間後に収集し、分泌されたG−CSFタンパク質を、ヒトG−CSF ELISAキット(Life Technologies)を用いてELISAによって分析した。表76に示されるデータは、アルブミンシグナルペプチドをコードするG−CSF mmRNAをトランスフェクトした細胞が、その野生型対応物よりも少なくとも12倍多くのG−CSFタンパク質を分泌することを示す。 表76.シグナルペプチド交換
実施例56.サイトカイン研究:PBMC A.PBMCの単離および培養 2人のドナーに由来する50mLのヒト血液を、ヘパリンナトリウム管で、Research Blood Components(ロットKP30928およびKP30931)から受容した。各ドナーについて、血液をプールし、DPBS(SAFC Bioscience 59331C、ロット071M8408)で70mLに希釈し、2つの50mLの円錐管に等分した。10mLのFicoll Paque(GE Healthcare 17−5442−03、ロット10074400)を、血液層の下に静かに分注した。管を2000rpmで30分間、低加速および制動で遠心分離した。管を除去し、軟膜PBMC層を、新しい50mLの円錐管に静かに移し、DPBSで洗浄した。管を1450rpmで10分間遠心分離した。
上清を吸引し、PBMCペレットを50mLのDPBS中に再懸濁させ、洗浄した。管を1250rpmで10分間遠心分離した。この洗浄ステップを繰り返し、PBMCペレットを19mLのOptimem I(Gibco 11058、ロット1072088)中に再懸濁させ、計数した。細胞懸濁液を3.0×10^6細胞/mLの濃度の生細胞に調節した。
次いで、これらの細胞を、1ウェル当たり50μLで1人のドナーにつき5つの96ウェル組織培養処理丸底プレート(Costar 3799)に播種した。30分以内に、トランスフェクション混合物を1ウェル当たり50μLの量で各ウェルに添加した。トランスフェクションの4時間後、培地に10μLのウシ胎児血清(Gibco 10082、ロット1012368)を補充した。
B.トランスフェクション調製物 ヒトG−CSFをコードするmmRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)((1)天然のNTP、(2)5−メチルシチジンおよびシュードウリジンでの100%置換、または(3)5−メチルシチジンおよびN1−メチル−シュードウリジンでの100%置換いずれかを含有、ルシフェラーゼをコードするmmRNA(IVT cDNA配列は配列番号26177に示される;mRNA配列は 配列番号26178に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)((1)天然のNTPまたは(2)5−メチルシチジンおよびシュードウリジンでの100%置換のいずれかを含有)、ならびにTLRアゴニストR848(Invivogen tlrl−r848)を、最終体積2500μLのOptimem I中、38.4ng/μLに希釈した。
別個に、432μLのLipofectamine 2000(Invitrogen 11668−027、ロット1070962)を、13.1mLのOptimem Iで希釈した。96ウェルプレートにおいて、各mmRNA、陽性対照(R−848)、または陰性対照(Optimem I)の9個の135μLアリコートを、135μLの希釈Lipofectamine 2000に添加した。トランスフェクトされる物質を含有するプレートを20分間インキュベートした。次いで、トランスフェクション混合物を、1ウェル当たり50μLでそれぞれのヒトPBMCに移した。その後、プレートを37℃でインキュベートした。2、4、8、20、および44時間で、各プレートをインキュベーターから取り出し、上清を凍結させた。
最後のプレートを取り出した後、上清を、ヒトG−CSF ELISAキット(Invitrogen KHC2032)およびヒトIFN−α ELISAキット(Thermo Scientific 41105−2)を用いてアッセイした。各条件は、二重に行われた。
C.結果 コードされたタンパク質を産生する未修飾および修飾mRNA(mmRNA)の能力を経時的に評価し(G−CSF産生)、インターフェロンα産生により測定される自然免疫認識を引き起こすmRNAの能力も同様に評価した。インビトロPBMC培養物の使用は、オリゴヌクレオチドの免疫刺激能を測定する一般的な方法である(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Robbins et al.,Oligonucleotides 2009 19:89−102)。
結果を、4パラメータのロジスティック曲線適合を用いて、各ELISAプレートの標準曲線に対して補間した。特定のELISAによって測定される経時的なG−CSFおよびIFN−α産生の2人の別個のPBMCドナーからの平均を表77および78に示す。
G−CSF ELISAでは、Lipofectamine 2000未処理条件によるバックグラウンドシグナルを、各時点で差し引いた。データは、ヒト末梢血単核によるヒトG−CSFタンパク質の特異的産生が、天然のNTP、5−メチルシチジンおよびシュードウリジンでの100%置換、または5−メチルシチジンおよびN1−メチル−シュードウリジンでの100%置換を含有するG−CSF mRNAで見られることを示した。G−CSFの産生は、修飾mRNAの使用により未修飾mRNAと比較して有意に増加し、5−メチルシチジンおよびN1−メチル−シュードウリジンを含有するG−CSF mmRNAが、最も高いG−CSF産生を示した。自然免疫認識に関して、未修飾mRNAは、かなりのIFN−α産生をもたらしたが、修飾mRNAは、インターフェロンα産生を大きく阻止した。5−メチルシチジンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF mRNAは、サイトカインを実質的に増加させなかったが、5−メチルシチジンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF mRNAは、IFN−α、TNF−α、およびIP10を誘導した。多数の他のサイトカインは、いずれの修飾にも影響を受けなかった。 表77.G−CSFシグナル
表78.IFN−αシグナル
実施例57.修飾mRNAの化学修飾の範囲 化学修飾5−メチルシトシンおよびシュードウリジン等であるがこれらに限定されない修飾ヌクレオチドは、哺乳動物細胞において、自然免疫応答を低下させ、RNAの発現を増加させることが示されている。驚くべきことであり、またこれまでに知られていないことには、化学修飾の量が100%未満である場合、化学修飾が呈する効果を滴定することができる。以前は、完全な修飾が、化学修飾の有益な効果を誘発するのに必要かつ十分であり、mRNAの100%未満の修飾は、効果がほとんどないと考えられていた。しかしながら、今では、化学修飾の利益が、完全に満たない修飾により誘導され得、その効果は、標的、濃度、および修飾に依存することが示された。
A.PBMCにトランスフェクトした修飾RNA 960ngの5−メチルシトシン(5mC)およびシュードウリジン(シュードU)で修飾されたG−CSF mRNAまたは未修飾G−CSF mRNAを、0.8μLのLipofectamine 2000を用いて3人の正常な血液ドナー(D1、D2、D3)からの末梢血単核細胞(PBMC)にトランスフェクトした。G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、5mCおよびシュードUで完全に修飾した(100%修飾)、5mCおよびシュードUで修飾しなかった(0%修飾)、またはmRNAが50%修飾、25%修飾、10%修飾、5%修飾、1%修飾、もしくは0.1%修飾を含有するように5mCおよびシュードUで部分的に修飾した。対照試料であるルシフェラーゼ(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5meCおよびシュードUで完全に修飾)もG−CSF発現について分析した。TNF−αおよびIFN−αの対照試料であるLipofectamine2000、LPS、R−848、ルシフェラーゼ(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5mCおよびシュードで完全に修飾)、およびP(I)P(C)も分析した。上清を、トランスフェクションの22時間後に収集してELISAを行い、タンパク質発現を判定した。G−CSFの発現を表79に示し、IFN−αおよびTNF−αの発現を表80に示す。IFN−αおよびTNF−αの発現は、G−CSF mRNAのトランスフェクションによる二次的影響であり得る。表79および80は、mRNAが完全に修飾されていない場合に、G−CSF、IFN−α、およびTNF−αの化学修飾の量を滴定することができ、滴定可能傾向は各対象で同じではないことを示す。 表79.G−CSF発現
表80.IFN−αおよびTNF−αの発現
B.HEK293にトランスフェクトした修飾RNA ヒト胎児腎臓上皮(HEK293)細胞を、100μLの細胞培養培地中、1ウェル当たり30,000細胞の密度で、96ウェルプレートに播種した。RNAiMAX(商標)(Invitrogen,Carlsbad,CA)を用いて製剤化された250ngの修飾G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、ウェルに添加した。G−CSFを、5mCおよびシュードUで完全に修飾した(100%修飾)、5mCおよびシュードUで修飾しなかった(0%修飾)、またはmRNAが75%修飾、50%修飾、もしくは25%修飾を含有するように、5mCおよびシュードUで部分的に修飾した。対照試料(AK 5/2、mCherry mRNA(mRNA配列は配列番号26169に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5mCおよびシュードUで完全に修飾)、ならびに未処理)もまた分析した。5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF mRNAの半減期は、約8〜10時間である。上清を16時間後に収集し、分泌されたタンパク質をELISAによって分析する。表81は、mRNAが完全に修飾されていない場合に、G−CSFの化学修飾の量を滴定することができることを示す。 表81.G−CSF発現
実施例58:修飾mRNA(mmRNA)のインビボ送達 修飾RNAを、C57/BL6マウスに筋肉内、皮下、または静脈内送達し、ルシフェラーゼを用いて修飾RNAの生体分布を評価した。すべての送達方法で使用した製剤緩衝液は、150mMの塩化ナトリウム、2mMの塩化カルシウム、2mMのNa+−リン酸塩(1.4mMの一塩基リン酸ナトリウムおよび0.6mMの二塩基リン酸ナトリウムを含む)、ならびに0.5mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含有し、水酸化ナトリウムを用いて最終pH6.5に達するように調節した後、濾過して滅菌した。1倍濃度を送達緩衝液として用いた。マウスに送達するリポプレックス化溶液を作製するために、1つのバイアルにおいて、50μgのRNAを室温で10分間送達緩衝液中で平衡化させ、2つ目のバイアルでは10μLのRNAiMAX(商標)を室温で10分間送達緩衝液中で平衡化させた。平衡化の後、バイアルを合わせ、100μLの最終体積に達するまで送達緩衝液を添加し、これを、次いで室温で20分間インキュベートした。ルシフェリンを、150mg/kgで各マウスに腹腔内注入(IP)で投与した後、ルシフェリン曝露曲線のプラトー期の間に撮像し、これは15〜30分間であった。ルシフェリンを作製するために、1gのD−ルシフェリンカリウムまたはナトリウム塩を、Mg2+またはCa2+を含有しない66.6mLの蒸留リン酸緩衝溶液(DPBS)中に溶解して、15mg/mLの溶液を得た。溶液を静かに混合し、0.2μmのシリンジフィルタを通した後、窒素パージを行い、アリコート化し、可能な限り光を遮断しながら−80℃で保管した。投薬の日に、温浴を用いて溶液を解凍し、ルシフェリンが溶解されていなかった場合は静かに混合し、氷上に保った。
投薬の2、8、および24時間後に、各マウスの全身画像を撮影した。組織画像および血清を、投薬の24時間後にマウスから収集した。用量を静脈内投与されたマウスは、肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、腎周囲脂肪組織、および胸腺を撮像した。用量を筋肉内または皮下投与されたマウスは、肝臓、脾臓、腎臓、肺、腎周囲脂肪組織、および注入部位の筋肉を有した。全身画像から、各投与経路および投薬レジメンについて、1秒当たりの光子数単位で生物発光を測定した。
A.筋肉内投与 マウスに、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された修飾ルシフェラーゼmRNA(ネイキッド−Luc)、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたリポプレックス化修飾ルシフェラーゼmRNA(リポプレックス−luc)(IVT cDNA配列は配列番号26177に示される;mRNA配列は 配列番号26178に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)、リポプレックス化修飾顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)(リポプレックス−サイトカイン)、または製剤緩衝液のいずれかを、各製剤について50μLの注入量で50μgの単回修飾RNA用量で右後肢に、50μLの注入量で5μgの単回修飾RNA用量で左後肢に、筋肉内(I.M.)投与した。投薬の2、8、および24時間後の各群のルシフェラーゼ発現シグナルの生物発光平均を、表82に示す。生物発光は、注入部位において、リポプレックス含有および非含有の5μgおよび50μgの修飾RNA製剤の陽性シグナルを示した。 表82.インビボ生物光子撮像(I.M.注入経路)
B.皮下投与 マウスに、修飾ルシフェラーゼmRNA(ネイキッド−Luc)、リポプレックス化修飾ルシフェラーゼmRNA(リポプレックス−luc)、リポプレックス化修飾G−CSF mRNA(リポプレックス−G−CSF)、または製剤緩衝液のいずれかを、各製剤について100μLの注入量で50μgの単回修飾mRNA用量で皮下(S.C.)投与した。投薬の2、8、および24時間後の各群のルシフェラーゼ発現シグナルの生物発光平均を、表83に示す。生物発光は、注入部位で、リポプレックス含有および非含有の5μgおよび50μgの修飾mRNA製剤の陽性シグナルを示した。 表83.インビボ生物光子撮像(S.C.注入経路)
C.静脈内投与 マウスに、修飾ルシフェラーゼmRNA(ネイキッド−Luc)、リポプレックス化修飾ルシフェラーゼmRNA(リポプレックス−luc)、リポプレックス化修飾G−CSF mRNA(リポプレックス−G−CSF)、または製剤緩衝液のいずれかを、各製剤について100μLの注入量で50μgの単回修飾mRNA用量で静脈内(I.V.)投与した。投薬の2時間後の各群からの脾臓のルシフェラーゼ発現シグナルの生物発光平均を、表84に示す。生物発光は、脾臓において、リポプレックスを含有する50μgの修飾mRNA製剤の陽性シグナルを示した。 表84.インビボ生物光子撮像(I.V.注入経路)
実施例59.緩衝液製剤研究 緩衝溶液中のG−CSF修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;N1−シュードウリジンおよび5−メチルシトシンで完全に修飾)または第IX因子修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26172に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;N1−シュードウリジンおよび5−メチルシトシンで完全に修飾)を、表85に記載されるように、50μLの注入量で、ラット1匹当たり200μgの修飾mRNA用量でラットに筋肉内投与する(n=5)。修飾mRNAは、1〜2日間水中で凍結乾燥させる。次いで、以下に列挙される緩衝液中で6mg/mLの目標濃度に再構築する。濃度は、OD 260によって判定する。試料を、投薬前に適切な緩衝液中で4mg/mLに希釈する。
修飾mRNAを沈殿させるために、pH5.5の3Mの酢酸ナトリウムおよび純粋エタノールを、それぞれ、修飾mRNAの総体積の1/10および4倍で添加する。材料を、最低1時間−80℃に置く。次いで、材料を、4000rpm、4℃で30分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを遠心分離し、75%エタノールで3回洗浄する。最後に、ペレットを緩衝液で6mg/mLの目標濃度に再構築する。濃度は、OD 260によって判定する。試料を、投薬前に適切な緩衝液中で4mg/mLに希釈する。すべての試料は、以下に明記されない限り、凍結乾燥によって調製する。 表85.緩衝液投薬群
血清試料を、種々の時間間隔でラットから採取し、G−CSFおよび第IX因子ELISAを用いてG−CSFまたは第IX因子タンパク質発現について分析する。
実施例60.複数回用量研究 スプラーグドーリーラット(n=8)に、28日間にわたり8回(週2回)静脈内注入を行う。ラットに、脂質ナノ粒子中に製剤化された0.5mg/kg、0.05mg/kg、0.005mg/kg、または0.0005mg/kgのルシフェラーゼ修飾mRNAのヒトG−CSF修飾mRNA、生理食塩水中の0.5mg/kgのヒトG−CSF修飾mRNA、脂質ナノ粒子中に製剤化された0.2mg/kgのヒトG−CSFタンパク質Neupogenまたは翻訳可能でないヒトG−CSF修飾mRNAを、注入する。血清を、既定の時間間隔で採取して、G−CSFタンパク質発現(その週の1回目の投薬の8、24、および72時間後)、全血球数および白血球数(その週の1回目の投薬の24および72時間後)、ならびに臨床化学(その週の1回目の投薬の24および72時間後)を評価する。ラットを、最後の投薬の4日後である29日目に屠殺して、全血球数、白血球数、臨床科学、タンパク質発現を評価し、組織病理学および解剖により主要器官への作用を評価する。さらに、29日目に、マウスに抗体アッセイを行った。
実施例61.LNPインビボ研究 ルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾を、シリンジポンプ法を用いて脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化した。LNPを、最終的な脂質のモル比50:10:38.5:1.5(DLin−KC2−DMA:DSPC:コレステロール:PEG−DMG)で、総脂質と修飾mRNAの重量比20:1で製剤化した。表86に示されるように、ルシフェラーゼLNP製剤を、粒径、ゼータ電位、およびカプセル封入によって特徴付けた。 表86.ルシフェラーゼ製剤
表87に概要説明されるように、ルシフェラーゼLNP製剤を、Balb−Cマウス(n=3)に筋肉内、静脈内、および皮下投与し、PBS中に製剤化されたルシフェラーゼ修飾RNAを、マウスに静脈内投与した。 表87.ルシフェラーゼ製剤
ルシフェラーゼLNP製剤を静脈内および筋肉内投与したマウスを、2、8、24、48、120、および192時間で撮像し、ルシフェラーゼLNP製剤を皮下投与したマウスを、2、8、24、48、および120時間で撮像して、表88に示されるルシフェラーゼ発現を判定した。表88において、「NT」は未試験を意味する。撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。 表88.ルシフェラーゼ発現
LNP製剤を静脈内投与した1匹のマウスを、8時間で屠殺し、肝臓および脾臓におけるルシフェラーゼ発現を判定した。さらに、LNP製剤を筋肉内投与した1匹のマウスを、8時間で屠殺して、注入部位周辺の筋肉ならびに肝臓および膵臓におけるルシフェラーゼ発現を判定する。表89に示されるように、静脈内および筋肉内投与後の肝臓および脾臓の両方、ならびに筋肉内注入部位周辺の筋肉に、発現が見られた。 表89.組織のルシフェラーゼ発現
実施例62.サイトカイン研究:PBMC A.PBMCの単離および培養 2人のドナーに由来する50mLのヒト血液を、ヘパリンナトリウム管で、Research Blood Components(ロットKP30928およびKP30931)から受容した。各ドナーについて、血液をプールし、DPBS(SAFC Bioscience 59331C、ロット071M8408)で70mLに希釈し、2つの50mLの円錐管に等分した。10mLのFicoll Paque(GE Healthcare 17−5442−03、ロット10074400)を、血液層の下に静かに分注した。管を2000rpmで30分間、低加速および制動で遠心分離した。管を除去し、軟膜PBMC層を、新しい50mLの円錐管に静かに移し、DPBSで洗浄した。管を1450rpmで10分間遠心分離した。
上清を吸引し、PBMCペレットを50mLのDPBS中に再懸濁させ、洗浄した。管を1250rpmで10分間遠心分離した。この洗浄ステップを繰り返し、PBMCペレットを19mLのOptimem I(Gibco 11058、ロット1072088)中に再懸濁させ、計数した。細胞懸濁液を3.0×10^6細胞/mLの濃度の生細胞に調節した。
次いで、これらの細胞を、1ウェル当たり50μLで1人のドナーにつき5つの96ウェル組織培養処理丸底プレート(Costar 3799)に播種した。30分以内に、トランスフェクション混合物を1ウェル当たり50μLの量で各ウェルに添加した。トランスフェクションの4時間後、培地に10μLのウシ胎児血清(Gibco 10082、ロット1012368)を補充した。
B.トランスフェクション調製物 ヒトG−CSFをコードする修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)((1)天然のNTP、(2)5−メチルシチジンおよびシュードウリジンでの100%置換、または(3)5−メチルシチジンおよびN1−メチル−シュードウリジンでの100%置換のいずれかを含有、ルシフェラーゼをコードするmRNA(IVT cDNA配列は配列番号26177に示される;mRNA配列は配列番号26178に示される、約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1、各シトシンにおける5−メチルシトシンおよび各ウリジン部位におけるシュードウリジン置換で完全に修飾)((1)天然のNTPまたは(2)5−メチルシチジンおよびシュードウリジンで100%置換のいずれかを含有)、ならびにTLRアゴニストR848(Invivogen tlrl−r848)を、最終体積2500μLのOptimem I中、38.4ng/μLに希釈した。
別個に、110μLのLipofectamine 2000(Invitrogen 11668−027、ロット1070962)を、6.76mLのOptimem Iで希釈した。96ウェルプレートにおいて、各mRNA、陽性対照(R−848)、または陰性対照(Optimem I)の9個の135μLアリコートを、135μLの希釈Lipofectamine 2000に添加した。トランスフェクトされる物質を含有するプレートを20分間インキュベートした。次いで、トランスフェクション混合物を、1ウェル当たり50μLでそれぞれのヒトPBMCに移した。その後、プレートを37℃でインキュベートした。2、4、8、20、および44時間で、各プレートをインキュベーターから取り出し、上清を凍結させた。
最後のプレートを取り出した後、上清を、ヒトG−CSF ELISAキット(Invitrogen KHC2032)およびヒトIFN−α ELISAキット(Thermo Scientific 41105−2)を用いてアッセイした。各条件は、二重に行われた。
C.タンパク質および自然免疫応答分析 コードされたタンパク質を産生する未修飾および修飾mRNAの能力を経時的に評価し(G−CSF産生)、インターフェロンα産生により測定される自然免疫認識を引き起こすmRNAの能力も同様に評価した。インビトロPBMC培養物の使用は、オリゴヌクレオチドの免疫刺激能を測定する一般的な方法である(Robbins et al.,Oligonucleotides 2009 19:89−102)。
結果を、4パラメータのロジスティック曲線適合を用いて、各ELISAプレートの標準曲線に対して補間した。特異的ELISAによって測定される経時的なG−CSF、インターフェロンα(IFN−α)、および腫瘍壊死因子α(TNF−α)産生の3人の別個のPBMCドナーの平均を表90および91に示す。
G−CSF ELISAでは、Lipofectamine 2000(LF2000)未処理条件によるバックグラウンドシグナルを、各時点で差し引いた。データは、ヒト末梢血単核によるヒトG−CSFタンパク質の特異的産生が、天然のNTP、5−メチルシチジンおよびシュードウリジンでの100%置換、または5−メチルシチジンおよびN1−メチル−シュードウリジンでの100%置換を含有するG−CSF mRNAで見られることを示した。G−CSFの産生は、5−メチルシチジンおよびN1−メチル−シュードウリジン修飾mRNAの使用により、5−メチルシチジンおよびシュードウリジン修飾mRNAと比較して有意に増加した。
自然免疫認識に関して、いずれの修飾mRNAの化学組成も、陽性対照(R848、p(I)p(C))と比較してIFN−αおよびTNF−α産生を大幅に阻止したが、化学組成間の有意差は存在した。5−メチルシチジンおよびシュードウリジン修飾mRNAは、低いが検出可能なレベルのIFN−αおよびTNF−α産生をもたらしたが、一方で5−メチルシチジンおよびN1−メチル−シュードウリジン修飾mRNAは、検出可能なIFN−αおよびTNF−α産生をもたらさなかった。
結果として、自然免疫応答の活性化の1つを上回るサイトカインマーカーを考察する必要性に加えて、意外にも修飾の組み合わせにより異なるレベルの細胞応答(タンパク質産生および免疫活性化)がもたらされることが見出されたことが断定されている。修飾、すなわちN1−メチル−シュードウリジンは、この研究において、標準的な5−メチルシチジン/シュードウリジンの組み合わせよりも強化された保護をもたらし、結果として2倍多いタンパク質およびほぼ150倍の免疫応答の低減(TNF−α)をもたらしことが示された。
PBMCが多数の自然免疫RNA認識センサを含有し、さらにタンパク質翻訳が可能であることを考えると、これは、これらの2つの経路の相互依存性を試験するのに有用な系を提供する。mRNA翻訳はそのような自然免疫経路の活性化によって悪影響を受ける可能性があることが既知である(Kariko et al.Immunity(2005)23:165−175、Warren et al.Cell Stem Cell(2010)7:618−630)。PBMCをインビトロアッセイ系として使用することで、翻訳(この場合、G−CSFタンパク質産生)とサイトカイン産生(この場合、IFN−αおよびTNF−αのタンパク質産生に例示される)との間の相関性を確立することが可能である。より良好なタンパク質産生は、より低い自然免疫活性化経路の誘導と相関しており、新たな化学組成を、この比率に基づいて有利に判断することができる(表92)。
この研究において、いずれも5−メチルシトシンを伴う、シュードウリジンおよびN1−メチル−シュードウリジンという2つの化学修飾のPC比は、サイトカインIFN−αの9944/1=9944と比較して、4742/141=34であった。サイトカインTNF−αについては、2つの化学組成は、153および1243のPC比を有し、それぞれ、いずれのサイトカインについても、N1−メチル−シュードウリジンが、より優れた修飾であることを示唆する。表90および91において、「NT」は未試験を意味する。 表90.G−CSF
表91.IFN−αおよびTNF−α
表92.G−CSFとサイトカインの比率
実施例63.インビトロPBMC研究:修飾パーセント 480ngの5−メチルシトシン(5mC)およびシュードウリジン(シュードU)で修飾したG−CSF mRNAまたは未修飾G−CSF mRNAを、0.4μLのLipofectamine 2000を用いて正常な血液ドナー(D1、D2、およびD3)からの末梢血単核細胞(PBMC)にトランスフェクトした。G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、5mCおよびシュードUで完全に修飾した(100%修飾)、5mCおよびシュードUで修飾しなかった(0%修飾)、またはmRNAが75%修飾、50%修飾、もしくは25%修飾を含有するように5mCおよびシュードUで部分的に修飾した。対照試料であるルシフェラーゼ(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5meCおよびシュードUで完全に修飾)もG−CSF発現について分析した。TNF−αおよびIFN−αの対照試料であるLipofectamine2000、LPS、R−848、ルシフェラーゼ(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5mCおよびシュードで完全に修飾)、およびP(I)P(C)も分析した。上清を、トランスフェクションの22時間後に収集してELISAを行い、タンパク質発現を判定した。G−CSFの発現を表93に示し、IFN−αおよびTNF−αの発現を表94に示す。IFN−αおよびTNF−αの発現は、G−CSF mRNAのトランスフェクションによる二次的影響であり得る。表93および94は、mRNAが完全に修飾されていない場合に、G−CSF、インターフェロンα(IFN−α)、および腫瘍壊死因子α(TNF−α)の化学修飾の量を滴定することができ、滴定可能傾向は、各対象で同じではないことを示す。
PBMCをインビトロアッセイ系として使用することにより、翻訳(この場合、G−CSF タンパク質産生)とサイトカイン産生(この場合、IFN−αタンパク質産生に例示される)との間の相関性を確立することが可能である。より良好なンパク質産生は、より低い自然免疫活性化経路の誘導と相関しており、化学組成の修飾率は、この比率に基づいて有利に判断することができる(表95)。表93および94から計算され、表95に示されるように、5−メチルシチジンおよびシュードウリジンでの完全な修飾は、いずれの修飾も有さないもの(天然G−CSF mRNA)よりも良好なタンパク質/サイトカイン産生比を示す(IFN−αについては100倍、およびTNF−αについては27倍)。部分的修飾は、修飾がより少なくなるにつれてより低いタンパク質/サイトカイン比がもたらされる、線形関係を示す。 表93.G−CSF発現
表94.IFN−αおよびTNF−αの発現
表95.PC比および修飾率の影響
実施例64.PBMCにトランスフェクトした修飾RNA 500ngの5−メチルシトシン(5mC)およびシュードウリジン(シュードU)で修飾したG−CSF mRNAまたは未修飾G−CSF mRNAを、0.4μLのLipofectamine 2000を用いて正常な血液ドナー(D1、D2、およびD3)からの末梢血単核細胞(PBMC)にトランスフェクトした。G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、5mCおよびシュードUで完全に修飾した(100%修飾)、5mCおよびシュードUで修飾しなかった(0%修飾)、またはmRNAが50%修飾、25%修飾、10%修飾、5%修飾、1%修飾、もしくは0.1%修飾を含有するように5mCおよびシュードUで部分的に修飾した。対照試料であるmCherry(mRNA配列は配列番号26169に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5meCおよびシュードウリジンで完全に修飾)、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF(対照G−CSF)、ならびに未処理対照も、G−CSF、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、およびインターフェロンα(IFN−α)の発現について分析した。上清を、トランスフェクションの6時間後および18時間後に収集し、ELISAを実行してタンパク質発現を判定した。ドナー1のG−CSF、IFN−α、およびTNF−αの発現を表96に示し、ドナー2を表97に示し、ドナー3を表98に示す。
5−メチルシチジンおよびシュードウリジンでの完全な100%修飾は、3人すべてのヒトPBMCドナーにわたり、最も高いタンパク質翻訳(G−CSF)および産生される最も少ない量のサイトカインをもたらした。修飾の量を減少させることにより、より高いサイトカイン産生(IFN−αおよびTNF−α)がもたらされ、したがって、サイトカインを減少させ、タンパク質翻訳を向上させるためには、(本明細書においてG−CSF産生により証明されるように)完全な修飾が重要であることがさらに強調される。 表96.ドナー1
表97.ドナー2
表98.ドナー3
実施例65.BJ線維芽細胞における自然免疫応答研究 A.単一のトランスフェクション ヒト初代包皮線維芽細胞(BJ線維芽細胞)を、American Type Culture Collection(ATCC)(カタログ番号CRL−2522)から入手し、5%CO2下、37℃で、10%ウシ胎児血清を補充したイーグル最小必須培地(ATCC、カタログ番号30−2003)において増殖させた。BJ線維芽細胞を、0.5mLの培養培地中、1ウェル当たり300,000の細胞密度で24ウェルプレートに播種した。キャップ0を有するか、キャップ1を有するか、またはキャップを有さない5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された(Gen1)か、あるいは5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された(Gen2)、250ngの修飾G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、製造業者のプロトコルに従ってLipofectamine 2000(Invitrogen、カタログ番号11668−019)を用いてトランスフェクトした。対照試料であるポリI:C(PIC)、Lipofectamine 2000(Lipo)、天然ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)、および天然G−CSF mRNAもトランスフェクトした。細胞を18時間後に収集し、全RNAを単離し、製造業者のプロトコルに従ってRNeasyマイクロキット(カタログ番号74004)を用いてDNASE(登録商標)処理した。100ngの全RNAを、製造業者のプロトコルに従ってHigh Capacity cDNA Reverse Transcriptionキット(カタログ番号4368814)を用いてcDNA合成に使用した。次いで、cDNAを、製造業者のプロトコルに従ってBiorad CFX 384機器においてSybrGreenを用いた定量的リアルタイムPCRによって自然免疫応答遺伝子の発現について分析した。表99は、ハウスキーピング遺伝子HPRT(ヒポキサンチンホスホリボシトランスフェラーゼ(hypoxanthine phosphoribosytransferase))と比較した自然免疫応答転写物の発現レベルを示し、これは、HPRTと比較した倍誘導として表される。この表で、標準的測定基準のパネルには、次のものが含まれる:RIG−Iはレチノイン酸誘導遺伝子1であり、IL6はインターロイキン−6であり、OAS−1はオリゴアデニル酸シンターゼ1であり、IFNbはインターフェロンβであり、AIM2はメラノーマ−2の不在であり、IFIT−1はテトラリコペプチド反復を有するインターフェロン誘導型タンパク質1であり、PKRはタンパク質キナーゼRであり、TNFaは腫瘍壊死因子αであり、IFNaはインターフェロンαである。 表99.自然免疫応答転写物レベル
B.反復トランスフェクション ヒト初代包皮線維芽細胞(BJ線維芽細胞)を、American Type Culture Collection(ATCC)(カタログ番号CRL−2522)から入手し、5%CO2下、37℃で、10%ウシ胎児血清を補充したイーグル最小必須培地(ATCC、カタログ番号30−2003)において増殖させた。BJ線維芽細胞を、0.5mLの培養培地中、1ウェル当たり300,000の細胞密度で24ウェルプレートに播種した。未修飾、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された(Gen1)、または5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された(Gen2)、250ngの修飾G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、製造業者のプロトコルに従って5日間毎日トランスフェクトした。対照試料であるLipofectamine 2000(L2000)およびmCherry mRNA(mRNA配列は配列番号26169に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシチジンおよびシュードウリジンで完全に修飾)も5日間毎日トランスフェクトした。結果を表100に示す。
未修飾mRNAは、1日以降にインターフェロンβ(IFN−β)およびインターロイキン−6(IL−6)においてサイトカイン応答を示した。少なくともシュードウリジンで修飾されたmRNAは、2〜3日以降にサイトカイン応答を示したが、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで修飾されたmRNAは、3〜5日以降に応答の低減を示した。 表100.サイトカイン応答
実施例66.自然免疫応答のインビボ検出 インビボタンパク質産生およびインビボサイトカイン応答に対するmRNAの様々な化学修飾の重要性を区別する目的で、雌BALB/Cマウス(n=5)に、5’キャップがキャップ1であるG−CSF mRNA(G−CSF mRNA未修飾)(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない)、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF mRNA(G−CSF mRNA 5mc/pU)、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された5’キャップありのG−CSF mRNA(G−CSF mRNA 5mc/N1pU)もしくは5’キャップなしのG−CSF mRNA(G−CSF mRNA 5mc/N1 pUキャップなし)、またはR848もしくは5%ショ糖のいずれかである対照を、表101に記載されるように、筋肉内注入する。 表101.投薬表
血液を、投薬の8時間後に採取する。ELISAを用いて、G−CSF、TNF−α、およびIFN−αのタンパク質レベルをELISAにより判定する。投薬の8時間後に、筋肉を注射部位から採取し、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(QPCR)を用いて、筋肉内のRIG−I、PKR、AIM−2、IFIT−1、OAS−2、MDA−5、IFN−β、TNF−α、IL−6、G−CSF、CD45のmRNAレベルを判定する。
実施例67.自然免疫応答のインビボ検出研究 雌BALB/Cマウス(n=5)に、5’キャップがキャップ1であるG−CSF mRNA(G−CSF mRNA未修飾)(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない)、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF mRNA(G−CSF mRNA 5mc/pU)、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された5’キャップを有するG−CSF mRNA(G−CSF mRNA 5mc/N1pU)もしくは5’キャップなしのG−CSF mRNA(G−CSF mRNA 5mc/N1 pUキャップなし)、またはR848もしくは5%ショ糖のいずれかである対照を、表102に記載されるように、筋肉内注入した。血液を投薬の8時間後に採取し、ELISAを用いてG−CSFおよびインターフェロン−α(IFN−α)のタンパク質レベルをELISAによって判定し、表102に示す。
表102に示されるように、未修飾、5mc/pU、および5mc/N1pU修飾のG−CSF mRNAは、マウス血清におけるヒトG−CSF発現をもたらした。キャップなしの5mC/N1pU修飾G−CSF mRNAは血清中にヒトG−CSF発現を示さず、5’キャップ構造を有することがタンパク質翻訳に重要であることを協調する。
予測した通り、R848、5%ショ糖のみ、および未処理の群ではヒトG−CSFタンパク質は発現しなかった。重要なことに、血清中のマウスIFN−αによって測定されるサイトカイン産生に有意差が見られた。予測した通り、未修飾G−CSF mRNAは、インビボで強固なサイトカイン応答を示した(R848陽性対照よりも高い)。5mc/pUの未修飾G−CSF mRNAは、インビボで低いが検出可能なサイトカイン応答を示したが、5mc/N1pU修飾mRNAは、血清中に検出可能なIFN−αを示さなかった(ビヒクルおよび未処理動物も同じであった)。
さらに、5mc/N1pU修飾mRNAの応答は、キャップを有するかどうかにかかわらず、同じであった。これらのインビボ結果は、1)未修飾mRNAが強固な自然免疫応答を生成すること、2)これは、5mc/pU修飾の100%組み込みにより低減されるが、廃止されないこと、および3)5mc/N1pU修飾の組み込みは、検出可能なサイトカイン応答をもたらさないこと、という結論を強める。
最後に、これらの注入が5%ショ糖(それ自体は作用を全く有さない)においてであることを考えると、これらの結果は、これらの修飾の免疫刺激能を正確に反映しているはずである。
このデータから、N1pU修飾分子は、より多くのタンパク質を産生するが、IFN−α発現に対する作用をほとんど有さないか、または全く有さないことが明らかである。この化学修飾については、キャッピングがタンパク質産生に必要であることもまた明らかである。未修飾mRNAのPC比(PC=9)と比較して748のタンパク質:サイトカイン比は、この化学修飾が、IFN−αに関連する作用または生物学的意義に関して、はるかに優れていることを意味する。 表102.血清中のヒトG−CSFおよびマウスIFN−α
実施例68:修飾RNAのインビボ送達 修飾mRNAのタンパク質産生を、修飾G−CSF mRNAまたは修飾第IX因子mRNAを雌スプラーグドーリーラット(n=6)に送達することによって評価した。ラットに、5%ショ糖中の凍結乾燥形態から再構築した、100μL中400μgの5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)(G−CSF Gen1)、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF mRNA(G−CSF Gen2)、または5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された第IX因子mRNA(mRNA配列は配列番号26172に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)(第IX因子Gen1)を注入した。血液を注入の8時間後に採取し、血清中のG−CSFタンパク質レベルをELISAによって測定した。表103は、8時間後の血清中のG−CSFタンパク質レベルを示す。
これらの結果は、G−CSF Gen1およびG−CSF Gen2修飾mRNAの両方が、単回筋肉内注入後にラットにおいてヒトG−CSFタンパク質をもたらし得ること、ならびにヒトG−CSFタンパク質産生が、Gen1化学組成よりもGen2化学組成を使用した場合に向上することを示す。 表103.ラット血清におけるG−CSFタンパク質(I.M.注入経路)
実施例69.化学修飾:インビトロ研究 A.PBMCにおけるインビトロスクリーニング 表104および105に概要説明される化学修飾で完全に修飾された、500ngのG−CSF(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)mRNAを、0.4μLのLipofectamine 2000を用いて3人の正常な血液ドナーからの末梢血単核細胞(PBMC)にトランスフェクトした。対照試料であるLPS、R848、P(I)P(C)、およびmCherry(mRNA配列は配列番号26169に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない、5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)もまた分析した。上清を収集し、G−CSFタンパク質発現、ならびにサイトカインインターフェロンα(IFN−α)および腫瘍壊死因子α(TNF−α)の誘導を判定するためにELISAによって分析するまで凍結保存した。G−CSFのタンパク質発現を表104に示し、IFN−αおよびTNF−αの発現を表105に示す。
表104のデータは、すべてではないが多くの化学修飾が、PBMCでのヒトG−CSFの生産的生成に使用可能であることを示す。注目すべきことに、100%のN1−メチル−シュードウリジン置換が、最も高いレベルのヒトG−CSF産生(シュードウリジン自体よりもほぼ10倍高い)を示す。N1−メチル−シュードウリジンを、5−メチルシチジンと組み合わせて用いることでも、高いレベルのヒトG−CSFタンパク質が産生される(これもシュードウリジンを5メチルシチジンと組み合わせた場合よりも高い)。
PBMCにおけるタンパク質産生とサイトカインとの逆相関を考慮すると、同様の傾向が表105においても確認され、ここで、N1−メチル−シュードウリジンでの100%置換は、サイトカイン誘導を全くもたらさず(トランスフェクションのみの対照に類似)、シュードウリジンは、バックグラウンドよりも高い検出可能なサイトカイン誘導を見せる。
N6−メチルアデノシンおよびα−チオシチジン等の他の修飾は、サイトカイン刺激を増加させるようである。 表104.化学修飾およびG−CSFタンパク質発現
表105.化学修飾およびサイトカイン発現
B.HeLa細胞におけるインビトロスクリーニング トランスフェクションの前日に、20,000のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を、5%CO2雰囲気下で一晩、37oGで成長させた。翌日、表106に記載の化学修飾を有する83ngのルシフェラーゼ修飾RNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。
Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、0.2μLを、10μLの最終体積のOPTI−MEM中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加し、室温でインキュベートした。
18〜22時間のインキュベーションの後、ルシフェラーゼを発現する細胞を、製造業者の指示に従って100μLのPassive Lysis Buffer(Promega,Madison,WI)で溶解した。ライセートのアリコートを白色不透明ポリスチレン96ウェルプレート(Corning,Manassas,VA)に移し、100μLの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液(Promega,Madison,WI)と合わせた。ライセートの体積を、最も強いシグナルを生成する試料について1ウェル当たり2百万を超える相対発光量(RLU)が検出されなくなるまで調節または希釈し、試験した各化学組成を、表106に示す。プレートリーダーは、BioTek Synergy H1(BioTek,Winooski,VT)であった。試薬を用いないプレートのバックグラウンドシグナルは、1ウェル当たり約200の相対発光量であった。
これらの結果は、すべてではないが多くの化学修飾が、HeLa細胞でのヒトG−CSFの生産的生成に使用可能であることを示す。注目すべきことに、100%のN1−メチル−シュードウリジン置換が、最も高いレベルのヒトG−CSF産生を示す。 表106.ルシフェラーゼの相対発光量
C.ウサギ網状赤血球ライセートにおけるインビトロスクリーニング ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、表107に列挙される化学修飾で修飾し、滅菌のヌクレアーゼ不含水中で10μL中250ngの最終量に希釈した。希釈したルシフェラーゼを、40μLの新たに調製したウサギ網状赤血球ライセートに添加し、インビトロ翻訳反応を、乾式加熱ブロックにおいて30℃で標準的な1.5mLのポリプロピレン反応管(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)中で行った。翻訳アッセイを、製造業者の指示に従ってRabbit Reticulocyte Lysate(ヌクレアーゼ処理)キット(Promega,Madison,WI)を用いて行った。反応緩衝液に、提供されたロイシンまたはメチオニンのいずれかが欠けたアミノ酸ストック溶液の1対1混合物を補充し、結果的に両方のアミノ酸を十分な量で含有する反応混合物が効果的なインビトロ翻訳を行えるようにした。
60分間のインキュベーションの後、反応管を氷上に置くことによって反応を停止させた。ルシフェラーゼ修飾RNAを含有するインビトロ翻訳反応物のアリコートを、白色不透明ポリスチレン96ウェルプレート(Corning,Manassas,VA)に移し、100μLの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液(Promega,Madison,WI)と合わせた。インビトロ翻訳反応物の体積を、最も強いシグナルを生成する試料について1ウェル当たり2百万を超える相対発光量(RLU)が検出されなくなるまで調節または希釈し、試験した各化学組成のRLUを表107に示す。プレートリーダーはBioTek Synergy H1(BioTek,Winooski,VT)であった。試薬を用いないプレートのバックグラウンドシグナルは、1ウェル当たり約200の相対発光量であった。
これらの細胞不含翻訳の結果は、HeLa細胞におけるタンパク質産生結果と非常によく相関し、同じ修飾が通常いずれの系においても機能するかまたは機能しない。1つの注目すべき例外は、5−ホルミルシチジン修飾ルシフェラーゼmRNAであり、これは、細胞不含翻訳系では機能したが、HeLa細胞に基づくトランスフェクション系では機能しなかった。2つのアッセイ間の同様の差が、5−ホルミルシチジン修飾G−CSF mRNAでも見られた。 表107.ルシフェラーゼの相対発光量
実施例70.化学修飾:インビボ研究 A.G−CSF修飾mRNAのインビボスクリーニング Balb−Cマウス(n=4)に、表108に概要説明される化学修飾で完全に修飾された、1倍PBS中に製剤化された修飾G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、各脚に筋肉内注入する。対照であるルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;シュードウリジンおよび5−メチルシトシンで完全に修飾)およびPBS対照もまた試験する。8時間後に血清を採取して、ELISAによりG−CSFタンパク質レベル、サイトカインレベルを判する。 表108.G−CSF
B.ルシフェラーゼ修飾mRNAのインビボスクリーニング Balb−Cマウス(n=4)に、表109に概説される化学修飾で完全に修飾された、1倍PBS中に製剤化された42〜103μgの修飾ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を含有する200μLを皮下注入した。PBS対照もまた試験した。修飾ルシフェラーゼmRNAの投薬量も表109に概略説明する。投薬の8時間後に、マウスを撮像してルシフェラーゼ発現を判定した。撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。
表109に示されるように、2’−フルオロウリジンを例外として、すべてのルシフェラーゼmRNA修飾化学組成がインビボ活性を示した。さらに、1−メチルシュードウリジン修飾mRNAは、非常に高いルシフェラーゼ発現を示した(シュードウリジン含有mRNAよりも5倍高い発現)。 表109.ルシフェラーゼスクリーニング
実施例71.組み合わせルシフェラーゼ修飾mRNAのインビボスクリーニング Balb−Cマウス(n=4)に、表110に概要説明される化学修飾で完全に修飾された、1倍PBS中に製剤化された100μgの修飾ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を200μL皮下注入した。PBS対照もまた試験した。投薬の8時間後に、マウスを撮像してルシフェラーゼ発現を判定した。撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。
表110に示されるように、すべてのルシフェラーゼmRNA修飾化学組成(組み合わせで)が、インビボ活性を示した。さらに、修飾mRNA(N4−アセチルシチジンまたは5メチルシチジンを有する)におけるN1−メチル−シュードウリジンの存在は、シュードウリジンを有するものを用いて試験した同じ組み合わせよりも高い発現を示した。総合すると、これらのデータは、N1−メチル−シュードウリジン含有ルシフェラーゼmRNAが、単独で使用される(表109)か、または他の修飾ヌクレオチドと組み合わせて使用される(表110)かにかかわらず、インビボでのタンパク質発現の向上をもたらすことを示す。 表110.ルシフェラーゼスクリーニングの組み合わせ
実施例72.BJ線維芽細胞における自然免疫応答 ヒト初代包皮線維芽細胞(BJ線維芽細胞)を、American Type Culture Collection(ATCC)(カタログ番号CRL−2522)から入手し、5%CO2下において37℃で10%ウシ胎児血清を補充したイーグル最小必須培地(ATCC、カタログ番号30−2003)で成長させる。BJ線維芽細胞を、0.5mLの培養培地中、1ウェル当たり130,000の細胞密度で24ウェルプレートに播種する。5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された(Gen1)か、または5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された(Gen2)、250ngの修飾G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、製造業者のプロトコルに従ってLipofectamine 2000(Invitrogen、カタログ番号11668−019)を用いてトランスフェクトする。対照試料であるLipofectamine 2000および未修飾G−CSF mRNA(天然のG−CSF)もトランスフェクトする。細胞は、5日間連続でトランスフェクトする。トランスフェクション複合体を、各回のトランスフェクションの4時間に取り出す。
培養上清を、製造業者のプロトコルに従って毎日ELISAによりトランスフェクション後に、分泌されたG−CSF(R&D Systems、カタログDCS50)、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、およびインターフェロンα(IFN−αについてアッセイする。細胞を、初回トランスフェクションの6時間および18時間後に、ならびにその後は1日おきに、CELL TITER GLO(登録商標)(Promega、カタログ番号G7570)用いて生存率について分析する。収集した細胞と同時に、全RNAを単離し、製造業者のプロトコルに従ってRNAEASYマイクロキット(カタログ番号74004)を用いてDNASE(登録商標)で処理する。100ngの全RNAを、製造業者のプロトコルに従ってHigh Capacity cDNA Reverse Transcriptionキット(Applied Biosystems、カタログ番号4368814)を用いてcDNA合成に使用する。次いで、cDNAを、製造業者のプロトコルに従ってBiorad CFX 384機器においてSybrGreenを用いて定量的リアルタイムPCRによって自然免疫応答遺伝子の発現について分析する。
実施例73.野生型T7ポリメラーゼによるインビトロ転写 ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)およびG−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、前述のように野生型T7ポリメラーゼを用いて表111〜114に列挙される異なる化学組成および化学組成の組み合わせで完全に修飾した。
翻訳反応物質の収率を、分光光度測定(spectrophometric measurement)(OD260)によって判定し、ルシフェラーゼの収率を表111に示し、G−CSFを表113に示す。
ルシフェラーゼおよびG−CSF修飾mRNAを酵素キャッピング反応に供し、各修飾mRNAのキャッピング反応を分光光度測定(OD260)により収量を評価し、正確な大きさを、バイオアナライザーを用いて評価した。ルシフェラーゼのキャッピング反応による収率を表112に示し、G−CSFは表114に示す。 表111.ルシフェラーゼのインビトロ転写化学組成
表112.ルシフェラーゼ修飾mRNAのキャッピング化学組成および収量
表113.G−CSF修飾mRNAのインビトロ転写化学組成および収量
表114.G−CSF修飾mRNAのキャッピング化学組成および収量
実施例74.変異体T7ポリメラーゼによるインビトロ転写 ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)およびG−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、変異体T7ポリメラーゼ(Durascribe(登録商標)T7 Transcriptionキット(カタログ番号DS010925)(Epicentre(登録商標),Madison,WI)を用いて表115〜118に列挙される異なる化学組成および化学組成の組み合わせで完全に修飾した。
翻訳反応物質の収率を、分光光度測定(OD260)によって判定し、ルシフェラーゼの収量を表115に示し、G−CSFを表117に示す。
ルシフェラーゼおよびG−CSF修飾mRNAを酵素キャッピング反応に供し、各修飾mRNAのキャッピング反応を分光光度測定(OD260)により収量を評価し、正確な大きさを、バイオアナライザーを用いて評価した。ルシフェラーゼのキャッピング反応による収量を表116に示し、G−CSFを表118に示す。 表115.ルシフェラーゼ修飾mRNAのインビトロ転写化学組成および収量
表116.ルシフェラーゼ修飾mRNAのキャッピング化学組成および収量
表117.G−CSF修飾mRNAインビトロ転写化学組成および収量
表118.G−CSF修飾mRNAのキャッピング化学組成および収量
実施例75.2’O−メチルおよび2’フルオロ化合物 ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、表119の化学組成で完全に修飾された形態として生成し、変異体T7ポリメラーゼ(Durascribe(登録商標)T7 Transcriptionキット(カタログ番号DS010925)(Epicentre(登録商標),Madison,WI)を用いて転写した。2’フルオロ含有mRNAをDurascribe T7を用いて作製したが、2’Oメチル含有mRNAはDurascribe T7を用いて転写することができなかった。
2’Oメチル修飾mRNAの組み込みは、他の変異体T7ポリメラーゼを用いて達成することが可能であり得る(それぞれの内容が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、Nat Biotechnol.(2004)22:1155−1160、Nucleic Acids Res.(2002)30:e138)、または米国特許第7,309,570号)。あるいは、2’OMe修飾は、酵素的手段を用いて転写後に導入することができる。
糖の2’基への修飾の導入は、多数の潜在的利点を有する。2’フルオロ置換のような2’OMe置換は、ヌクレアーゼから保護することが既知であり、また、siRNAおよびアンチセンスといった他の核酸に組み込まれると、自然免疫認識を廃止することが示されている(その全体が組み込まれる、Crooke,ed.Antisense Drug Technology,2nd edition;Boca Raton:CRC press)。
次いで、2’フルオロ修飾mRNAをHeLa細胞にトランスフェクトして、細胞環境におけるタンパク質産生を評価し、同じmRNAを細胞不含ウサギ網状赤血球系においても評価した。未修飾ルシフェラーゼ(天然ルシフェラーゼ)対照を、両方の転写実験に使用し、未処理または擬似トランスフェクト(Lipofectamine 2000単独)対照もHeLaトランスフェクションについて評価し、RNAなしの対照をウサギ網状ライセート(reticulysate)について分析した。
HeLaトランスフェクション実験については、トランスフェクションの前日に、20,000のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を、5%CO2雰囲気下で一晩、37oGで成長させた。翌日、表119に記載の化学修飾を有する83ngの2’フルオロ含有ルシフェラーゼ修飾RNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、0.2μLを、10μLの最終体積のOPTI−MEM中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加し、室温でインキュベートした。18〜22時間のインキュベーションの後、ルシフェラーゼを発現する細胞を、製造業者の指示に従って100μLのPassive Lysis Buffer(Promega,Madison,WI)で溶解した。ライセートのアリコートを白色不透明ポリスチレン96ウェルプレート(Corning,Manassas,VA)に移し、100μLの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液(Promega,Madison,WI)と合わせた。ライセートの体積を、最も強いシグナルを生成する試料について1ウェル当たり2百万を超える発光量が検出されなくなるまで調節または希釈し、試験した各化学組成についてのRLUを表119に示す。プレートリーダーはBioTek Synergy H1(BioTek,Winooski,VT)であった。試薬を用いないプレートのバックグラウンドシグナルは、1ウェル当たり約200の相対発光量であった。
ウサギ網状赤血球ライセートアッセイについては、2’−フルオロ含有ルシフェラーゼmRNAを、滅菌のヌクレアーゼ不含水中で10μL中250ngの最終量に希釈し、40μLの新たに調製したウサギ網状赤血球ライセートに添加し、インビトロ翻訳反応を、乾式加熱ブロックにおいて30℃で標準的な1.5mLのポリプロピレン反応管(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)中で行った。翻訳アッセイを、製造業者の指示に従ってRabbit Reticulocyte Lysate(ヌクレアーゼ処理)キット(Promega,Madison,WI)を用いて行った。反応緩衝液に、提供されたロイシンまたはメチオニンのいずれかが欠けたアミノ酸ストック溶液の1対1混合物を補充し、結果的に両方のアミノ酸を十分な量で含有する反応混合物が効果的なインビトロ翻訳を行えるようにした。60分間のインキュベーションの後、反応管を氷上に置くことによって反応を停止させた。
ルシフェラーゼ修飾RNAを含有するインビトロ翻訳反応物のアリコートを、白色不透明ポリスチレン96−ウェルプレート(Corning,Manassas,VA)に移し、100μLの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液(Promega,Madison,WI)と合わせた。インビトロ翻訳反応物の量を、最も強いシグナルを生成する試料について1ウェル当たり2百万を超える相対発光量(RLU)が検出されなくなるまで調節または希釈し、各化学組成に対するRLUを表120に示す。プレートリーダーは、BioTek Synergy H1(BioTek,Winooski,VT)であった。試薬を用いないプレートのバックグラウンドシグナルは、1ウェル当たり約160の相対発光量であった。
表119および120に見ることができるように、複数の2’フルオロ含有化合物が、インビトロで活性であり、ルシフェラーゼタンパク質を産生する。 表119.HeLa細胞
表120.ウサギ網状ライセート
実施例76.修飾の組み合わせを用いたHeLa細胞におけるルシフェラーゼ 他の修飾と組み合わせた2’フルオロ修飾mRNAの使用を評価するために、一連のmRNAを、実施例75に記載されるように、野生型T7ポリメラーゼ(フルオロ不含化合物)または変異体T7ポリメラーゼ(フルオロ(fluyoro)含有化合物)のいずれかを用いて転写した。すべての修飾mRNAを、HeLa細胞におけるインビトロトランスフェクションによって試験した。
トランスフェクションの前日に、20,000のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を、5%CO2雰囲気下で一晩、37oGで成長させた。翌日、表121に記載の化学修飾を有する83ngのルシフェラーゼ修飾RNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、0.2μLを、10μLの最終体積のOPTI−MEM中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を合わせ、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加し、室温でインキュベートした。
18〜22時間のインキュベーションの後、ルシフェラーゼを発現する細胞を、製造業者の指示に従って100μLのPassive Lysis Buffer(Promega,Madison,WI)で溶解した。ライセートのアリコートを白色不透明ポリスチレン96ウェルプレート(Corning,Manassas,VA)に移し、100μLの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液(Promega,Madison,WI)と合わせた。ライセートの体積を、最も強いシグナルを生成する試料について1ウェル当たり2百万を超える発光量が検出されなくなるまで調節または希釈し、試験した各化学組成についてのRLUを表121に示す。プレートリーダーは、BioTek Synergy H1(BioTek,Winooski,VT)であった。試薬を用いないプレートのバックグラウンドシグナルは、1ウェル当たり約200の相対発光量であった。
表121から明らかなように、すべてのフルオロ不含化合物および多数の2’フルオロ修飾を含有する組み合わせを含む、ほとんどの組み合わせの修飾が、mRNAによる機能的ルシフェラーゼタンパク質の産生をもたらした。 表121.ルシフェラーゼ
実施例77.G−CSFインビトロ転写 第2のオープンリーディングフレームに関連して、すべての異なる化学修飾の活性を評価するために、ルシフェラーゼmRNA、ヒトG−CSF mRNAを用いて既に行った実験を再現した。G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、野生型T7ポリメラーゼ(すべてのフルオロ不含化合物)または変異体T7ポリメラーゼ(すべてのフルオロ含有化合物)を用いて、表122および123の化学組成で完全に修飾した。変異体T7ポリメラーゼは、市販入手した(Durascribe(登録商標)T7 Transcriptionキット(カタログ番号DS010925)(Epicentre(登録商標),Madison,WI)。
表122および123の修飾RNAを、示されるように、HeLa細胞にインビトロでトランスフェクトしたか、またはウサギ網状ライセート(250ngの修飾mRNA)に添加した。対照である未処理、擬似トランスフェクト(トランスフェクション試薬のみ)、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたG−CSF、または5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼ対照(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)も分析した。G−CSFタンパク質の発現をELISAによって判定し、値を表122および123に示す。表122において、「NT」は未試験を意味する。
表123に示されるように、すべてではないが多数の化学修飾が、ヒトG−CSFタンパク質産生をもたらした。細胞に基づく翻訳系および細胞不含の翻訳系によるこれらの結果は、非常によく相関し、同じ修飾が通常いずれの系においても機能するかまたは機能しない。1つの注目すべき例外は、5−ホルミルシチジン修飾G−CSF mRNAであり、これは、細胞不含の翻訳系では機能したが、HeLa細胞に基づくトランスフェクション系では機能しなかった。2つのアッセイ間の同様の差異が、5−ホルミルシチジン修飾ルシフェラーゼmRNAでも見られた。
表123に示されるように、すべてではないが多数のG−CSF mRNA修飾化学組成(組み合わせて使用する場合)が、インビボ活性を示した。さらに、修飾mRNA(N4−アセチルシチジンまたは5メチルシチジンを有する)におけるN1−メチル−シュードウリジンの存在は、シュードウリジンを有するものを用いて試験した同じ組み合わせよりも高い発現を示した。総合すると、これらのデータは、N1−メチル−シュードウリジン含有G−CSF mRNAが、インビトロでのタンパク質発現の向上をもたらすことを示す。 表122.G−CSF発現
表123.HeLa細胞における組み合わせ化学組成
実施例78.化学組成のスクリーニング 以下に列挙される表(表124〜126)は、前述の実施例に提示された様々な化合物を用いたインビトロおよびインビトロのスクリーニングデータの大部分を要約する。良好な相関性が、細胞に基づく翻訳アッセイと細胞不含の翻訳アッセイとの間に存在する。同じ化学置換は、通常、ルシフェラーゼまたはG−CSF mRNAについて試験したかにかかわらず、良好な一致性を示す。最後に、N1−メチル−シュードウリジン含有mRNAは、インビトロおよびインビボで、検出可能なサイトカイン刺激をほとんどまたは全く伴わずに、非常に高いレベルのタンパク質発現を示し、インビトロおよびインビボの両方で、シュードウリジンを含有するmRNAよりも優れている。
ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)およびG−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、表124および125に記載の天然もしくは非天然の化学組成、または表126に記載の化学組成の組み合わせで修飾し、本明細書に記載の方法を用いて試験した。
表125および126において、「*」は変異体T7ポリメラーゼ(Durascribe(登録商標)T7 Transcriptionキット(カタログ番号DS010925)(Epicentre(登録商標),Madison,WI)を用いたインビトロ転写反応を指す;「**」は変異体T7ポリメラーゼ(Durascribe(登録商標)T7 Transcriptionキット(カタログ番号DS010925)(Epicentre(登録商標),Madison,WI)を用いたインビトロ転写反応の第2の結果を指す;「***」は細胞不含翻訳(ウサギ網状赤血球ライセート)で見られた産生を指す;HeLaのタンパク質産生は、「+」、「+/−」、および「−」で判定する;G−CSF PBMCについて言及する場合、「++++」は、6,000pg/mLを上回るG−CSFを意味し、「+++」は、3,000pg/mLを上回るG−CSFを意味し、「++」は1,500pg/mLを上回るG−CSFを意味し、「+」は300pg/mLを上回るG−CSFを意味し、「+/−」は150〜300pg/mLのG−CSFを意味し、バックグラウンドは、約110pg/mLであった;サイトカインPBMCについて言及する場合、「++++」は1,000pg/mLを上回るインターフェロンα(IFN−α)を意味し、「+++」は600pg/mLを上回るIFN−αを意味し、「++」は300pg/mLを上回るIFN−αを意味し、「+」は100pg/mLを上回るIFN−αを意味し、「−」は100pg/mLに満たないことを意味し、バックグラウンドは約70pg/mLであった;ならびに「NT」は未試験を意味する。表125において、タンパク質産生を、変異体T7ポリメラーゼ(Durascribe(登録商標)T7 Transcriptionキット(カタログ番号DS010925)(Epicentre(登録商標),Madison,WI)を用いて評価した。 表124.天然発生
表125.非天然発生
表126において、HeLaのタンパク質産生は「+」、「+/−」、および「−」によって判定する;G−CSF PBMCに言及する際、「++++」は6,000pg/mLを上回るG−CSFを意味し、「+++」は3,000pg/mLを上回るG−CSFを意味し、「++」は1,500pg/mLを上回るG−CSFを意味し、「+」は300pg/mLを上回るG−CSFを意味し、「+/−」は150〜300pg/mLのG−CSFを意味し、バックグラウンドは約110pg/mLであった;サイトカインPBMCに言及する際、「++++」は1,000pg/mLを上回るインターフェロンα(IFN−α)を意味し、「+++」は600pg/mLを上回るIFN−αを意味し、「++」は300pg/mLを上回るIFN−αを意味し、「+」は100pg/mLを上回るIFN−αを意味し、「−」は100pg/mL未満を意味し、バックグラウンドは約70pg/mLであった;「WT」は野生型T7ポリメラーゼをさし、「MT」は変異体T7ポリメラーゼ(Durascribe(登録商標)T7 Transcriptionキット(カタログ番号DS010925)(Epicentre(登録商標),Madison,WI)を指し、「NT」は未試験を意味する。 表126.組み合わせの化学組成
実施例79.PBMCにおける2’フルオロ化学 G−CSF修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1に示されない)の自然免疫応答を誘起する能力を、インターフェロン−α(IFN−α)および腫瘍壊死因子−α(TNF−α)産生を測定することによって判定した。インビトロPBMC培養の使用は、オリゴヌクレオチドの免疫刺激可能性を測定する一般的な方法であり(Robbins et al.,Oligonucleotides 2009 19:89−102)、トランスフェクション方法を本明細書に記載する。特異的ELISAによって測定した経時的なインターフェロン−α(IFN−α)および腫瘍壊死因子α(TNF−α)産生の2または3人の別個のPBMCドナーからの平均を表127に示す。対照のR848、P(I)P(C)、LPS、およびLipofectamine 2000(L2000)も分析した。
自然免疫認識に関して、いずれの修飾mRNA化学組成も、陽性対照(R848、P(I)P(C))と比較してIFN−αおよびTNF−α産生を大幅に阻止したが、2’フルオロ化合物は、他の組み合わせと比べてもより低くIFN−αおよびTNF−α産生を低減させ、N4−アセチルシチジンの組み合わせは、サイトカインプロファイルを上昇させた。 表127.IFN−αおよびTNF−α
実施例80.タバコエッチ病ウイルス5’UTRを有する修飾mRNA 5’非翻訳領域(UTR)は、隣接領域として提供され得る。複数の5’UTRは、隣接領域に含まれ得、同一または異なる配列であり得る。隣接領域の任意の部分(隣接領域を含なまい任意の部分を含む)は、コドン最適化され得、それらのいずれかは、独立して、コドン最適化の前および/または後に1つ以上の異なる構造または化学修飾を含有し得る。
5’UTRは、タバコエッチ病ウイルス(TEV)からの5’UTRを含み得る。A、T、C、もしくはGを含む1つ以上のヌクレオチドが末端に付加されるか、または末端から除去される5’UTRの変異形が利用され得る。
実施例81.PLGA製剤化mRNAの発現 A.ルシフェラーゼPLGAマイクロスフェアの合成および特徴付け 5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、2−チオウリジンで置換されたウリジンで25%および5−メチルシトシンで置換されたシトシンで25%修飾されたか、N1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、またはシュードウリジンで完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、1倍TE緩衝液中で再構築し、次いでPLGAマイクロスフェア中で製剤化した。PLGAマイクロスフェアを、PLGAエステルキャップ(Lactel、カタログ番号B6010−2、固有粘度0.55〜0.75、50:50のLA:GA)、ポリビニルアルコール(PVA)(Sigma、カタログ番号348406−25G、MW 13−23k)、ジクロロメタン、および水を使用して、当技術分野で既知の水/油/水の二重乳化法を用いて合成した。手短に、4mg/mLのTE緩衝液(W1)中の0.4mLのmRNAを、200mg/mLのPLGAの濃度で、ジクロロメタン(DCM)(O1)中に溶解させた2mLのPLGAに添加した。W1/O1エマルションを、速度5(約19,000rpm)で30秒間均質化させた(IKA Ultra−Turrax hom*ogenizer,T18)。次いで、W1/O1エマルションを250mLの1%のPVA(W2)に添加し、速度5(約19,000rpm)で1分間均質化させた。製剤をそのまま3時間撹拌させ、次いで、100μmのナイロンメッシュ篩(Fisherbrand Cell Strainer、カタログ番号22−363−549)に通し、最後に遠心分離により洗浄した(10分間、9,250rpm、4℃)。上清を廃棄し、PLGAのペレットを5〜10mLの水に再懸濁させ、これを2回繰り返した。水で洗浄し、再懸濁した後、100〜200μlのPLGAマイクロスフェア試料を、レーザー回折による製剤の粒径測定に使用した(Malvern Mastersizer2000)。洗浄した製剤を液体窒素中で凍結させ、次いで2〜3日間凍結乾燥させた。
凍結乾燥させた後、約10mgのPLGA MSを2mLのエッペンドルフ管に計量し、1mLのDCMを添加することにより脱製剤化し、試料を2〜6時間振盪させた。mRNAを0.5mLの水を添加することによって脱製剤化PLGAマイクロスフェアから抽出し、試料を一晩振盪した。トランスフェクションアッセイにおける対照として使用するために、TE緩衝液中の製剤化していないルシフェラーゼmRNA(非製剤化対照)をDCM中に添加し、脱製剤化プロセスに供した(脱製剤化対照)。カプセル封入効率、充填される重量パーセント、および粒径を表128に示す。カプセル封入効率を、製剤に添加されるmRNAの初期量で除したPLGAマイクロスフェアの脱製剤からのmRNAのmgとして計算した。製剤中に充填される重量パーセントを、製剤に添加されるPLGAの初期量で除したPLGAマイクロスフェアの脱製剤からのmRNAのmgとして計算した。 表128.PLGA特性
B.PLGAマイクロスフェアにカプセル封入された修飾mRNAのタンパク質発現 トランスフェクションの前日に、20,000個のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を5%のCO2雰囲気下で一晩、37℃で成長させた。翌日、83ngの脱製剤化ルシフェラーゼmRNA PLGAマイクロスフェア試料、脱製剤化ルシフェラーゼmRNA対照(脱製剤化対照)、または非製剤化ルシフェラーゼmRNA対照(非製剤化対照)を、10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、0.2μLを10μLの最終体積のOPTI−MEM中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を混合し、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加した。次いで、プレートを前述のようにインキュベートした。
18〜22時間のインキュベーションの後、ルシフェラーゼを発現する細胞を、製造業者の指示に従って100μLのPassive Lysis Buffer(Promega,Madison,WI)で溶解した。ライセートのアリコートを白色不透明ポリスチレン96ウェルプレート(Corning,Manassas,VA)に移し、100μLの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液(Promega,Madison,WI)と合わせた。試薬を用いないプレートのバックグラウンドシグナルは、1ウェル当たり約200の相対発光量であった。プレートリーダーは、BioTek Synergy H1(BioTek,Winooski,VT)であった。
細胞を収集し、各試料に対する(相対発光量、RLUにおける)生物発光を表129に示す。これらの試料のトランスフェクションは、ルシフェラーゼmRNAの種々の化学組成がPLGAマイクロスフェア製剤化の後に依然としてルシフェラーゼタンパク質を発現できることを確認した。 表129.化学修飾
実施例82.第IX因子のインビトロ研究 A.無血清培地 ヒト第IX因子mRNA(mRNA配列は配列番号26172に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)無血清培地内にトランスフェクトした。細胞培養上清を採取し、ペプチドの二次元HPLC分離を経る前にトリプシン消化に供した。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化を使用して、ペプチドを検出した。8個のペプチドが検出され、検出されたペプチドのうちの7個が第IX因子に特有である。この結果は、無血清培地へトランスフェクトしたmRNAが完全長第IX因子タンパク質を発現できたことを示す。
B.ヒト胎児腎臓(HEK)293A細胞 250ngのコドン最適化ヒト第IX因子mRNA(mRNA配列は配列番号26172に示される;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、10%FBSの存在下でDMEMにおいてLipofectamine 2000を用いてHEK293A細胞(150,000細胞/ウェル)内にトランスフェクトした。トランスフェクションの3時間後、トランスフェクション複合体を取り出した。トランスフェクションの3、6、9、12、24、48、および72時間後、細胞を収集した。全RNAを単離し、cDNA合成に使用した。コドン最適化第IX因子特異的プライマーセットを使用して、そのcDNAを定量的リアルタイムPCRによる分析に供した。ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1(HPRT)レベルを正規化に使用した。データは検出可能なmRNAの割合としてプロットされ、mRNAレベルは3時間時点で100%と見なされる。ヒト胎児腎臓293(HEK293)細胞における5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された第IX因子修飾mRNAの半減期は、約8〜10時間である。
実施例83.生理食塩水製剤:皮下投与 ヒトG−CSF修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)ならびにヒトEPO修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26171に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾)を、生理食塩水中で製剤化し、100μgの用量で筋肉内(IM)注入を介してマウスに送達した。
対照には、ルシフェラーゼ(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)またはその製剤緩衝液(F.Buffer)が含まれた。マウスに、注入の13時間後に採血を行って、pg/mL単位で血清中のヒトポリペプチドの濃度を判定した。(G−CSF群では、マウス血清中のヒトG−CSFを測定し、EPO群では、マウス血清中のヒトEPOを測定した)。データを表130に示す。
製剤化されない場合、mRNAは血清中で急速に分解し、それは系中でより長く持続するmRNAを送達する最良の方法が、mRNAを製剤化することによるものであることを示唆する。表130に示されるように、mRNAは緩衝製剤のみを使用して皮下に送達されてもよい。 表130.投薬レジメン
実施例84.硝子体内送達 mCherry修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26169に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)、およびルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)を、生理食塩水中で製剤化し、表131に記載されるようにラットの硝子体内に送達した。試料を硝子体内に送達された生理食塩水のみの対照に対して比較した。 表131.投薬チャート
1日目に、動物に麻酔をかけている間に各動物の左または右眼に製剤を投与する。投与の前の日に、ゲンタマイシン眼内軟膏または溶液を両眼に2回適用した。ゲンタマイシン眼内軟膏または溶液を、注入の直後および注入の翌日に適用した。投薬の前に、散瞳点眼剤(1%トロピカミドおよび/または2.5%フェニレフリン)をそれぞれの眼に適用する。
投薬の18時間後、mCherryの用量および送達緩衝液を受容した眼を摘出し、室温で一晩、組織固定のためにそれぞれの眼を10mLの4%パラホルムアルデヒドを含む管に別々に置いた。その翌日、眼を10mLの30%のショ糖(sucurose)を含む管に別々に写し、それらが処理され、切片化されるまで21℃で保管した。異なる切片から作製されたスライドをF−顕微鏡検査で評価した。mCherry修飾mRNAを投与された眼から作製されたスライドでは陽性発現が見られ、対照は発現を示さなかった。
実施例85.インビボサイトカイン発現研究 5’キャップ、キャップ1で修飾されていないか(未修飾)、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンならびに5’キャップ、キャップ1で完全に修飾されたか(Gen1)、または5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンならびに5’キャップ、キャップ1で完全に修飾されたか(Gen2キャップ)、あるいはキャップがない(Gen2キャップされない)、200μgのG−CSF修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない)をマウスに筋肉内注入した。対照のR−848、5%ショ糖、および未処理のマウスも分析した。8時間後、マウスから血清を採取し、インターフェロン−α(IFN−α)発現について分析した。その結果を表132に示す。 表132.IFN−α発現
実施例86.VEGF修飾mRNAのインビトロ発現 HEK293細胞に、表133に示される濃度で、Invitrogen(Carlsbad,CA)のLipofectamine2000を用いて複合体形成している修飾mRNA(mmRNA)VEGF−A(mRNA配列は配列番号26181に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)をトランスフェクトした。タンパク質発現をELISAによって検出し、そのタンパク質(pg/mL)を表133および図7に示す。 表133.タンパク質発現
実施例87.GFPのHeLa細胞におけるインビトロスクリーニング トランスフェクションの前日に、20,000個のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を5%のCO2雰囲気下で一晩、37℃で成長させた。翌日、表134に記載の化学修飾を有する、37.5ngまたは75ngの緑色蛍光タンパク質(GFP)修飾RNA(mRNA配列は配列番号26180に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、0.2μLを10μLの最終体積のOPTI−MEM中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を混合し、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加し、室温でインキュベートした。
18〜22時間のインキュベーションの後、ルシフェラーゼを発現する細胞を、製造業者の指示に従って100μLのPassive Lysis Buffer(Promega,Madison,WI)で溶解した。ライセートのアリコートを白色不透明ポリスチレン96ウェルプレート(Corning,Manassas,VA)に移し、100μLの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液(Promega,Madison,WI)と合わせた。各化学組成に対する中央蛍光強度(MFI)を判定し、表134に示す。
この結果は、N1−メチル−シュードウリジンおよび5−メチルシトシンで完全に修飾されたGFPが、他の化学組成と比較してHeLa細胞中でよりタンパク質を産生することを実証する。加えて、細胞に投与されるより高用量のGFPは、より高いMFI値をもたらした。 表134.平均蛍光強度
実施例88.均質化 異なるルシフェラーゼmRNA溶液(表135に記載され、「X」は、その成分を含有する溶液を指す)(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)を評価し、異なる溶液の収量パーセント、バイオアナライザーによってmRNAの完全性、ならびにインビトロトランスフェクションによるmRNAのタンパク質発現を試験した。表135に示されるように、水、4mg/mLの1倍TE緩衝液中で、mRNA溶液を調製し、0.8mg/mLの最終mRNA濃度を実現するために、ジクロロメタン(DCM)または200mg/mLのポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(PLGA)(Lactel、カタログ番号B6010−2、固有粘度0.55−0.75、50:50のLA:GA)を含有するDCMのいずれかに添加した。均質化を必要とする溶液を速度5(約19,000rpm)で30秒間均質化させた(IKA Ultra−Turrax hom*ogenizer,T18)。水、ジクロロメタン(dicloromethane)、およびポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(PLGA)中のmRNA試料は、回収不能(NR)であった。NR試料を除くすべての試料が、バイオアナライザー(Bio−rad Experion)で判定されるようにmRNAの完全性を維持した。
トランスフェクションの前日に、20,000個のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を5%のCO2雰囲気下で一晩、37℃で成長させた。翌日、回収可能な試料からの250ngのルシフェラーゼmRNAを10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、0.2μLを10μLの最終体積のOPTI−MEM中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を混合し、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加した。次いで、プレートを前述のようにインキュベートした。対照ルシフェラーゼmRNA(生理食塩水中で製剤化されたルシフェラーゼmRNA)(対照)および未処理細胞(未処理)も評価した。細胞を収集し、各シグナルに対するその生物発光平均(光子/秒で)(生物発光(p/s))もまた表135に示す。分析した際、回収可能な試料はすべて、ルシフェラーゼmRNAの活性を示した。
18〜22時間のインキュベーションの後、ルシフェラーゼを発現する細胞を、製造業者の指示に従って100μLのPassive Lysis Buffer(Promega,Madison,WI)で溶解した。ライセートのアリコートを白色不透明ポリスチレン96ウェルプレート(Corning,Manassas,VA)に移し、100μLの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液(Promega,Madison,WI)と合わせた。試薬を用いないプレートのバックグラウンドシグナルは、1ウェル当たり約200の相対発光量であった。プレートリーダーは、BioTek Synergy H1(BioTek,Winooski,VT)であった。
細胞を収集し、その生物発光平均(相対発光量、RLUで)(生物発光(RLU))もまた表135に示す。分析した際、回収可能な試料はすべて、ルシフェラーゼmRNAの活性を示した。 表135.溶液
実施例89.TE緩衝液および水の評価 ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)を、表136に概要説明されるように水またはTE緩衝液中に再構築し、次いで、PLGAマイクロスフェア中で製剤化した。PLGAマイクロスフェアを、PLGA(Lactel、カタログ番号B6010−2、固有粘度0.55〜0.75、50:50のLA:GA)、ポリビニルアルコール(PVA)(Sigma、カタログ番号348406−25G、MW 13−23k)、ジクロロメタン、および水を使用して、当技術分野で既知の水/油/水の二重乳化法を用いて合成した。手短に、水または2〜6mg/mLの濃度のTE緩衝液(W1)中の0.2〜0.6mLのmRNAを、100mg/mLのPLGAの濃度でジクロロメタン(DCM)(O1)中に溶解させた2mLのPLGAに添加した。W1/O1エマルションを、速度5(約19,000rpm)で30秒間均質化させた(IKA Ultra−Turrax hom*ogenizer,T18)。次いで、W1/O1エマルションを250mLの1%のPVA(W2)に添加し、速度5(約19,000rpm)で1分間均質化させた。
製剤をそのまま3時間撹拌させ、次いで、100μmのナイロンメッシュ篩(Fisherbrand Cell Strainer、カタログ番号22−363−549)に通し、最後に遠心分離により洗浄した(10分間、9,250rpm、4℃)。上清を廃棄し、PLGAのペレットを5〜10mLの水に再懸濁させ、これを2回繰り返した。洗浄した製剤を液体窒素中で凍結させ、次いで2〜3日間凍結乾燥させた。凍結乾燥させた後、約10mgのPLGA MSを2mLのエッペンドルフ管に計量し、1mLのDCMを添加することにより脱製剤化し、試料を2〜6時間振盪させた。mRNAを0.5mLの水を添加することによって脱製剤化PLGAマイクロスフェアから抽出し、試料を一晩振盪した。トランスフェクションアッセイにおける対照として使用するために、水またはTE緩衝液中の製剤化していないルシフェラーゼmRNA(脱製剤化対照)をDCM中に添加し、脱製剤化プロセスに供した。
トランスフェクションの前日に、20,000個のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を5%のCO2雰囲気下で一晩、37℃で成長させた。翌日、100ngの脱製剤化ルシフェラーゼmRNA試料を、10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、0.2μLを10μLの最終体積のOPTI−MEM中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を混合し、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加した。次いで、プレートを前述のようにインキュベートした。
18〜22時間のインキュベーションの後、ルシフェラーゼを発現する細胞を、製造業者の指示に従って100μLのPassive Lysis Buffer(Promega,Madison,WI)で溶解した。ライセートのアリコートを白色不透明ポリスチレン96ウェルプレート(Corning,Manassas,VA)に移し、100μLの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液(Promega,Madison,WI)と合わせた。試薬を用いないプレートのバックグラウンドシグナルは、1ウェル当たり約200の相対発光量であった。プレートリーダーは、BioTek Synergy H1(BioTek,Winooski,VT)であった。各製剤からのルシフェラーゼmRNAの活性度を判定するために、各製剤に対する相対発光量(RLU)を適切なmRNA脱製剤化対照(水またはTE緩衝液中のmRNA)のRLUで除した。表136は、ルシフェラーゼmRNAの活性度を示す。PLGAマイクロスフェア製剤(製剤)中のルシフェラーゼmRNAの活性度は、水と比べて、TE緩衝液中で製剤化することによって大幅に改善された。 表136.製剤
実施例90.mRNA上の化学修飾 トランスフェクションの前日に、20,000個のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を5%のCO2雰囲気下で一晩、37℃で成長させた。翌日、表137に記載の化学修飾を有する83ngのルシフェラーゼ修飾RNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、0.2μLを10μLの最終体積のOPTI−MEM中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を混合し、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加し、室温でインキュベートした。
18〜22時間のインキュベーションの後、ルシフェラーゼを発現する細胞を、製造業者の指示に従って100μLのPassive Lysis Buffer(Promega,Madison,WI)で溶解した。ライセートのアリコートを白色不透明ポリスチレン96ウェルプレート(Corning,Manassas,VA)に移し、100μLの完全ルシフェラーゼアッセイ溶液(Promega,Madison,WI)と合わせた。ライセートの体積を、最も強いシグナルを生成する試料について1ウェル当たり2百万を超える相対発光量(RLU)が検出されなくなるまで調節または希釈し、試験した各化学組成についてのRLUを、表137に示す。プレートリーダーは、BioTek Synergy H1(BioTek,Winooski,VT)であった。試薬を用いないプレートのバックグラウンドシグナルは、1ウェル当たり約200の相対発光量であった。 表137.化学修飾
実施例91.修飾mRNAの筋肉内および皮下投与 PBS(pH7.4)中で製剤化された、5−メチルシトシンおよびシュードウリジン(5mC/pU)で完全に修飾されたか、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジン(5mC/N1mpU)で完全に修飾されたか、シュードウリジン(pU)で完全に修飾されたか、N1−メチル−シュードウリジン(N1mpU)で完全に修飾されたか、または5−メチルシトシンで置換されたシトシンで25%および2−チオウリジンで置換されたウリジンで25%修飾された(5mC/s2U)、ルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、2.5mg/kgの用量で筋肉内または皮下にBalb−Cマウスに投与した。マウスを、筋肉内送達の場合、2時間、8時間、24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、および144時間、ならびに皮下送達の場合、2時間、8時間、24時間、48時間、72時間、96時間、および120時間時点で撮像した。撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。筋肉内投与に対する平均全光束(光子/秒)を表138に示し、皮下投与に対する平均全光束(光子/秒)を表139に示す。バックグラウンドシグナルは、3.79E+05(p/s)であった。筋肉内投与に対するピーク発現は、すべての化学組成おいて24時間から48時間の間に見られ、発現は144時間時点でも依然として検出された。皮下送達の場合、ピーク発現は2時間から8時間の間に見られ、発現は72時間時点でも検出された。 表138.筋肉内投与
表139.皮下投与
実施例92.浸透圧ポンプ研究 埋込の前に、浸透圧ポンプ(ALZET(登録商標)浸透圧ポンプ2001D,DURECT Corp.Cupertino,CA)を0.2mLの1倍PBS(pH7.4)(PBS充填ポンプ)または1倍PBS(pH7.4)中1mg/mLで0.2mLのルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)(ルシフェラーゼ充填ポンプ)に充填し、37℃で一晩、1倍PBS(pH7.4)中でインキュベートする。
Balb−Cマウス(n=3)にPBS充填ポンプまたはルシフェラーゼ充填ポンプのいずれかを皮下に埋め込み、2時間、8時間、24時間時点で撮像する。対照として、PBS充填ポンプを皮下に埋め込み、マウスに1倍PBS中のルシフェラーゼ修飾を皮下に注入するか(PBS充填ポンプ;SCルシフェラーゼ)か、または浸透圧ポンプを埋め込まず、マウスに1倍PBS中のルシフェラーゼ修飾mRNAを皮下に注入する(SCルシフェラーゼ)。ルシフェラーゼ製剤を表140に概略説明する。 表140.ルシフェラーゼ製剤
実施例93.外部浸透圧ポンプ研究 外部浸透圧ポンプ(ALZET(登録商標)浸透圧ポンプ2001D、DURECT Corp.Cupertino,CA)を0.2mLの1倍PBS(pH7.4)(PBS充填ポンプ)または1倍PBS(pH7.4)中1mg/mLで0.2mLのルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)(ルシフェラーゼ充填ポンプ)に充填し、37℃で一晩1倍、PBS(pH7.4)中でインキュベートする。
外部PBS充填ポンプまたはルシフェラーゼ充填ポンプに接続されたカテーテルを使用して、Balb−Cマウス(n=3)に製剤を投与する。マウスを、2時間、8時間、および24時間時点で撮像する。対照として、外部PBS充填ポンプを使用し、マウスに1倍PBS中のルシフェラーゼ修飾を皮下に注入するか(PBS充填ポンプ;SCルシフェラーゼ)か、または外部ポンプを使用せず、マウスに1倍PBS中のルシフェラーゼ修飾mRNAを皮下に注入のみ行う(SCルシフェラーゼ)。撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入する。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得する。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定する。ルシフェラーゼ製剤を表141に概説し、平均全光束(光子/秒)。 表141.ルシフェラーゼ製剤
実施例94.フィブリンシーラント研究 Tisseel(Baxter Healthcare Corp.,Deerfield,IL)等のフィブリンシーラントは、二連式シリンジ中のフィブリノーゲンおよびトロンビンから成る。混合されると、フィブリノーゲンはフィブリンに変換され、約10〜30秒でフィブリン血餅を形成する。この血餅は、身体の天然の凝血機構を模倣することができる。加えて、フィブリンハイドロゲルは、持続放出送達において使用され得る可能性のある三次元構造である。現在、フィブリンシーラントは、縫合、結紮、および焼灼等の従来の外科技法に代わる止血および封着の用途として認められている。
トロンビンおよびフィブリノーゲン成分を二連式シリンジ中に別々に充填した。Balb−Cマウス(n=3)に50μLのフィブリノーゲン、50μLのトロンビンを皮下に注入し、また同じ部位に修飾ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)(Tisseel+ルシフェラーゼ)か、50μLのフィブリノーゲンおよび50μLのトロンビン(Tisseel)か、または修飾ルシフェラーゼmRNA(ルシフェラーゼ)を注入した。フィブリノーゲンおよびトロンビンの注入は、二連式シリンジを使用して同時に完了した。ルシフェラーゼのSC注入は、フィブリンハイドロゲルが重合することを可能にするように、フィブリノーゲン/トロンビン注入の15分後に完了した(Tisseel+ルシフェラーゼ群)。未処理マウスの対照群も評価した。マウスを5時間および24時間時点で撮像した。撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。ルシフェラーゼ製剤を表142に概要説明し、平均全光束(光子/秒)を表143に示す。フィブリンシーラントは撮像を妨げないことが見出され、ルシフェラーゼおよびTisseelの注入は、ルシフェラーゼの発現を示した。 表142.ルシフェラーゼ製剤
表143.全光束
実施例95.mRNA含有フィブリンシーラント研究 A.修飾mRNAおよび塩化カルシウム 再構築の前に、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、またはN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を塩化カルシウムに添加する。次いで、その塩化カルシウムを使用して、トロンビンを再構築する。フィブリノーゲンを、製造業者の指示に従って線溶阻害剤溶液で再構築する。修飾mRNAを含有する再構築されたトロンビンおよびフィブリノーゲンを二連式シリンジ中に充填する。マウスに、修飾mRNAを含有する50μLのフィブリノーゲンおよび50μLのトロンビンを皮下に注入するか、または等価用量の修飾ルシフェラーゼmRNAを含有する50μLのPBSを注入した。未処理マウスの対照群も評価する。平均全光束(光子/秒)を判定するために、マウスを既定の間隔で撮像する。
B.脂質ナノ粒子で製剤化される修飾mRNAおよび塩化カルシウム 再構築の前に、脂質ナノ粒子中で製剤化される、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、またはN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を塩化カルシウムに添加する。次いで、その塩化カルシウムを使用して、トロンビンを再構築する。フィブリノーゲンを、製造業者の指示に従って線溶阻害剤溶液で再構築する。修飾mRNAを含有する再構築されたトロンビンおよびフィブリノーゲンを二連式シリンジ中に充填する。マウスに、50μLのフィブリノーゲンおよび修飾mRNAを含有する50μLのトロンビンを皮下に注入するか、または等価用量の修飾ルシフェラーゼmRNAを含有する50μLのPBSを注入した。未処理マウスの対照群も評価する。平均全光束(光子/秒)を判定するために、マウスを既定の間隔で撮像する。
C.修飾mRNAおよびフィブリノーゲン 再構築の前に、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、またはN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を線溶阻害剤溶液に添加する。次いで、その線溶阻害剤溶液を使用して、フィブリノーゲンを再構築する。トロンビンを、製造業者の指示に従って塩化カルシウム溶液で再構築する。修飾mRNAを含有する再構築されたフィブリノーゲンおよびトロンビンを二連式シリンジ中に充填する。マウスに、50μLのトロンビンおよび修飾mRNAを含有する50μLのフィブリノーゲンを皮下に注入するか、または等価用量の修飾ルシフェラーゼmRNAを含有する50μLのPBSを注入した。未処理マウスの対照群も評価する。平均全光束(光子/秒)を判定するために、マウスを既定の間隔で撮像する。
D.脂質ナノ粒子で製剤化される修飾mRNAおよびフィブリノーゲン 再構築の前に、脂質ナノ粒子中で製剤化された、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、またはN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を線溶阻害剤溶液に添加する。次いで、その線溶阻害剤溶液を使用して、フィブリノーゲンを再構築する。トロンビンを、製造業者の指示に従って塩化カルシウム溶液で再構築する。修飾mRNAを含有する再構築されたフィブリノーゲンおよびトロンビンを二連式シリンジ中に充填する。マウスに、50μLのトロンビンおよび修飾mRNAを含有する50μLのフィブリノーゲンを皮下に注入するか、または等価用量の修飾ルシフェラーゼmRNAを含有する50μLのPBSを注入した。未処理マウスの対照群も評価する。平均全光束(光子/秒)を判定するために、マウスを既定の間隔で撮像する。
E.修飾mRNAおよびトロンビン 再構築の前に、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、またはN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、製造業者の指示に従って塩化カルシウムで再構築された後の、その再構築されたトロンビンに添加する。次いで、線溶阻害剤溶液を使用して、製造業者の指示に従ってフィブリノーゲンを再構築する。再構築されたフィブリノーゲンおよび修飾mRNAを含有するトロンビンを二連式シリンジ中に充填する。マウスに、修飾mRNAを含有する50μLのトロンビンおよび50μLのフィブリノーゲンを皮下に注入するか、または等価用量の修飾ルシフェラーゼmRNAを含有する50μLのPBSを注入した。未処理マウスの対照群も評価する。平均全光束(光子/秒)を判定するために、マウスを既定の間隔で撮像する。
F.脂質ナノ粒子で製剤化される修飾mRNAおよびトロンビン 再構築の前に、脂質ナノ粒子中で製剤化された、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、またはN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、製造業者の指示に従って塩化カルシウムで再構築された後のその再構築されたトロンビンに添加する。次いで、線溶阻害剤溶液を使用して、製造業者の指示に従ってフィブリノーゲンを再構築する。再構築されたフィブリノーゲンおよび修飾mRNAを含有するトロンビンを二連式シリンジ中に充填する。マウスに、修飾mRNAを含有する50μLのトロンビンおよび50μLのフィブリノーゲンを皮下に注入するか、または等価用量の修飾ルシフェラーゼmRNAを含有する50μLのPBSを注入した。未処理マウスの対照群も評価する。平均全光束(光子/秒)を判定するために、マウスを既定の間隔で撮像する。
実施例96.5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジン修飾mRNAのカチオン性脂質製剤 5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、表144に記載されるようにカチオン性脂質中で製剤化した。その製剤を静脈内に(I.V.)、筋肉内に(I.M.)、または皮下に(S.C.)、0.05mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。 表144.カチオン性脂質製剤
撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。マウスを投薬の2時間、8時間、および24時間後に撮像し、平均全光束(光子/秒)を各投与経路およびカチオン性脂質製剤について測定した。背景光束は、約4.17E+05p/sであった。撮像の結果を表145に示す。表145において、「NT」は、試験されなかったことを示す。 表145.光束
実施例97.脂質ナノ粒子静脈内研究 ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)を、表146に記載されるように50%のDLin−MC3−DMAまたはDLin−KC2−DMA、38.5%のコレステロール、10%のDSPC、および1.5%のPEGを含有する脂質ナノ粒子中で製剤化した。製剤を静脈内に(I.V.)、0.5mg/kg、0.05mg/kg、0.005mg/kg、または0.0005mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。 表146.製剤
DLin−KC2−DMAの場合、マウスを投薬の2時間、8時間、24時間、72時間、96時間、および168時間後に撮像し、平均全光束(光子/秒)を各投与経路およびカチオン性脂質製剤について測定した。背景光束は、約3.66E+05p/sであった。撮像の結果を表147に示す。臓器を8時間時点で撮像し、平均全光束(光子/秒)を肝臓、脾臓、肺、および腎臓について測定した。各臓器に対する対照も分析した。その結果を表149に示す。すべての用量レベルに対するピークシグナルは、投与の8時間後であった。種々の臓器(肝臓、脾臓、肺、および腎臓)への分布は、LNP用量を増加させるか、または減少させることによって制御され得る可能性もある。 表147.光束
表148.臓器の光束
DLin−MC3−DMAの場合、マウスを投薬の2時間、8時間、24時間、48時間、72時間、および144時間後に撮像し、平均全光束(光子/秒)を各投与経路およびカチオン性脂質製剤について測定した。背景光束は、約4.51E+05p/sであった。撮像の結果を表149に示す。臓器を8時間時点で撮像し、平均全光束(光子/秒)を肝臓、脾臓、肺、および腎臓について測定した。各臓器に対する対照も分析した。その結果を表150に示す。すべての用量レベルに対するピークシグナルは、投与の8時間後であった。種々の臓器(肝臓、脾臓、肺、および腎臓)への分布は、LNP用量を増加させるか、または減少させることによって制御され得る可能性もある。 表149.光束
表150.臓器の光束
実施例98.脂質ナノ粒子皮下研究 ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)を、表151に記載されるように50%のDLin−KC2−DMA、385%のコレステロール、10%のDSPC、および1.5%のPEGを含有する脂質ナノ粒子中で製剤化した。製剤を皮下に(S.C.)0.5mg/kg、0.05mg/kg、または0.005mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。 表151.DLin−KC2−DMA製剤
撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。マウスを投薬の2時間、8時間、24時間、48時間、72時間、および144時間後に撮像し、平均全光束(光子/秒)を各投与経路およびカチオン性脂質製剤について測定した。検出下限は、約3E+05p/sであった。撮像の結果を表152に示す。臓器を8時間時点で撮像し、平均全光束(光子/秒)を肝臓、脾臓、肺、および腎臓について測定した。各臓器に対する対照も分析した。その結果を表153に示す。すべての用量レベルに対するピークシグナルは、投与の8時間後であった。種々の臓器(肝臓、脾臓、肺、および腎臓)への分布は、LNP用量を増加させるか、または減少させることによって制御され得る可能性もある。高用量では、高いレベルのルシフェラーゼ発現が肝臓、脾臓、肺、および腎臓において検出されたので、LNP製剤は皮下注入部位の外側に移動する。 表152.光束
表153.臓器の光束
実施例99.カチオン性脂質ナノ粒子皮下研究 ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)を、50%のDLin−MC3−DMA、38.5%のコレステロール、10%のDSPC、および1.5%のPEGを含有する脂質ナノ粒子中で製剤化する。製剤を皮下に(S.C.)0.5mg/kg、0.05mg/kg、または0.005mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与する。
マウスを投薬の2時間、8時間、24時間、48時間、72時間、および144時間後に撮像し、平均全光束(光子/秒)を各投与経路およびカチオン性脂質製剤について測定した。臓器を8時間時点で撮像し、平均全光束(光子/秒)を肝臓、脾臓、肺、および腎臓について測定する。各臓器に対する対照も分析する。
実施例100.ルシフェラーゼリポプレックス研究 リポプレックス形成したルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾したか(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾したか(5mC/N1mpU)、または5−メチルシトシンで置換されたシトシンで25%および2−チオウリジンで置換されたウリジン(5mC/s2U)で25%修飾した。製剤を静脈内に(I.V.)、筋肉内に(I.M.)、または皮下に(S.C.)0.10mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。
撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。マウスを投薬の8時間、24時間、および48時間後に撮像し、平均全光束(光子/秒)を各投与経路および化学修飾について測定した。バックグラウンドシグナルは、約3.91E+05p/sであった。撮像の結果を表154に示す。臓器を6時間時点で撮像し、平均全光束(光子/秒)を肝臓、脾臓、肺、および腎臓について測定した。各臓器に対する対照も分析した。その結果を表155に示す。 表154.光束
表155.臓器に対する光束
実施例101.修飾mRNAのカチオン性脂質製剤 5−メチルシトシンで置換されたシトシンで25%および2−チオウリジンで置換されたウリジンで25%(5mC/s2U)修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、表156に記載されるようにカチオン性脂質中で製剤化した。その製剤を静脈内に(I.V.)、筋肉内に(I.M.)、または皮下に(S.C.)、0.05mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。 表156.カチオン性脂質製剤
撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。マウスを投薬の2時間、8時間、および24時間後に撮像し、平均全光束(光子/秒)を各投与経路およびカチオン性脂質製剤について測定した。背景光束は、約3.31E+05p/sであった。撮像の結果を表157に示す。表157において、「NT」は、試験されなかったことを示す。未処理マウスは、2時間時点で3.14E+05、8時間時点で3.33E+05、および24時間時点で3.46E+05の平均光束を示した。ピーク発現は、8時間時点で試験された3つの経路すべてにおいて見られた。DLin−KC2−DMAは、DLin−MC3−DMAよりも優れた発現を有し、DODMAは評価された経路すべてにおいて発現を示した。 表157.光束
実施例102.5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジン修飾mRNAの製剤 5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)をPBS(7.4のpH)中で製剤化した。その製剤を筋肉内に(I.M.)または皮下に(S.C.)、2.5mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。
撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。マウスを投薬の5分、30分、60分、および120分後に撮像し、平均全光束(光子/秒)を各投与経路およびカチオン性脂質製剤について測定した。背景光束は、約3.78E+05p/sであった。撮像の結果を表158に示す。ルシフェラーゼの発現は、送達の両経路において30分時点で既に見られた。皮下投与からのピーク発現は、30分から60分の間に出現する。筋肉内発現は、120分時点でも依然として増加していた。 表158.光束
実施例103.化学修飾mRNAの筋肉内および皮下投与 N4−アセチルシチジンで完全に修飾されたか、5−メトキシウリジンで完全に修飾されたか、N4−アセチルシチジンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか、または5−メチルシトシンおよび5−メトキシウリジンで完全に修飾された、PBS(pH7.4)中で製剤化されたルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、筋肉内または皮下に2.5mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。マウスを2時間、8時間、および24時間時点で撮像した。筋肉内投与に対する平均全光束(光子/秒)を表159に示し、皮下投与に対する平均全光束(光子/秒)を表160に示す。バックグラウンドシグナルは、3.84E+05(p/s)であった。筋肉内投与に対するピーク発現は、すべての化学組成において24時間から48時間の間に見られ、発現は120時間時点でも依然として検出された。皮下送達の場合、ピーク発現は2時間から8時間の間に見られ、発現は72時間時点でも検出された。 表159.筋肉内投与
表160.皮下投与
実施例104.インビボ研究 少なくとも1つの化学修飾を含むルシフェラーゼ修飾mRNAをシリンジポンプ法を用いて脂質ナノ粒子(LNP)として製剤化し、粒径、ゼータ電位、およびカプセル封入によって特徴付ける。
表161に概要説明されるように、ルシフェラーゼLNP製剤を筋肉内に(I.M.)、静脈内に(I.V.)、および皮下に(S.C.)、Balb−Cマウスに投与する。対照として、PBS中で製剤化されるルシフェラーゼ修飾RNAを静脈内にマウスに投与する。 表161.ルシフェラーゼ製剤
マウスを2、8、24、48、120、および192時間時点で撮像し、(全マウスの全光束(光子/秒)として測定される)生物発光を判定する。8時間または192時間時点で、肝臓、脾臓、腎臓、ならびに皮下および筋肉内投与の注入部位を撮像し、生物発光を判定する。
実施例105.化学修飾mRNAのカチオン性脂質製剤研究 5−メチルシトシンおよびシュードウリジン(5mC/pU)、シュードウリジン(pU)、またはN1−メチル−シュードウリジン(N1mpU)で完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を表162に記載されるようにカチオン性脂質中で製剤化した。その製剤を静脈内に(I.V.)、筋肉内に(I.M.)、または皮下に(S.C.)、0.05mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。 表162.カチオン性脂質製剤
撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。マウスを投薬の2時間、8時間、および24時間後に撮像し、平均全光束(光子/秒)を各投与経路およびカチオン性脂質製剤について測定した。背景光束は、約4.11E+05p/sであった。撮像の結果を表163に示す。ピーク発現は、8時間時点で試験された3つの経路すべてにおいて見られた。 表163.光束
実施例106.化学修飾mRNAの研究 N4−アセチルシチジン(N4−アセチル)で完全に修飾されたか、5−メトキシウリジン(5meth)で完全に修飾されたか、N4−アセチルシチジンおよびN1−メチル−シュードウリジン(N4−アセチル/N1mpU)で完全に修飾されたか、または5−メチルシトシンおよび5−メトキシウリジン(5mC/5−meth)で完全に修飾された、ルシフェラーゼmRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、表164に記載されるようにDLin−MC3−DMA中で製剤化した。
製剤を静脈内に(I.V.)、筋肉内に(I.M.)、または皮下に(S.C.)0.05mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。 表164.カチオン性脂質製剤
撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。マウスを投薬の2時間、6時間、および24時間後に撮像し、平均全光束(光子/秒)を各投与経路およびカチオン性脂質製剤について測定した。背景光束は、約2.70E+05p/sであった。撮像の結果を表165に示す。 表165.光束
実施例107.複数の修飾mRNAを含有する脂質ナノ粒子 EPO mRNA(mRNA配列は配列番号26171に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)と、G−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)と、第IX因子mRNA(mRNA配列は配列番号26172に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)と、を表166に記載されるようにDLin−MC3−DMA中で製剤化する。製剤を静脈内に(I.V.)、筋肉内に(I.M.)、または皮下に(S.C.)0.05mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与する。1つのmRNAのみを含有する対照LNP製剤も等価用量で投与する。 表166.DLin−MC3−DMA製剤
血清を、製剤を投与した8時間、24時間、72時間、および/または7日後にマウスから採取する。血清をELISAによって分析し、EPO、G−CSF、および第IX因子のタンパク質発現を判定する。
実施例108.5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジン修飾mRNAのカチオン性脂質製剤研究 EPO mRNA(mRNA配列は配列番号26171に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)またはG−CSF mRNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)を、表167に記載されるようにDLin−MC3−DMAおよびDLin−KC2−DMA中で製剤化する。製剤を静脈内に(I.V)、筋肉内に(I.M.)、または皮下に(S.C.)0.05mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与する。 表167.DLin−MC3−DMAおよびDLin−KC2−DMA製剤
血清を、製剤を投与した8時間、24時間、72時間、および/または7日後にマウスから採取する。血清をELISAによって分析し、EPOおよびG−CSFのタンパク質発現を判定する。
実施例109.インビトロVEGF PBMC研究 5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾されたか(VEGF 5mC/pU)、5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾されたか(VEGF 5mC/N1mpU)、または未修飾の(VEGF unmod)、500ngのVEGF mRNA(mRNA配列は配列番号26181に示される約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、Lipofectamine 2000を用いて正常な血液ドナー(D1、D2、およびD3)からの末梢血単核細胞(PBMC)にトランスフェクトした。細胞はまた、対照として各ドナーに対して処理されなかった。上清を、トランスフェクションの22時間後に収集してELISAを行い、タンパク質発現およびサイトカイン誘導を判定した。VEGFの発現およびIFN−α誘導を表168ならびに図8Aおよび8Bに示す。 表168.タンパク質およびサイトカインレベル
実施例110.修飾mRNAのインビトロ発現 HEK293細胞に、EPO修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26171に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)をトランスフェクトし、HeLa細胞に、トランスフォーミング成長因子β(TGF−β)修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26182に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)を順方向トランスフェクトし、ならびにHepG2細胞に、殺菌性/透過性増強タンパク質(rBPI−21)修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26183に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)をトランスフェクトし、それらは、本明細書に記載の手順を使用して、表169、170、および171に示される濃度で、Invitrogen(Carlsbad,CA)のLipofectamine2000を用いて複合体形成していた。タンパク質発現をELISAによって検出し、そのタンパク質(pg/mL)も表169、170、および171に示す。表169において、「>」は、それよりも大きいことを意味する。TGFβの場合、対照の未処理細胞およびLipofectamine2000の偽のトランスフェクションも試験した。 表169.EPOタンパク質発現
表170.TGFβタンパク質発現
表171.rBPI−21タンパク質発現
実施例111.バイシストロン性修飾mRNA ヒト胎児腎臓上皮(HEK293)を96ウェルプレート(Greiner Bio−one GmbH,Frickenhausen,Germany)に播種した、HEK293を100μlの細胞培養培地(2mMのL−グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、および1倍非必須アミノ酸(Biochrom AG,Berlin,Germany)、ならびに1.2mg/mLの重炭酸ナトリウム(Sigma−Aldrich,Munich,Germany)を添加したDMEM、10%FCS)中に30,000の密度で播種した、75ngのバイシストロン性修飾mRNA(mCherry−2A−GFP)(配列番号26184;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)、mCherry修飾mRNA(mRNA配列番号26169;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)、または緑色蛍光タンパク質(GFP)修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26180に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾された)を細胞を播種した後に添加し、インキュベートした。対照の未処理細胞も評価した。mCherry−2A−GFPは、mCherryのコード領域、2Aペプチド、およびGFPのコード領域を含む修飾mRNA配列を指す。
培養培地上清を、96ウェルPro−Bind U底プレート(Beckton Dickinson GmbH,Heidelberg,Germany)に移すことによって収集した。細胞を、半量のトリプシン/EDTA(Biochrom AG,Berlin,Germany)でトリプシン化し、それぞれの上清とともにプールし、1回量のPBS/2%FCS(いずれもBiochrom AG,Berlin,Germany)/0.5%ホルムアルデヒド(Merck,Darmstadt,Germany)を添加することによって固定した。次いで、試料を、LSRIIサイトメーター(Beckton Dickinson GmbH,Heidelberg,Germany)において、532nmの励起レーザーおよびPE−Texas Red用の610/20フィルターを用いてフローサイトメーター測定にかけた。全事象の平均蛍光強度(MFI)を表172に示す。バイシストロン性修飾mRNAをトランスフェクトした細胞は、mCherryおよびGFPの両方を発現することが可能であった。 表172.修飾mRNAのMFI
実施例112.抗体を産生するための5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジン修飾mRNAのカチオン性脂質製剤研究 ハーセプチン重鎖(HC)mRNA(mRNA配列は配列番号26185に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)ならびにハーセプチン軽鎖(LC)修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26186に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1;5−メチルシトシンおよびN1−メチル−シュードウリジンで完全に修飾された)を、表173に記載されるようにDLin−MC3−DMAおよびDLin−KC2−DMA中で製剤化する。製剤を静脈内に(I.V)0.500、0.050、および0.005mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与する。 表173.DLin−MC3−DMAおよびDLin−KC2−DMA製剤
血清を、製剤を投与した8時間、24時間、72時間、および/または7日間後にマウスから採取した。血清をELISAによって分析し、ハーセプチンのタンパク質発現を判定した。
実施例113.シュードウリジンおよびN1−メチル−シュードウリジンの対象のSAR ピリミジンヌクレオシドシュードウリジンへの最近の注目に伴い、一連の構造活性研究は、シュードウリジンまたはN1−メチル−シュードウリジン(pseudourdine)への修飾を含むmRNAを研究するように設計された。
本研究は、N1位、C6位、2−位、4−位において、およびリン酸骨格上で修飾が行われる場合の、鎖長の効果、増加した親油性、環構造の存在、および疎水性または親水性相互作用の変化を調査するために設計された。安定性も研究する。
この目的のため、アルキル化、シクロアルキル化、アルキル−シクロアルキル化、アリール化、アルキル−アリール化、アミノ基を有するアルキル化部分、カルボン酸基を有するアルキル化部分、ならびにアミノ酸荷電部分を含むアルキル化部分、を含む修飾を研究する。アルキル化の程度は、概して、C1〜C6である。化学修飾の例には、表174および表175に示されるものが挙げられる。 表174.シュードウリジンおよびN1−メチルシュードウリジンSAR
表175.シュードウリジンおよびN1−メチル−シュードウリジンSAR
実施例114.天然および非天然ヌクレオシドの組み込み 天然および非天然ヌクレオシドを、目的とするポリペプチドをコードするmRNA内に組み込む。これらの例を表176および177に示す。ある特定の市販のヌクレオシドトリホスフェート(NTP)を本発明のポリヌクレオチド中で研究する。これらの選択肢を表176に示す。次いで、結果として得られるmRNAを、タンパク質を産生する、サイトカインを誘導する、および/または治療的成果を生じるその能力について検査する。 表176.天然および非天然ヌクレオシド
表177.非天然ヌクレオシドトリホスフェート
実施例115.核酸塩基および炭水化物(糖)に対する修飾の組み込み 天然および非天然ヌクレオシドを、目的とするポリペプチドをコードするmRNA内に組み込む。核酸塩基および炭水化物(糖)の両方に対する修飾を有する市販のヌクレオシドおよびNTPを、mRNA内に組み込まれ、タンパク質を産生し、サイトカインを誘導し、かつ/または治療的成果を生み出すその能力について検査する。これらのヌクレオシドの例を表178および179に示す。 表178.組み合わせ修飾
表179.天然に生じる組み合わせ
本表内において、「UTP」はウリジントリホスフェートの略であり、「GTP」はグアノシントリホスフェートの略であり、「ATP」はアデノシントリホスフェートの略であり、「CTP」はシトシントリホスフェートの略であり、「TP」はトリホスフェートの略であり、「Bz」はベンジルの略である。
実施例116.HeLa細胞における血管内皮成長因子のタンパク質産生 トランスフェクションの前日に、20,000個のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を5%のCO2雰囲気下で一晩、37℃で成長させた。翌日、表180に記載の化学修飾を有する250ngの血管内皮成長因子(VEGF)修飾RNA(mRNA配列は配列番号26181に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、lipofectamine 2000の0.2μLを10μLの最終体積のOPTI−MEM中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を混合し、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加し、室温でインキュベートした。また上述の手順に従って、VEGF mRNAで第2の組のHeLa細胞も評価した。第1の組のHeLa細胞に対して、対照の未処理細胞およびlipofecatamine 2000でのみ処理された細胞も分析した。
18〜22時間のインキュベーションの後、VEGFを発現する細胞の細胞培養上清を採取し、2分間10.000rcfで遠心分離した。次いで、製造業者の指示に従ってVEGF特異的ELISAキット(R&D Systems,Minneapolis,MN)を用いて、澄んだ上清を分析した。全試料を、判定された値がELISA標準曲線の線形範囲内に入るまで希釈した。産生されたタンパク質の量を表180に示す。
これらの結果は、1−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたVEGFが、他の化学組成と比較してHeLa細胞内でより多くのタンパク質を産生したことを実証する。 表180.タンパク質産生
実施例117.HeLa細胞における化学修飾血管内皮成長因子のタンパク質産生の比較 トランスフェクションの前日に、20,000個のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を5%のCO2雰囲気下で一晩、37℃で成長させた。翌日、表181に記載の化学修飾を有する250ngの血管内皮成長因子(VEGF)修飾RNA(mRNA配列は配列番号26181に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、lipofectamine 2000の0.2μLを10μLの最終体積のOPTI−MEM中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を混合し、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加し、室温でインキュベートした。対照の未処理細胞も分析した。
18〜22時間のインキュベーションの後、VEGFを発現する細胞の細胞培養上清を採取し、2分間10.000rcfで遠心分離した。次いで、製造業者の指示に従ってVEGF特異的ELISAキット(R&D Systems,Minneapolis,MN)を用いて、澄んだ上清を分析した。全試料を、判定された値がELISA標準曲線の線形範囲内に入るまで希釈した。産生されたタンパク質の量を表181および図9に示す。
この結果は、1−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたVEGFが、他の化学組成と比較してHeLa細胞内でより多くのタンパク質を産生したことを実証する。 表181.タンパク質産生
実施例118.哺乳動物における血管内皮成長因子タンパク質の産生 リポプレックス形成した血管内皮成長因子(VEGF)mRNA(mRNA配列は配列番号26181に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、修飾しなかったか、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾たか(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルシュードウリジンで完全に修飾したか(5mC/1mpU)、5−メチルシトシンで置換されたシトシンで25%および2−チオウリジンで置換されたウリジンで25%修飾したか(5mC/s2U)、1−メチルシュードウリジンで完全に修飾したか(1mpU)、またはシュードウリジン(pU)で完全に修飾した。その製剤を、静脈内に1マウス当たり2μgのmRNAの用量でマウスに投与した。対照として、マウスの1群を未処理とした。マウスからの血清を、投与の3時間後にVEGFタンパク質発現について特異的VEGF ELISAによって測定する。その結果を表182および図10に示す。 表182.タンパク質産生
実施例119.HeLa細胞内の顆粒球コロニー刺激因子のタンパク質産生 トランスフェクションの前日に、20,000個のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、96ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのEMEM培地(10%FCSおよび1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を5%のCO2雰囲気下で一晩、37℃で成長させた。翌日、表183に記載の化学修飾を有する250ngの顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)修飾RNA(mRNA配列は配列番号26168に示される;約160ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、10μLの最終体積のOPTI−MEM(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、lipofectamine 2000の0.2μLを10μLの最終体積のOPTI−MEM中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を混合し、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加し、室温でインキュベートした。対照の未処理細胞およびlipofecatamine 2000でのみ処理された細胞も分析した。
18〜22時間のインキュベーションの後、G−CSFを発現する細胞の細胞培養上清を採取し、2分間10.000rcfで遠心分離した。次いで、製造業者の指示に従ってG−CSF特異的ELISAキット(R&D Systems,Minneapolis,MN)を用いて、澄んだ上清を分析した。全試料を、判定された値がELISA標準曲線の線形範囲内に入るまで希釈した。産生されたタンパク質の量を表183および図11に示す。 表183.タンパク質産生
実施例120.HeLa細胞上清における化学修飾第IX因子のタンパク質産生 トランスフェクションの前日に、15,000個のHeLa細胞(ATCC番号CCL−2;Manassas,VA)を、トリプシン−エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)での処理によって収集し、24ウェル細胞培養プレート(Corning,Manassas,VA)においてウェル毎に総体積100μLのイーグル最小必須培地(EMEM)(10%ウシ胎仔血清(FCS)および1倍Glutamaxを補充)に播種した。細胞を5%のCO2雰囲気下で一晩、37℃で成長させた。翌日、5−メチルシトシンおよびシュードウリジンで完全に修飾させたか(5mC/pU)、5−メチルシトシンおよび1−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたか(5mC/1mpU)、5−メチルシトシンで置換されたシトシンで25%および2−チオウリジンで置換されたウリジンで25%修飾されたか(s2U/5mC)、1−メチルシュードウリジンで完全に修飾さたか(1mpU)、またはシュードウリジンで完全に修飾された(pU)、250ngの第IX因子修飾RNA(mRNA配列は配列番号26172に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、10μLの最終体積のOPTI−MEM(登録商標)(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中に希釈した。Lipofectamine 2000(LifeTechnologies,Grand Island,NY)をトランスフェクション試薬として使用し、lipofectamine 2000の0.2μLを10μLの最終体積のOPTI−MEM(登録商標)中に希釈した。室温で5分間のインキュベーションの後、両方の溶液を混合し、室温でさらに15分間インキュベートした。次いで、20μLの合わせた溶液を、HeLa細胞を含有する100μLの細胞培養培地に添加し、室温でインキュベートした。未処理の対照も分析した。
18時間のインキュベーションの後、Pierce Biotechnology(Thermo Scientific,Rockford,IL)の免疫沈殿(IP)緩衝液で溶解した細胞によって、第IX因子を発現する細胞の細胞培養上清を採取し、2分間10.000rcfで遠心分離した。澄んだ上清を1:2(1mLのライセート/2ウェル/24ウェルプレート)または1:5(1mLのライセート/5ウェル/24ウェルプレート)に希釈し、次いで、製造業者の指示に従って第IX因子特異的ELISAキットを用いて分析した。全試料を、判定された値がELISA標準曲線の線形範囲内に入るまで希釈した。両方の研究において産生されたタンパク質の量を表184および図12に示す。 表184.タンパク質産生
実施例121.カチオン性脂質ナノ粒子中で製剤化された1−メチルシュードウリジンまたは5−メチルシトシンおよび1−メチルシュードウリジン修飾ルシフェラーゼmRNAの鼻腔内投与による肺送達 1−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたか(Luc−G5−LNP−KC2)、または1−メチルシュードウリジンおよび5−メチルシトシンで完全に修飾された(Luc−G2−LNP−KC2)、ルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、表185に記載されるようにカチオン性脂質ナノ粒子(LNP−KC2)中で製剤化した。 表185.製剤
製剤を鼻腔内に(I.N.)0.3mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。マウスを投薬の2時間、8時間、48、および72時間後に撮像し、平均全光束(光子/秒)を測定した。背景光束は、約6.3+05p/sであった。Luc−G5−LNP−KC2またはLuc−G5−LNP−KC2対ビヒクルの撮像の結果を表186に示し、「NT」は、試験されなかったことを意味する。 表186.鼻腔内投薬後のルシフェラーゼ発現
実施例122.Lipofectamine 2000中でリポプレックス形成した1−メチルシュードウリジンまたは5−メチルシトシンおよび1−メチルシュードウリジン修飾ルシフェラーゼmRNAの鼻腔内投与による肺送達 1−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたか(Luc−G5−リポプレックス)、または1−メチルシュードウリジンおよび5−メチルシトシンで完全に修飾された(Luc−G2−リポプレックス)、ルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、第1のステップが、1−メチルシュードウリジンまたは1−メチルシュードウリジンおよび5−メチルシトシン修飾ルシフェラーゼmRNAを3mg/mLから16.6μLに108.5μLのDMEM中への希釈することであり、第2のステップが、100μLのLF2000を25μLのDMEM中に希釈し、次いで両方を共に静かに混合して、合計250μLのミキサーを作製することであった、2ステップにおいてリポプレックス形成し、それは注入の前に脂質−mRNA複合体を形成するように室温で5〜10分インキュベートされた。1−メチルシュードウリジンまたは1−メチルシュードウリジンおよび5−メチルシトシンで完全に修飾された両方のルシフェラーゼmRNAからのリポプレックスを、鼻腔内に(I.N.)0.5mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。
撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。マウスを投薬の2時間、8時間、および24時間後に撮像し、平均全光束(光子/秒)を測定した。バックグラウンドシグナルは、約4.8+05p/sであった。背景光束は、約6.3+05p/sであった。Luc−G5−リポプレックスまたはLuc−G2−リポプレックス対ビヒクルの撮像の結果を表187に示す。 表187.鼻腔内投薬後のルシフェラーゼ発現
実施例123.PBS中で製剤化された1−メチルシュードウリジンまたは5−メチルシトシンおよび1−メチルシュードウリジン修飾ルシフェラーゼmRNAの鼻腔内投与による肺送達 PBS(pH7.4)中で製剤化された、1−メチルシュードウリジンで完全に修飾されたか(Luc−G5−緩衝液(PBS))、または1−メチルシュードウリジンおよび5−メチルシトシンで完全に修飾された(Luc−G2−緩衝液(PBS))、ルシフェラーゼ修飾mRNA(mRNA配列は配列番号26178に示される;約140ヌクレオチドのポリA尾部は配列内に示されない;5’キャップ、キャップ1)を、鼻腔内に(I.N.)7.5mg/kgの用量でBalb−Cマウスに投与した。
撮像の20分前に、マウスにD−ルシフェリン溶液を150mg/kgで腹腔内注入した。次いで、動物に麻酔をかけ、IVIS Lumina II撮像システム(Perkin Elmer)を用いて画像を取得した。生物発光を、全マウスの全光束(光子/秒)として測定した。マウスを投薬の2時間、8時間、および24時間後に撮像し、平均全光束(光子/秒)を測定した。背景光束は、約4.8+05p/sであった。背景光束は、約6.3+05p/sであった。緩衝液中のLuc−G5対ビヒクルの撮像の結果を表188に示す。 表188.鼻腔内投薬後のルシフェラーゼ発現
使用した単語は、限定ではなく説明のための単語であり、その広範な態様において本発明の真の範囲と精神から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更が行われ得ることが理解される。
本発明は、いくつかの記載の実施形態に関してある程度詳しく具体的に記載されたが、これが任意のそのような詳細もしくは実施形態、または任意の特定の実施形態に限定されるべきであるようには意図されず、先行技術を考慮してそのような特許請求の範囲の可能な限り広範な解釈を提供し、それにより本発明の意図される範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。
本明細書に言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が優先されるものとする。加えて、節の見出し、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定するようには意図されない。
